Przedmiotem wynalazku jest srodek do wiaza¬ nia wirusa zapalenia watroby, który stosuje sie w celu usuniecia wirusa z materialu biologiczne¬ go lub zatezenia go w celach diagnostycznych.Wirus zapalenia watroby typu B, znany takze jako wirus wszczepiennego zapalenia watroby, (roz¬ przestrzenia sie poprzez substancje biologiczne, takie jak krew, osocze, surowica, mocz i stolec.Moze on byc wiec rozprzestrzeniany poprzez frak¬ cje osocza, uzywane do celów leczniczych. Moze on takze byc obecny w wodzie scieków kanaliza¬ cyjnych i w innych rodzajach scieków, zawiera¬ jacych substancje biologiczne.Wirus zapalenia watroby typu B moze byc wy¬ krywany metodami immunologicznymi, dostosowa¬ nymi do budowy antygenu otoczkowego HBgAg, zwanego takze antygenem Australia /antygen Au/.Dotychczas stosowane sa nastepujace sposoby wykrywania antygenu Au: sposób z uzyciem ra- dioimmunologicznego zestawu Ausria II 125 Abbott Laboratories, Stany Zjednoczone Ameryki, sposób oparty na zjawisku odwrotnym do hemaglutyina- cji, z uzyciem zestawu Hepainosticon, Organon, OSS, Holandia, siposób oparty na zjawisku immu- nodyfuzji, ID, Berg i inni, Vox Sang., tom 2-2 i/19.7(2/, str. 1 i sposób oparty na zjawisku immu- noelefetroosmoforazy, IEOP, Hanssoin i Johnson, Vox Saig., tom 21 /li97ity, str. 5(31.Sposród testów, stosowanych do badania próbek krwi, najwyzsza czulosc wykazuje test Ausria. Je- go dokladnosc mozna zwiekszyc przez wykonanie innymi sposobami testów dodatkowych.Wykorzystujac w praktyce szpitalnej tylko tych dawców krwi, którzy wedlug najczulszych metod badania nie przebyli wirusowego zapalenia watro¬ by, mozna znacznie zmniejszyc ryzyko rozprzestrze¬ niania sie tej choroby. Przy takim postepowaniu znaczna ilosc dostepnej krwi pozostaje nie wyko¬ rzystana. Przemyslowy rozdzial plazmy na frakcje z selektywnym usuwaniem wirusa zapalenia wa¬ troby, przy uzyciu odpowiednich do tego celu sub¬ stancji, zwieksza podaz do szpitali surowicy krwi, plazmy oraz jej frakcji.Chociaz czulosc bada przez wprowadzenie techniki radioimmunologicz- nej, niebezpieczenstwo niewykrycia wirusa nadal istnieje. Zatezenie wirusa zapalenia watroby przy uzyciu srodka wedlug wynalazku znacznie zmniej¬ sza to niebezpieczenstwo.Na zjezdzie American Chemical Society w sierp¬ niu 1972 w Nowym Jorku, S. E. Charm i B. L.Wong przedstawili sposób usuwania wirusa zapa¬ lenia watroby z plazmy krwi z zastosowaniem przeciwcial tego wirusa, wyizolowanych z krwi kozy. Badania zostaly opublikowane w Biotech.Bioeng., tom 16 /197(4/, str. 593. Mozliwosci stoso¬ wania sposobu sa ograniczone iloscia dostepnych przeciwcial. Sposób ten niesie ponadto ryzyko prze¬ nikniecia materialu immunogenicznego z nosicie- 105 363 %105 363 la przeciwcial do frakcji osocza ludzkiego, które maja byc stosowane w szpitalnictwie.Srodek wedlug wynalazku nie ma wad znanych dotychczas technik, a zawarte w nim materialy sa latwe do otrzymania w skali technicznej, ogól¬ nie znanymi metodami syntezy, przy czym nie za¬ wieraja one materialu irnmunogenicznego, ich po¬ winowactwo do wirusa zapalenia watroby