FI60875B - Foerfarande foer isolering och vidare rening av placentaspecifikt pp5-glykoprotein - Google Patents

Description

RS^l ΓβΊ KUULUTUSJULKAISU /nflnr lBJ (11>UTLÄGGNINGSSKRIFT b(J0 /5 C Patentti myönnetty 13 04 1902

Patent meddelat —' (51) Kv.ik?/int.ci.3 C 07 G 7/00 // G 01 N 33A8 SUOMI — FINLAND (21) p»«"«lh»k.mu.-P«*nttn»eknlf>f 771166 (22) H«ktml*pllvl — Ansttknlngsdag lU.0U.77 ' ' (23) Alkupllvi—Glltlghetsdag lU.0U.77 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offtntllg 18.10.77

Patentti- ja rekisterihallitus .... .... .... ....

_ . . . . . , (44) Nihtlvlkslpsnen ja kuuLJulkalsun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen v ’ An«ök»n utlaCd och utl.skrlftan publkarad 31.12.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prloritet 17.0U.76

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken

Tyskland(DE) P 261698U.6 (71) Behringwerke Aktiengesellschaft, D-3550 Marburg/Lahn, Saksan Liitto- tasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Hans Bohn, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7U) Oy Kolster Ab (5U) Menetelmä istukkaspesifisen PP^-glykoproteiinin eristämiseksi ja edelleen puhdistamiseksi - Förfarande for isolering och vidare rening av placentaspecifikt PP^-glykoprotein

Keksintö kohdistuu menetelmään istukkaspesifisen PP^-glyko-proteiinin eristämiseksi ja edelleen puhdistamiseksi.

H. Bohn löysi vuonna 1972 PP5-glykoproteiinin vesipitoisesta istukkauutteesta, ja kuten hän on esittänyt julkaisussa Archiv fiir Gynäkologie, 212 (1972) 165 - 175, voidaan antiseerumien avulla todeta istukkauutteessa joukko liukoisia antigeenejä immunologisesti. PP5-glykoproteiinin voitiin selvästi todeta olevan istukkaspesifinen, sillä tämän proteiinin toteamiskokeet immunologisten standardimenetelmien avulla useissa sikiövaiheen ja täysi-ikäisen ihmisen elimissä tai ihmisen plasmassa sekä erytrosyyttilysaateissa eivät johtaneet positiiviseen reaktioon.

Elektroforeettisessa liikkuvuuskokeessa agarilla PP^-glyko-proteiini osoittautuu /3^-globuliiniksi. Polyakryyliamidigeelillä se liikkuu suhteellisella nopeudella 75 albumiinin nopeuden ollessa 100. Sen käyttäytymistä verkkoutetulla dekstraanilla suoritetussa geeli-suodatuksessa pääteltiin ΡΡς:η molekyylipainoksi noin 50 000. PP5 esiintyy istukkauutteessa verrattain pieninä pitoisuuksina, minkä 2 60875 vuoksi sen valmistus puhtaana huolimatta biokemiallisen valmistustekniikan monipuolisista menetelmistä ei tähän mennessä ole ollut mahdollista, sillä nämä menetelmät eivät ole riittävän selektiivisiä.

Nyt on yllättäen havaittu, että PP5~glykoproteiini voidaan immunoadsorption avulla eristää sitä sisältävistä liuoksista ja puhdistaa edelleen tavanomaisilla fraktiointimenetelmillä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä uutetaan istukoita suolaliuoksella, uutteeseen lisätään diaminoetoksiakridiinilaktaattiliuosta, muodostunut sakka erotetaan, suodoksesta poistetaan jäljellä oleva diaminoetoksiakri-diinilaktaatti saostamalla se natriumkloridin avulla, minkä jälkeen suodokseen lisätään ammoniumsulfaattia, muodostunut PP5:n sisältävä sakka erotetaan ja liuotetaan veteen, liuosta dialysoidaan pH7-pus-kuria vastaan, minkä jälkeen dialysoitu PP^-pitoinen liuos lingotaan.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että PP^-pitoinen proteiiniliuos, jonka pH on 4-9, saatetaan kosketukseen liukenemattomaan kantajaan sidotun PP^:n vasta-aineen kanssa, kantaja, joka sisältää sitoutuneena PP^:n poistetaan nestefaasista ja sitä käsitellään PP^:n erottamiseksi vesiliuoksella, jonka pH on 2 - 4, jonka jälkeen sinänsä tunnettujen puhdistusmenetelmien avulla puhdistetaan tuote yli 99-% puhtauteen.

