NO146747B - Fremgangsmaate til isolering og ytterligere rensing av det placentaspesifikke protein pp5 - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til isolering og rensing av et placentaprotein som forekommer i den menneske-

lige placenta, og som er funnet av H. Bohn 1972 i vandig placentaekstrakt og betegnet som PP^ samt dermed antigenbeslektede proteiner.

Som omtalt av H. Bohn i Archiv fur Gynåkologie, bind 212,

side 165-175, 1972, kan det ved hjelp av antisera som var utvunnet ved immunisering av placentafraksjoner, i ekstraktet fra placenta påvises■.immunologisk en rekke oppløselige anti-

gener. For det med PP^ betegnede protein kunne det vises at det tydeligvis er placentaspesifikt, fordi påvisningsforsøk av dette protein med immunologisk standardteknikk i rekken av embryonale og adulte menneskelige organer eller også i humanplasma samt erytrocytlysater ikke førte til positiv reaksjon.

I den elektroforetiske vandring i agar viser PP^ seg som 3-^-globulin. I en polyacrylamidgel vandrer det sammenlignet til albumin = 100 med en relativ bevegelighet på 75. På

grunn av dets forhold ved gelfiltrering på tverrnettbundet dekstran ble det avledet en molekylvekt for PP^ på ca.

50.000. PPg er selv i placentaekstrakt tilstede med relativt lav konsentrasjon, således at dets renfremstilling hittil ikke var mulig, tross omstendelige fremgangsmåter fra bio-

kjemisk preparativ teknikk, spesielt fordi denne fremgangs-

måte ikke er tilstrekkelig selektiv. I placentafraksjon V er PP5 anriket, og denne fraksjon kan fordelaktig

tjene som utgangsmaterial for fremgangsmåten ifølge opp-

finnelsen.

Det ble overraskende funnet at PP^ kan isoleres

fra oppløsninger hvori det er inneholdt, fortrinnsvis fra placentafraksjon V (Archiv der Gynakologie (1972), 212, 165),

ved hjelp av immunadsorpsjon og kan fåes rent ved etterfølg-ende rensing etter vanlige fraksjoneringsmetoder eller også

i en ytterlige immunadsorpsjonsfremgangsmåte, hvori de rest-

erende serumproteiner og placentaproteiner kan fjernes.

Oppfinnelsens gjenstand er følgelig en fremgangsmåte til isolering og ytterligere rensing av protein PPj- fra dets oppløsninger, spesielt fra placentafraksjonen V.

Placentafraksjonen V fremstilles på følgende måte:

Placenter ekstraheres med en vandig saltoppløsning. Ekstraktet blandes med en oppløsning av diaminoetoksyacridinlaktat og utfellingen fraskilles. Fra det ovenstående utfelles enda deri inneholdt diaminoetoksyacridinlaktat med natriumklorid og adskilles. Til det ovenstående settes ammoniumsulfat, utfellingen som inneholder PP^ adskilles, oppløses i vann og dialyseres mot en puffer på ca. pH 7, eksempelvis 0,01 molar trisoksymetylamminometan og sentrifugeres. Denne oppløsning er placenta-Eraksjon V og anrikes eventuelt ytterligere. Fremgangsmåten er karakterisert ved at denne oppløsning bringes i berøring ved en pH mellom 4 og 5 med et på en uoppløselig bærer bundet antilegeme mot PP5, adskiller bæreren som inneholder PP5 bundet fra den flytende fase og for utløsning av PP^ behandler med et vandig medium av pH-verdi 2-4 eller med en oppløsning av et stoff som dissosierer proteinbindinger ved en pH-verdi på 4-9 og renser ved i og for seg kjente isoleringsfremgangsmåter etter immunadsorpsjonen inntil en renhet på over 99%.

Det ligger innen oppfinnelsens ramme at ifølge denne kan

ikke bare PP^, men også med PP^ antigenbeslektede proteiner, isoleres resp. anrikes. Omvendt er det anvendbart antileg-

emer som er serologisk beslektet med PP^ til adsorptiv fremstilling, såvel av PP^ som også av dermed antigenbeslektede proteiner .