jest wy¬ sokie i wybiórcze, a reakcja miedzy nimi a wiru¬ sem szybka i nieodwracalna. Po zwiazaniu wirusa ze srodkiem wedlug wynalazku niebezpieczenstwo przecieku zakazonego materialu przestaje istniec.Srodek do wiazania wirusa zapalenia watroby zawiera przepuszczalny dla wody material matry- 7cy~rRóry stanowi lnierozpuszczalny w wodzie zel iwysókóczasteczkowfego weglowodanu lub tworzy- twa sztucznego, ewentualnie czlon oddzielajacy i 'sprz&zftwy %ia^powierzchni hydrofobowy ligand w postaci 'eweffaiaffiii podstawionego lancucha we¬ glowego o wiecej niz 7 atomach wegla lub skon¬ densowanego ukladu pierscieniowego.Substancje czynna srodka otrzymuje sie wiec przez sprzezenie odpowiedniego ligandu z zeluja¬ cym materialem matrycy.Sposród badanych wiazan kowalencyjnych /czlo¬ nów oddzielajacych/ równowazne i z punktu widze¬ nia wlasciwosci srodka scisle podporzadkowane strukturze ligandu okazaly sie nastepujace: _0—C/=NH/—NH—, —O—C—/=NE/-NH—NH, —NH—/CH2/2_,r-NH—, ^C—O—NH— i —NH— —GO—.Rodzaj materialu przepuszczalnej dla wody ma¬ trycy, tj. poliamidu, takiego jak poliakrylamid lub weglowodanu, takiego jak celuloza lub agaroza, ewentualnie poprzecznie usieciowanych przez dwu- epoksyd, dwualdehyd glutarowy, dwuwinylosulfon, dwubromopropanol lub epichlorohydryne ma mniejsze znaczenie niz typ ligandu.W wysokim stopniu decydujacym powinowac¬ twie do wirusa zapalenia watroby jest hydrofo¬ bowy charakter ligandu, co ilustruje tablica, pod¬ sumowujaca wyniki badan nad usuwaniem wiru¬ sa z plazmy krwi ludzkiej. Powinowactwo srod¬ ka do wirusa badano wyzej podanymi metodami immunologicznymi. Symbol „—" oznacza silne i calkowite zwiazanie wirusa ze srodkiem, wyraza¬ jace sie niewykrywaniem go w plazmie po po¬ traktowaniu jej srodkiem. Symbol „+" oznacza pozostanie w plazmie nieznacznych ilosci antygenu Au, a symbol „++" oznacza niezmieniona lub nieznacznie zmieniona ilosc antygenu Au w plaz¬ mie po potraktowaniu jej srodkiem.Dane ujete w tablicy odnosza sie do wyników, uzyskanych przy uzyciu tej samej matrycy i zmiennym jedynie ligandzie, chyba ze zaznaczono jaka matryca zostala uzyta. grodek wedlug wynala2fcu jest ilustrowany po¬ nizszymi (przykladami: Przyklad I. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepha- rose/yetylenodwuamma — kwas oktyloburszty- nowy/.Sporzadzanie zelu.Aktywacje zelu Sepharose przeprowadza sie, sta¬ rannie przemywajac woda 100 ml produktu Sepha- Tablica Wiazanie wirusa zapalenia watroby z wysoce Au — dodatniej plazmy krwi ludzkiej 40 45 50 55 65 Ligand /lancuch weglowodorowy i ewentualnie czlon oddzielajacy/ i Matryca — agaroza Sepharose 4B /Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,, Szwecja/ — heksyloamoa — glicylo-norleucyna — glicylo-DL-fenyloalanina — cyklopentyloamina — cykloheptyloamina — fenyloetyloamina — heksameitylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas benzoeso¬ wy — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas heksano- karboksylowy — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas burszty¬ nowy — heksametylenodwuamina ,/czlon oddzielajacy/ — kwas ftalowy — oktyloamina — decyloamina — dodecyloamina | — oktadecyloamina 1 — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas oktylo- bursztynowy — cysteamina /czlon oddzielaja¬ cy/ — kwas oktylobursztynowy /iprzyklad XI/ — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas naftylo- oetowy /przyklad XII/ — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — wodorobur- sztynian cholesterolu /przyklad XIII/ — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas cholowy /przyklad XIV/ Matryca — agaroza /Sepharose 4B/ w rózny sposób poprzecznie usie- ciowana — etylenodwuamina /czlon od¬ dzielajacy/ — kwas oktylobur¬ sztynowy /przyklad 1/ ^- butylenodwuamina /czlon od¬ dzielajacy/ — kwas oktylobur¬ sztynowy /przyklad 1/ — heksametynenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas oktylo¬ bursztynowy /przyklad fy — heksametylenodwuamina /czlon oddzielajacy/ — kwas dodecy- lobursztynowy /przyklad 11/ 1 — kaprylohydrazyd /przyklad III/ — tetradecyloamina /przyklad VI/ Antygen Au w plazmie po zabiegu 1 ^ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + — i — — — — — — — «=— — — — — — |5 c.d. tablicy 1 — 2-aminododekan /przyklad VII/ — etylenodwuamina /czlon od¬ dzielajacy/ — kwas deoeno-O- -karboksylowy-1 /przyiklad VIIfy Matryca — poliakrylamid /bio-Rad, Richmond, Kalifornia, Stany Zjed¬ noczone Aimeryikij/ — propylen /czlon oddzielajacy/ — decyloamina ,/przyklad X/ 2 1 — rose 4B /Pharmacia Fins Chemicals, Uppsala, Szwecja/. Nadmiar cieczy odsacza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, a zel przenosi do roztworu 4 g bromku cyjanu w 100 ml wody. Zel równowazy sie w ciagu 15 minut, przy mieszaniu i chlodze¬ niu lodem a nastepnie aktywuje w ciagu 6—7 minut przy wartosci pH=ll. Wartosc pH utrzy¬ muje sie na stalym poziomie, dodajac 4 N roztwo¬ ru wodorotlenku sodu.W celu sprzezenia z etylenodwuamina, aktywo¬ wany zel przemywa sie na szklanym saczku zim¬ nym 0,5 M roztworem wodoroweglanu sodu i obo¬ jetnego weglanu sodu o wartosci pH=9,8, a na¬ stepnie przenosi do roztworu 10 g etylenodwuami- ny w 100 ml destylowanej wody, doprowadzonego stezonym kwasem solnym do wartosci pH=9,8.Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 20 godzin w temperaturze pokojowej, a otrzymany zel prze¬ mywa sie dokladnie. ml zelu z naniesionym czlonem oddzielaja¬ cym zawiesza sie w 20 ml dioksanu. Mieszajac w temperaturze pokojowej wkrapla sie do zawie¬ siny swiezy roztwór 6 g bezwodnika kwasu okty- lobursztynowego w 60 ml dioksanu. Wartosc pH utrzymuje sie w zakresie 7,5—8 dodatkiem roz¬ cienczonego roztworu wodorotlenku sodu. Adsor¬ bent dokladnie przemywa sie kolejno dioksanem, mieszanina 2:1 dioksanu z woda, 1 M roztworem chlorku sodu i buforem o skladzie 0,05 M TRIS, 0,02 M cytrynianu sodu i 0,10 M chlorku sodu o wartosci pH=7,5. Bufor ten przyjmuje sie za bufor testowy. Wydajnosc sprzegania w odniesie¬ niu do kwasu oktylobursztynowego, okreslona ma¬ gnetycznym rezonansem protonowym /100 MHzi/, wynosi 4,8°/o.Etylenodwuamine mozna zastapic 1,4-dwuamino- butanem lub l,6Hdwuaminoheksanem, uzyskujac równowazne wyniki.