Lähtömateriaalina käytetään siis edullisesti ihmisen istukoita, joista voidaan uuttaa noin 10 - 20 mg PP^-glykoproteiinia yhtä keskimääräisen kokoista (noin 500 - 600 g) istukkaa kohti. Vesipitoisen uutteen valmistamiseksi käsitellään hienonnettuja istukoita vedellä tai sopivalla suolaliuoksella ja nestefaasi otetaan talteen.

Suolaliuokseen soveltuvat käytettäväksi mahdollisimman iner-tit suolat, jotka ovat tunnettuja kudoksia uutettaessa käytetyistä suolaliuoksista. Voidaan käyttää neutraalisuoloja ja puskuriaineita, erikoisesti keittosuolaa tai tris-hydroksimetyyliaminometaania, edelleen fosfori- tai sitruunahapon alkalimetallisuoloja. Sopiva suolapitoisuus on 0,1 - 5 %.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla voidaan PP^-glykoprote-iinia eristää tavanomaisista istukkauutteista, joissa sen pitoisuus on noin 1 - 2 mg/100 ml, ja saavutetaan noin 100 - 1000 mg/100 ml oleva pitoisuus, eli spesifinen rikastumisaste on noin 2 500 - 5 000-kertainen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä tarvittava vasta-aine, joka sidotaan tunnetulla tavalla kiinteään kantajaan, saadaan immunoimalla 3 60875 eläimiä PP^rllä. Mikäli puhdasta proteiinia ei ole käytettävissä, valmistetaan selkärankaisten, erikoisesti kaniinien immunointia varten saostusmenetelmän avulla PP^:llä rikastettu istukkajae, esimerkiksi H. Bohn'in edellä mainitussa julkaisussa esittämän menetelmän mukaan.

Immunoitaessa tällaisilla raakajakeilla saadaan multispesifi-siä vasta-aineita sisältäviä vastaseerumeja. Ne vasta-aineet, jotka eivät ole PP^ille spesifisiä, käsitellään veriseerumista ja istukka-jakeista saaduilla sopivilla antigeeneillä, jolloin tapahtuvan anti-geeni-vasta-ainereaktion avulla voidaan poistaa epäspesifiset vasta-aineet.

PP^-vasta-ainetta sisältävä immunoglobuliinijae otetaan talteen tunnetulla tavalla. Sen avulla saatu anti-PP^ sidotaan vastaavasti tunnettujen menetelmien avulla kovalenttisesti sopivaan kantajaan. Tällaisia menetelmiä on esitetty esimerkiksi julkaisuissa Ann. Rev. Biochem, 40 (1971) 259, Naturwissenschaften 58 (1971) 383 tai Nature 314 (1967) 1302. Sopivia kantajia ovat suurimolekyyliset hiilihydraatit, kuten selluloosa ja agar, ja synteettiset hartsit, kuten polyakryyliamidit ja etyleeni/maleiinihappoanhydridin ko-polymeerit, myös lasikappaleita voidaan käyttää kantajana. Erikoisen suositeltava kantaja on puhdistettu agaroosi pieninä pallosina, joiden läpimitta on 20 - 200 pm.

PP^-glykoproteiinin eristämiseksi liuoksista, erikoisesti is-tukkauutteista, jotka lisäksi sisältävät muita proteiineja ja hiilihydraatteja, saatetaan PP^:n sisältävä liuos kosketukseen vasta-ainetta kantavan adsorptio-aineen kanssa, ja pH säädetään arvoon > 4. Proteiinien denaturoitumisen välttämiseksi on suositeltavaa valita pH-arvo pienemmäksi kuin 9. Liuoksen suolapitoisuus ei ole kriittinen. Kuitenkin tulisi välttää olosuhteita, joissa antigeenin ja vasta-aineen välinen sidos helposti katkeaa. Vesiliuos sisältää edullisesti neutraaleja suoloja ja/tai puskuriaineita, joita yleisesti käytetään biokemiallisissa reaktioissa, erikoisesti natriumkloridia, fosfaatti-puskuria, tris-hydroksimetyyliaminometaania ja muita tunnettuja puskuriaineita (ks Biochem. 5 (1966) 472 ja Handbook of Biochemistry, julk. The Chemical Rubber Co, Cleveland, Ohio, USA, toinen painos, osa J, sivu 238). Näiden aineiden pitoisuudet ovat tarkoituksenmukaisesti välillä 0,01 ja 2 moolia/1. Proteiiniliuoksen ja adsorbentin suhde on tarkoituksenmukaisesti alueella 1:1 - 10:1, edullisesti 2:1. Adsorbentin tulisi pysyä kosketuksessa proteiiniliuoksen kanssa 4 60875 0,1 - 5 tuntia antigeeni-vasta-ainesidoksen muodostamiseksi.