Som utgangsmaterial tjener fortrinnsvis menneskeplacenta,

hvorav man kan ekstrahere 1-2 mg PP^ pr. placenta av gjennom-snittelig størrelse (500-600 g). For fremstilling av det vandige ekstrakt behandles knust placenta med vann eller en egnet saltoppløsning og den flytende fase utvinnes.

Egnede salter for saltoppløsning er mest mulig inerte salter, slik de er kjent som bestanddeler av oppløsninger for ekstra-hering av vev. Det anvendes dertil nøytralsalter og pufferstoffer, spesielt koksalt eller tris-hydroksymetyl-aminometan, videre alkalisalter av fosfor- eller sitronsyre. Hensiktsmessig ligger saltkonsentrasjonene ved 0,1-5%.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan PP^ fra vanligvis anvendte placentaekstrakter, hvori det foreligger i en konsentrasjon på 0,1-0,4 mg pr. 100 ml,anrikes til en konsentrasjon på 100—1000 mg/100 ml. Den spesifikke anrikning ligger ved 25.000-50.000 .

Det for anrikningen av PP^ nødvendige antilegeme, som kan bindes på kjent måte på en fast bærer, fåes ved immunisering av dyr med PP^- Så lenge renproteinet ikke står til disposi-sjon fremstilles den for immunisering av hvirveldyr, spesielt kaniner, med en ved hjelp av utfellingsfremgangsmåte med hen-syn til PPp. anriket placentaf raks jon, eksempelvis etter den metode som var omtalt av H. Bohn 19 72.

Ved immunisering av slike råfraksjoner fåes antisera med multispesifikke antilegemer. De ikke spesifikke mot PP^ rettede antilegemer behandles med egnede antigener fra blodserum og placentafraksjoner, hvoretter ved hjelp av den resulterende antigen-antilegemereaksjon de uspesifikke antilegemer kan fjernes.

Fremstillingen av immunglobulinfraksjon, hvori PP^-anti-legemet befinner seg, foregår på kjent måte. Det derved dannede anti-PP^ bindes tilsvarende kjente fremgangsmåter på egnede bærere. Slike fremgangsmåter er eksempelvis be-skrevet i Ann. Rev. Biochem. 40, 1971, side 259, Natur-wissenschaften 58 (1971), side 389 eller Nature 314 (1967), side 1302. Spesielt egnede bærere er høypolymere karbohy-drater som cellulose eller agar, syntetiske harpikser,

som polyacrylamid eller kopolymere av etylen/maleinsyrean-hydrid, også glasspartikler kan anvendes som bærer.

Spesielt foretrukket som bærematerial er en renset agarose i form av små kuler med en diameter på 20-200 ym, hvortil etter ovenfor sistnevnte metode antilegeme mot PP^ kan bindes kovalent.

For isolering av PP^ fra oppløsninger, spesielt fra placentaekstrakter, som dessuten inneholder andre proteiner og karbo-hydrater, bringes PP^-oppløsningen i berøring med det antilegemeholdige adsorbens, idet pH-verdien innstilles på over 4. For å unngå en denaturering av proteinene lønner det seg å velge pH-verdien ikke høyere enn 9. Oppløsningenes salt-konsentrasjon er ikke kritisk. Imidertid bør betingelser unn-gåes som er egnet til å løse bindingen av antigenet til anti-legemet. Fortrinnsvis inneholder den vandige oppløsning nøytrale salter og/eller pufferstoffer slik de generelt anvendes i biokjemiske reaksjoner, spesielt natriumklorid, fosfatpuffer, tris-hydroksymetylaminometan og andre kjente pufferstoffer, slik de eksempelvis er omtalt i Handbook of Biochemistry, published by The Chemical Rubber Co., Cleve-land, Ohio, USA, annen utgave, side J 238. Konsentrasjonen av disse stoffer ligger hensiktsmessig i område mellom 0,01 og 2 mol/liter. Forholdet proteinoppløsning:adsorbens er hensiktsmessig i området 1:1-10:1, fortrinnsvis 2:1. Adsorbenset før forbli i berøring med proteinoppløsningen 0,1-5 timer, slik at det står tilstrekkelig tid til disposi-sjon til å knytte antigen-antilegeme-bindingen.