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:64 wedlug IEOP i 1:32 wedlug ID. Miano odnosi sie do standardu antygenu.Do kazdej z 6 probówek testowych dodaje sie po 2 ml plazmy z antygenem Au i po 2 ml za¬ wiesiny 3 czesci zawiesiny adsorbentu, dokladnie zrównowazonej z buforem testowym i 1 czesci te¬ go samego buforu. Próbki wstrzasa sie odpowied¬ nio w ciagu 1, 2, 5, 10, 20 i 30 minut, a nastepnie odwirowuje zel. Supematanty, badane na obec¬ nosc antygenu Au sposobami ID, IEOP i Hepano- sticon, daja odczyn ujemny.Przyklad II. Usuwanie antygenu Au z plaz- 363 6 my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepha- rose/ /hetaametylenodwuamina — kwas dodecylo- bursztynowy/.Sporzadzanie zelu.W celu poprzecznego usieciowania Sepharose, 100 ml zelu miesza sie z 2 ml epichlorohydryny i 0,5 g borowodorku sodu. Calosc intensywnie miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze 80°C. Zel dokladnie przemywa sie ciepla woda i miesza z roztworem 0,25 g borowodorku sodu w 50 ml 2 M wodorotlenku sodu. Mieszanine ogrze¬ wa sie 1 godzine w autoklawie w temperaturze 120°C, a nastepnie przemywa sie zel zasadowym roztworem borowodorku sodu. Z kolei powolnym dodawaniem kwasu doprowadza sie wartosc pH mieszaniny do 4 i przemywa zel duza iloscia wody.Osadzenie szesciometylenodwuaminy dokonuje sie w sposób, opisany w przykladzie I. » ml zelu z osadizonym 'na nim czlonem od- 2§ dzielajacym przenosi sie na saczek szklany, prze¬ mywa mieszanina 2:1 dioksanu z woda, suszy przez saczenie pod zmniejszonym cisnieniem i prze¬ nosi do swiezego roztworu 1 g kwasu do decylo- bursztynowego i 1,5 g rozpuszczalnego w wodzie karbodwuimidu, p-tóluenosulfonianu N-cyklohek- sylo-N^^-metylomwfoIinoetyloi/lkartKKiwuimidu w 60 ml mieszaniny 2:1 dioksanu z woda. Calosc miesza sie w ciagu godziny w temperaturze po¬ kojowej, a nastepnie przenosi na szklany saczek IS i dokladnie przemywa kolejno dioksanem, miesza¬ nina 2:1' dioksanu z woda, 1 M roztworem chlorku sodu, woda i buforem testowym.Wydajnosc sprzegania w odniesieniu do zastoso¬ wanych kwasów tluszczowych, okreslona magme- tycznym rezonansem protonowym /100 MHz/, wy¬ nosi 2,0%.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au 1 mianie 1:128 4# wedlug ID i IEOP. Kolumne /d=l,6 h—1,0 cm/ wypelnia sie pochodna zelu, zrównowazona z bu¬ forem testowym. Przez zel przepompowuje sie 7 ml plazmy z szybkoscia 5 ml/godz. Nastepnie przez "kolumne przepompowuje sie bufor testowy 45 do wyplukania, calosci materialu bialkowego, co okresla sie za pomoca spektrometrii w nadfiole¬ cie. Eluat ma odczyn ujemny na antygen Au, we* dlug ID, IEOP i Hepanosticon. Równiez po dzie¬ sieciokrotnym zatezeniu dializa cisnieniowa eluat M pozostaje ujemny w próbie na wirusa zapalenia watroby.Przyklad III. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepha- rose/^kapryiohydrazyd. 