PP^:n adsorptio ja eluointi voidaan suorittaa joko niin sanotun panosmenetelmän avulla tai kromatografiapylväässä. Panosmene-telmässä adsorbentti poistetaan liuoksesta linkoamalla tai suodattamalla pesemällä useita kertoja neutraalilla suolaliuoksella ylimääräisten suolojen ja adsorboitujen epäpuhtauksien poistamiseksi. Pylväsmenetelmässä liuos poistetaan pylväästä huuhtelemalla perusteellisesti puskuriliuoksella.

PP^:n eluointi vasta-ainepitoisesta kantajasta voidaan suorittaa tunnetulla tavalla, jolloin antigeeni-vasta-ainesidos katkeaa. Eluointi voidaan suorittaa esimerkiksi käsittelemällä kantajaa vesi-liuoksella, jonka pH < 4, edullisesti välillä 2-4. Liuoksen tulisi sisältää suoloja ja sopivia puskuriaineita sopivina pitoisuuksina, edullisesti 0,2 - 8 moolia/1.

Panosmenetelmässä on suositeltavaa pitää adsorboivan aineen dispersiota tässä liuoksessa 0,1 - 2 tuntia, jolloin PP,. immunoad-sorbenssin vaikutuksesta desorboituu. Pylväsmenetelmässä annetaan eluointiliuoksen valua pylvään lävitse. Kun adsorboiva aine on poistettu, PP,--pitoisen liuoksen pH säädetään suunnilleen neutraaliksi (pH = 6 - 8). Liuos voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen.

Tämän menetelmän mukaan saadun PP^:n puhtausaste on 50 - 80 %. Jatkopuhdistusmenetelmien avulla se voidaan nostaa suuremmaksi kuin 99 %.

Immunoadsorption avulla rikastetun PP^:n jatkopuhdistukseen voidaan käyttää tavanomaisia fraktiointimenetelmiä. Tällöin on edullista suorittaa fraktiointi molekyyliseulan avulla, jolloin ne molekyylit, joiden molekyylipaino on noin 50 000, erotetaan. Toinen edullinen menetelmä on ioninvaihtokromatografia. Tällöin käytetään hyväksi PP^:n varautumisominaisuuksia, PP^:n käyttäytyessä tunnetusti samoin kuin /^-globuliini. PP5~glykoproteiinia voidaan valmistaa puhtaana myös immunoadsorptiomenetelmällä, jossa ei käytetä PP^:n vasta-aineita, vaan poistettavien epäpuhtauksien vasta-aineita kantajaan sidottuina adsorbentteina. PP^ jää tätä menetelmää käytettäessä sitoutumattomaan osaan.

Puhdistusmenetelmän teho voidaan todeta yksinkertaisimmin vastaavien antiseerumien avulla. Kustakin fraktiointimenetelmästä otetaan talteen ne jakeet, joissa havaitaan spesifisesti PP^itä vastaan reagoivan antiseerumin kanssa immunologinen reaktio, erikoisesti im-munosaostuminen.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu PP,- on erikoisen 5 60875 sopiva sille spesifisten antiseerumien valmistamiseen. Tällöin immu-noidaan eläimiä PP^rllä tunnettujen menetelmien avulla ja eläinten verestä otetaan antiseerumi talteen. Näiden uusien antiseerumien avulla voidaan PPC osoittaa kehon nesteissä immunologisten menetelmien, kuten esimerkiksi hemagglutinaatio-estokokeen, komplementin sitomis-reaktion, radioimmunoanalyysin, lateksiagglutinaation ja vastaavien herkkien menetelmien avulla.