55 Sporzadzenie zelu.Na drodze hydrazynolizy przeprowadza sie ka- prylan etylu w odpowiedni hydrazyd. W tym celu ml estru etylowego miesza sie z 10 ml IH^/o wodzianu hydrazyny. Jako rozpuszczalnik dodaje •o sie etanol do wyklarowania mieszaniny reakcyj¬ nej, po czym pozostawia roztwór na okres 15 go¬ dzin w temperaturze pokojowej. Wykrystalizowa¬ ny hydrazyd odsacza sie, przemywa woda z lodem i mieszanina metanolu z woda /1:L/ o temperatu- 55 rze pokojowej.105 363 Sepharose 4B aktywuje sie, jak w przykladzie I.Zel przemywa sie roztworem czynnika sprzega¬ jacego i przesacza pod zmniejszonym cisnieniem.Sprzeganie wykonuje sie przez przeniesienie akty¬ wowanego zelu do 100 ml nasyconego roztworu kaprylohydrazydu w dwumetyloformamidzie /DMF/ i 0,2 M weglanie sodu /1:1/. W czasie reakcji sprzegania wartosc pH pozostaje niezmieniona.Reakcje prowadzi sie mieszajac calosc w ciagu 15 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany pro¬ dukt dokladnie przemywa sie DMF, mieszanina DMF-woda /l:lj/, 1 M chlorkiem sodu, woda i bu¬ forem testowym.Wydajnosc sprzegania w odniesieniu do hydra¬ zydu, okreslona magnetycznym rezonansem pro¬ tonowym /lOOMHg/ wynosi 2,2%.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:128 wedlug ID i IEOP. Do 2 ml zawiesiny, skladaja¬ cej sie z 3 czesci dokladnie sedymentowanego ad- sorfoenta, równowazonego buforem testowym i 1 czesci tego samego buforu, dodaje sie 2 ml plazmy o dodatnim odczynie na antygen Au. Mieszanine lagodnie miesza sie w ciagu 30 minut, po czym odwirowuje zel. Supernatant ma odczyn ujemny na antygen Au, wedlug ID, IEOP i Hepanosti- con.Przyklad IV. Usuwanie antygenu Au z roz¬ tworu albuminy przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepharose/ — etylenodwuamina — kwas oktylobursztynowy/.Sporzadzanie zelu.Zel sporzadza sie, jak w przykladzie I.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie roztwór albuminy o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:64 wedlug ID i IEOP, otrzymany przez frakcjonowanie plazmy o dodatnim odczynie na antygen Au. Adsorpcje przeprowadza sie na partiach materialu, wedlug przykladu III. Super¬ natant ma odczyny ujemny na antygen Au, we¬ dlug ID, IEOP i Hepanosticon.Przyklad V. Usuwanie antygenu Au z kon¬ centratu czynnika koagulujacego, przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sep,harose/-/etylenodwu- amina — kwas oktylobursztynowyi/.Sporzadzanie zelu.Zel sporzadza sie, jak w przykladzie I.Próba z antygenem Au.Stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na an¬ tygen Au, frakcjonujac koncentrat czynników ko- agulujacycn II, VII, IX i X. Sporzadza sie 1%. roztwór bialka i mianie antygenu Au 1:32 wedlug ID. Na saczek szklany ze zlozem 5 ml zelu zrów¬ nowazonego z buforem testowym dodaje sie 10 ml testowego roztworu bialka i przemywa zel bufo¬ rem testowym w ilosci 3X5 mi. Eluaty maja od¬ czyn ujemny na antygen Au wedlug ID, IEÓP i Hepanosticon.Przyklad VI. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sep- harosey-tetradecyloamina.Sporzadzanie zelu.Sepharose aktywuje sie wedlug przykladu I.Dla przeprowadzenia reakcji sprzegania, 100 ml Sepharose, aktywowanej bromkiem cyjanu, rów¬ nowaznej 9,5% etanolem i wysuszonej przez sacze¬ nie pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje sie do ,5 roztworu 22 g tetradecyloaminy w 100 ml 95% etanolu. Calosc miesza sie w ciagu 48 godzin w temperaturze pokojowej. Zel przemywa sie kolej¬ no 96%'etanolem, mieszanina 1:1 etanolu z woda, 1 M chlorkiem sodu, woda i buforem testowym. . 