Siten voidaan osoittaa, että PP^:ä esiintyy raskauden aikana pieninä pitoisuuksina veressä. Edelleen PP^:llä on merkitystä kasvannaisten diagnostiikassa. Sitä voidaan osoittaa sellaisten potilaiden veressä ja kasvainkudoksessa, joilla on trofoblastisia kasvaimia. Vastaavat diagnostiset aineet sisältävät yleensä pääasiassa anti-PP^-ainetta, ja tietyissä menetelmissä, esimerkiksi radioimmunologisissa koemenetelmissä, käytetään PP,-:ä sellaisenaan standardiaineena. Diagnostisissa aineissa, jotka on tarkoitettu PP^:n vasta-aineiden osoittamiseksi, PP,- on reagenssin olennainen aineosa.

Seuraava esimerkki kuvaa keksintöä.

1. Immunoadsorbentin valmistus

Immunoidaan kaniineja 6 viikon ajan puhdistetulla PP^rllä käyttäen alumiinihydroksidia adjuvanttina. PP^ liuotetaan fysiologiseen keittosuolaliuokseen (3 ml liuosta sisältää 0,06 mg NaCl), lisätään alumiinihydroksidia ja sekoitetaan,jolloin muodostuu suspensio. Kaniinit saivat viitenä peräkkäisenä päivänä kulloinkin 0,06 mg proteiinia 3 mlrssa suspensiota eläintä kohti injektoituna. Tämän jälkeen seuraa 9 vuorokauden tauko. Sitten eläimet immunoidaan uudestaan viitenä peräkkäisenä päivänä samalla antigeenimäärällä, pidetään jälleen 9 vuorokauden tauko, ja injektoidaan lopuksi vielä viitenä peräkkäisenä päivänä kulloinkin 0,06 mg:11a antigeeniä. 7-9 päivän kuluttua eläimistä poistetaan veri. Seerumi erotetaan verestä sentrifugoimalla.

150 ml edellä valmistettua kaniinin anti-PP^-seerumia dialy- soidaan 0,02-m fosfaattipuskurin (pH 7,0) avulla ja immunoglobuliinin erottamiseksi kromatografoidaan DEAE-selluloosan toimiessa absorbent- tina. Immunoglobuliinijakeen (1,3 g proteiinia) annetaan reagoida 258 g:n kanssa erikoismenetelmällä puhdistettua pallomuodossa olevaa (R) agroosia (Sepharose 4B, Pharmacia Uppsala, Ruotsi), joka on aktivoitu 16,1 g:11a bromisyaania, jolloin immunoglobuliini sitoutuu kovalenttisesti kantajaan.

Menetelmän on esittänyt Axen R., Porath J., Ernbach S., Nature 6 60875 214 (1 967) 1 302 .

Tällä tavalla valmistetun immunoadsobentin avulla istukka-proteiini PP,- voidaan eristää sitä sisältävistä liuoksista, erikoisesti PP5~rikastetusta istukkauutejakeesta.

2. PPc-glykoproteiinin rikastaminen istukkauutteesta 2. 1 PP^-qlykoproteiinifraktion rikastaminen 150 kg syväjäädytettyjä istukoita hienonnetaan ja uutetaan 150 litralla 0,5-% natriumkloridin vesiliuosta. Uutteen pH säädetään 2-n natriumhydroksidin avulla arvoon 8, ja lisätään 50 litraa 3-% (R) diaminoetoksiakridiinilaktaatin (Rivanol ) vesiliuosta. Tunnin kuluttua poistetaan ylempi kerros, joka sisältää PP^:n ja gammaglobuliinin, siihen lisätään 5 % kiinteää natriumkloridia (11 kg) liuokseen jääneen rivanolin erottamiseksi, suodatetaan ja lisätään 26,5 % kiinteää ammoniumsulfaattia, nesteen painosta laskettuna, ja sekoitetaan hyvin. Yhden tunnin kuluttua sakka erotetaan suodattamalla.

500 g suodattimelta talteenotettua sakkaa liuotetaan 500 ml:aan tislattua vettä ja dialysoidaan 0,01-m tris-(oksimetyyli)-aminometaani (lyhennetään "tris")-suolahappo-puskuriliuoksen avulla, jonka pH arvo on 7,0 ja joka sisältää 0,05 % natriumatsidia. Dialysoitu liuos lingo-taan, ja ylempi kerros laimennetaan samalla puskuriliuoksella 2000 ml:ksi, ja sen pH säädetään arvoon 8,0 0,1-m natriumhydroksidiliuok-sella, lisätään 250 g kosteaa DEAE-selluloosaa, ja sekoitetaan yhden tunnin ajan.

Tämän jälkeen DEAE-selluloosa erotetaan liuoksesta suodattamalla, pestään kahdesti kulloinkin yhdellä litralla 0,01-m tris-suolahappo-puskuria, jonka pH on 8,0, ja sen jälkeen eluoidaan kolme kertaa kulloinkin 500 ml:11a 0,02-m tris-suolahappopuskuria, jonka pH on 6,5, ja joka sisältää 0,85 % natriumkloridia ja 0,05 % natriumatsidia.

Yhdistettyihin eluaatteihin lisätään 30 % ammoniumsulfaattia, nesteen painosta laskettuna, ja sekoitetaan. Sakka, joka sisältää PP^:n. liuotetaan 100 ml:aan tislattua vettä ja dialysoidaan 0,1-m tris-suolahappo-puskurin avulla, jonka pH on 8,0 ja joka sisältää 1,0 mol/1 natriumkloridia ja 0,1 % natriumatsidia. Saadaan 200 ml liuosta, joka sisältää 6 % proteiinia ja noin 30 mg PP^. Tästä jakeesta PP^ voidaan eristää immunoadsorption avulla.

Kohdassa 2. 1 esitetty rikastusmenetelmä ei ole keksinnölle oleellinen. Immuniadsorptio voidaan suorittaa myös suoraan istukka-uutteelle.

^ 60875 2. 2 PPr.-glykoproteiinin immunoadsorptio

Inununoadsorbentti suspentoidaan 0,1-m tris-HCl-puskuriin (pH 8,0), joka sisältää 1,0 moolia/1 NaCl ja 0,1 % NaN^ (lyhennetään seuraavassa puskuriliuokseksi I), kaadetaan kromatografiapylvääseen (3 x 20 cm) ja huuhdellaan puskuriliuoksella I. Sitten annetaan 100 ml PPj.-pitoista liuosta valua hitaasti pylvään lävitse, jolloin PP^ sitoutuu immunoadsorptiivisesti. Pylväs pestään perusteellisesti puskuriliuoksella I, ja adsorboitu proteiini eluoidaan 0,5-m glysiini-HCl-puskurilla (pH 2,5). PP^-pitoisen eluaatin pH säädetään 1-n NaOH:lla arvoon 7,0 ja liuos väkevöidään ultrasuodattimella noin 10 ml:ksi. Saanto yhtä adsorptiokertaa kohti on noin 2 mg PP^.

Pylväässä oleva adsorbentti neutraloidaan välittömästi PP^rn eluoinnin jälkeen puskuriliuoksella I ja pestään perusteellisesti, jolloin absorbenttia voidaan käyttää uudestaan PP^:n immunoadsorptii-viseen sitomiseen.

Immunoadsorption avulla saatu proteiini sisältää usein epäpuhtauksina epäspesifisesti sidottuja seerumiproteiineja (pääasiassa IgG ja lisäksi hieman IgA). Nämä oheisproteiinit voidaan poistaa esimerkiksi geelisuodatuksen tai molekyyliseulafraktioinnin avulla käytyjä) täen esimerkiksi verkkoutettua dekstraania, kuten Sephadex G-100; seerumiproteiinit voidaan kuitenkin poistaa myös immunoadsorption avulla, so. kantajaan sidottujen seerumiprotetiinien vasta-aineiden avulla.

2. 3 PP^-glykoproteiinin geelisuodatus PP(.-glykoproteiinin edelleen puhdistamiseksi geelisuodattamal-la liuotetaan 10 - 20 mg immunoadsorptiossa saatua tuotetta 5-10 ml:aan puskuriliuosta I ja johdetaan liuos Sephadex G-100-kolonnin (2,5 x 100 mm) läpi. Eluoidaan samalla puskuriliuoksella. Eluanttien PP^-pitoisuus määritetään Ouchterlony;n geelidiffuusio-kokeen avulla käyttäen PP,.-antiseerumia. PP^-pitoiset fraktiot yhdistetään, haihdutetaan kuiviin ultrasuodattimen päällä, dialysoidaan vettä vastaan ja lyofiloidaan. Korkean molekyylipainon omaavat epäpuhtaudet, kuten immunoglobuliinit (IgG ja IgA), eluoituvat ennen PP,.:ttä, ja erottuvat siten PP,-;stä.