10 Wydajnosc sprzegania, okreslona magnetycznym rezonansem protonowym wynosi 4,3%.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:128 u wedlug ID i IEOP. Na saczek szklany ze zlozem ml zelu zrównowazonego buforem wprowadza sie 35 ml Jplazmy. Material przemywa sie bufo¬ rem testowym w ilosci" 3X10 ml, a eluaty bada na obecnosc antygenu Au. Odczyn wszystkich eluatów jest ujemny wedlug ID, IEOP, Hepanosticon i Ausria.Przyklad VII. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepha- rose/-2-aminododekan. j5 Sporzadzanie zelu.Na dodekanon-2 dziala sie hydroksyloamina, o- trzymujac odpowiedni oksym, który katalitycznie uwodornia sie z eliminacja wody, otrzymujac od¬ powiednia amine. Sepharose przygotowuje sie w sposób, opisany w (przykladzie I.W celu przeprowadzenia reakcji sprzegania, 100 ml zelu aktywowanego bromkiem cyjanu przemy¬ wa sie 95% etanolem, suszy przez saczenie pod zmniejszonym cisnieniem i dodaje do roztworu w 10 g 2-aminododekanu w 100 ml 95% etanolu.Calosc miesza sie w ciagu 48 godzin w tempe¬ raturze pokojowej, dokladnie przemywa zel cieplym 95% etanolem, mieszanina 1:1 etanolu z woda, 1 M roztworem chlorku sodu, woda i buforem testo¬ wo wym.Wydajnosc sprzegania, okreslona magnetycznym rezonansem protonowym, wynosi 1,0%.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o 45 dodatnim odczynie na antygen Au d mianie 1:128 wedlug ID i IEOP. Próbe przeprowadza sie spo¬ sobem, opisanym w przykladzie III. Supernatant daje odczyn ujemny w próbie "wedlug ID, IEOP i Hepanosticon. 50 Przyklad VIII. Usuwanie antygenu Au z plazmy przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Se- pharose/-/etylenodwuamina-ikwas deceno-9-karbo- ksylowy-1.Sporzadzanie zelu. 55 Sepharose, sprzezona z etylenodwuamina spo¬ rzadza sie wedlug przykladu I. Do swiezego roz¬ tworu 1,85 g kwasu decylenokarboksylowego i*2 g dwucykloheksylokarbodwuimidu w 100 ml dioksa¬ nu dodaje sie 100 ml konjugatu Sepharose-etyle- 60 nodwuamina, a nastepnie przeprowadza sie równo¬ wazenie dioksanem i saczenie pod zmniejszonym cisnieniem. Zawiesine zelu miesza sie w ciagu 15 godzin w temperatuTze pokojowej, przemywa diok¬ sanem, mieszanina l:h dioksanu z woda, 1 M roz- 65 tworem chlorku sodu i buforem testowym. \105 363 9 10 Wydajnosc sprzegania w odniesieniu do ikwasów tluszczowych, oznaczona magnetycznym .rezonan¬ sem protonowym /100 MHz/, wynosi 2,3f/«.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o odczynie dodatnim w stosunku do antygenu Au i mianie 1:128 wedlug ID i IEOP. Próbe przepro¬ wadza sie wedlug przykladu III. Supernatant ma odczyn ujemny -w stosunku do antygenu Au, we¬ dlug ID, IEOP i Hepanosticon.Przyklad IX. Usuwanie antygenu Au z koncentratu plazminogenu przez adsorpcje na kon¬ jugacie agaroza i/Sepharose/^kaprylohydrazyd.Sporzadzanie zelu.Konjugat zelu sporzadza sie wedlug przykladu III.Próba z antygenem Au.Do 2 ml roztworu plazminogenu dodaje sie 0,5 ml wysoce Au-dodatniej plazmy; mieszanina jest wysoce Au-dodatnia wedlug TD i Ausria. Przepusz- sza sie ja przez 4 cm kolumne, wypelniona 10 ml konjugatu zelu, zrównowazonego testowym bufo¬ rem. Frakcje zbiera sie i poddaje badaniu. Eluat, zawierajacy plazminogen, jest Au-ujemny przy ba¬ daniach wedlug ID i Ausria.Przyklad X. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie poliakrylamid- -/propylen-decyloakiina/.Sporzadzanie zelu^ Poliakrylamid, Biógel P 300 ,/Bio-rad, Richmond, Kalifornia, Stany Zjednoczone Ameryki), specznia sie w wodzie i dokladnie przemywa 0,05 M bufo¬ rem fosrbrantrsodu o wartosci pH=7,0. W celu aktywacji, 20 mil zawiesiny zelu w buforze /0,5 g suchego zelu w 25 ml buforu/ miesza sie z 0,5 ml dwualdehydu glutarowego i inkubuje w tempera¬ turze 37°C w ciagu 18 godzin. Nastepnie zel do¬ kladnie przemywa sie dioksanem, mieszanina 3:2 dioitosanu z iwoda, woda i buforem testowym.Sprzeganie 'dokonuje sie przez dodanie suchego zelu do roztworu 3 g decyloaaniny w 30 ml mie¬ szaniny dioiksanu i wody /60—40°/«/ o wartosci pH=8. Skladniki miesza sie w temperaturze 4°C w ciagu 18 godzin, a nastepnie zel przemywa sie dioksanem, dioksanem z woda /60—40°/ty, woda i buforem testowym.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o odczynie dodatnim na antygen Au i mianie 1:128 wedlug ID i IEOP. Próbe przeprowadza sie, jak w przykladzie III. Supernatant jest Au-ujemny wedlug ID, IEOP i Hapanostin.Przyklad XI.. Usuwanie antygenu Au z plaz¬ my przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Sepha- rose/-/cysteamina-ikwas oktylobursztynowy/.Sporzadzanie zelu.Konjugat Sepharose-cysteamina, otrzymany we¬ dlug przykladu%I, poddaje sie w ciagu godziny re¬ dukcji 0,05 M meTikaptoetanolem w 0,1 M buforze weglanowym o wartosci pH=8,5. Zel przemywa sie duza objetoscia buforu weglanowego, wody i dioksanu. Przemyty produlbt, 25 ml, dodaje sie do roztworu 1,2 g kwasu oktylobursztynowego w 40 ml dioksanu. Po dwóch godzinach mieszania w temperaturze pokojowej dodaje sie 1,84 g dwu* 40 45 50 55 60 cykioheksylokarbodwuimidu, a po nastepnych dwóch godzinach przemywa zel dioksanem. Pro¬ cedure powtarza sie, a nastepnie przemywa zel duza objetoscia didksanu, mieszaniny dioksanu z woda i 0,1 M roztworem weglanu* o wartosci ,pH=8,9. Pozostale grupy tiolowe blokuje sie, trak¬ tujac zel w ciagu 45 minut 60 mg jodoacetamidu.W koncu przemywa sie zel buforem testowym.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:32 wedlug ID. Adsorpcje przeprowadza sie na partiach materialu, wedlug przykladu III. Supernatant jest Au-ujemny wedlug ID, IEOP i Hepanosticon.Przyklad XII. Usuwanie antygenu Au z plazmy przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Se- pharose/-|/heksametylenodwuamina-ikwas 1-naftylo- oetowy/.Sporzadzanie zelu.Konjugat Sapharose-heksametylenodwuamina o- trzymuje sie wedlug przykladu I. ml zelu z czlonem oddzielajacym przenosi sie na saczek szklany i przemywa mieszanina diok¬ san-woda /3:ty, suszy przez saczenie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i przenosi do swiezo sporza¬ dzonego roztworu 1,1 g kwasu 1-naftylooctow.egfifc w 30 ml mieszaniny dioksan-woda /3:2/. Do za¬ wiesiny dodaje sie 2,65 g rozpuszczalnego w wo¬ dzie karbcKiwuimidu-lp-toluenosulfonian N-cyklo- heteylo-N'H[|3VN-metylom)orfolinoetylo(/]-karbodwu- imidu podczas mieszania, a nastepnie rozcienczo¬ nym kwasem solnym doprowadza ,pH do wartosci 4,8. Po godzinie utrzymywania w temperaturze po¬ kojowej dodaje sie nastepna porcje 2,65 g roz¬ puszczalnego w wodzie kartoodwuimidu. Calosc miesza sie w ciagu nastepnej godziny, przenosi na saczek szklany i dokladnie przemywa dioksa¬ nem, mieszanina dioksan-woda tworem chlorku sodu, woda i buforem testowym.Wydajnosc sprzegania w stosumku do kwasu i- -naftylooctowego, oznaczona magnetycznym rezo¬ nansem protonowymi ,/100 MHz/, wynosi 3,0^/t.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:64 wedlug IEOP. Adsorpcje przeprowadza sie partia¬ mi, wedlug przykladu III. Supernatant ma odczyn ujemny na antygen Au, wedlug ID, IEOP i He¬ panosticon.Przyklad XIII. Usuwanie antygenu Au z plazmy przez adsorpcje na konjugacie agaroza /Se- pharose/yheksametylanodwuaminaHwodoroburszty- nian cholesterolu/.Sporzadzanie zelu.Konjugant Sepharose-heksametylenodwuamina sporzadza sie wedlug przykladu I. ml zelu z czlonem oddzielajacym przenosi sie na szklany saczek i i przemywa dioksanem, % trójetyloamina w dioksanie i ponownie diok-; sanem, suszy przez saczenie pod zmniejszonym cis¬ nieniem i przenosi do swiezo sporzadzonego roz¬ tworu 0,5l g wodorobursztynianu cholesterolu w ml dioksanu. Reakcje inicjuje sie dodaniem: 0,35 g dwucyikloheksylokarbodwuimidu w 1 ml dioksanu. Sprzeganie prowadzi sie przy mieszaniu105 363 , U w temperaturze pokojowej. Po uplywie dwóch go¬ dzin dodaje sie nastepna porcje karbodwuimidu, a po dalszych dwóch godzinach sprzezony zel prze¬ mywa sie duza objetoscia dioksanu, mieszaniny dioksanu z woda, woda i buforem testowym.Próba z antygenem Au.Jako .material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:128 wedlug IEOP. Absorpcje przeprowadza sie partia¬ mi materialu, wedlug przykladu III. Supernatant ma ujemny odczyn na antygen Au, wedlug ID, IEOP i Hepanosticon.Przyklad XIV. Usuwanie antygenu Au z plazmy przez adsorpcje na konjugaeie agaroza /Sepharose/-/heksametylenodwuamina-kwas cholo¬ wy/.Sporzadzanie zelu.Konjugat Sepharose-heksametylenodwuamina o- trzymuje sie wedlug przykladu I. sprzeganie konjugatu Sepharose-heksaetyleno- dwuamina z kwasem cholowym przeprowadza sie wedlug przykladu XIII, z tym, ze 0,5 g kwasu cholowego rozpuszcza sie w 100 ml dioksanu.Wydajnosc sprzegania w stosunku do kwasu cholowego, oznaczona magnetycznym rezonansem protonowym /llOO MHzj/, wynosi 5,8*/o.Próba z antygenem Au.Jako material wyjsciowy stosuje sie plazme o dodatnim odczynie na antygen Au i mianie 1:32 wedlug ID. Adsorpcje przeprowadza sie na partiach materialu, wedlug przykladu III. Supernatant ma odczyn ujemny na antygen Au, wedlug ID, IEOP i Hepanosticon. PL