Adsorpsjon og eluering av PP^ kan gjennomføres såvel i såkalte porsjonsfremgangsmåter som også i en kromatografisøyle. Hertil adskilles adsorbenset fra oppløsningen, vaskes i porsjonsfremgangsmåten ved sentrifugering eller filtrering flere ganger med en nøytral saltoppløsning for å eliminere overskytende salter og uspesifikke adsorberte forurensninger. I søylefremgangsmåten fjernes oppløsningen fra søylen ved grundig spyling med pufferoppløsning.

Elueringen av PP,- fra den antilegemeholdige bærer kan foregå på kjent måte ved forholdsregler som bevirker oppløsning av antigen-antilegeme-bindingene. Elueringen kan foregå ved be-handling av bæreren med et vandig medium av pH mellom 2 og 4. Den tilsvarende oppløsning bør inneholde salter av egnede pufferstoffer i egnet konsentrasjon, fortrinnsvis 0,2-8 mol/ liter.

I porsjonsfremgangsmåten lønner det seg å la dispersjonen

av adsorbenset være i denne oppløsning 0,1-2 timer, idet PP,-desorberes av immunadsorbenset. I søylefremgangsmåten lar man elueringsoppløsningen strømme gjennom søylen. Etter adskillelse av adsorbenset innstilles pH-verdien av oppløs-ningen som inneholder PPj- til ca. nøytralt (pH 6-8) . Den anrikede PP^-oppløsning kan hvis ønsket, underkastes en ytterligere rensning.

Elueringen av PP^ fra den antilegemeholdige bærer kan også foregå ved hjelp av stoffer som dissosierer proteinbindigene ved pH 4-9, eksempelvis med urinstoff- eller guanidinoppløs-ninger eller oppløsninger av såkalte chaotrope salter som NaN03, NaBr, NaC104, CF3C00Na, NaSCN eller CCl3COONa. Konsentrasjonen av disse salter i elusjonsmediet utgjør hensiktsmessig 2-8 mol/liter. For fjerning av de chaotrope salter fra oppløsningen etter desorpsjon av PP^ og til adskillelse av adsorbenset kan oppløsningen dialyseres mot en nøytral salt-oppløsning eller pufferoppløsning av konsentrasjon 0.1-1 mol/liter.

Det etter denne fremgangsmåte dannede PP^ har en renhetsgrad på 50-80%. Ved ytterligere rensefremgangsmåter kan det anrikes til over 99%.

Hvis det ønskes en vidererensning av det ved immunadsorpsjon anrikede PP,-, kan dette foretas ved vanlig f raks jonerings-fremgangsmåter. Foretrukket blir derved fraksjoneringsfremgangsmåter ved hjelp av en molekylsikt med det formål å an-rike PP^-mengden i fraksjoneringsområdene fra molekylene med en molekylvekt på ca. 50.000. En ytterligere vanlig anvendbar fremgangsmåte er ioneutvekslingskromatografi. Derved utnyttes ladningsegenskapene av PPg» som som kjent forholder seg som et B^-globulin. En ytterligere mulighet til renfremstilling av PP^ er gitt i immunadsorpsjonsfrem-gangsmåtene, hvor ikke antilegemene mot PP^, men mot de forurensninger som skal fjernes, finner anvendelse som bærerbundne adsorbentier. PP^ befinner seg etter anvendelsen av denne fremgangsmåte i den ikke bundne del.

Fremskrittet av rensningsfremgangsmåten er i ethvert tilfelle overprøvbar enklest ved hjelp av tilsvarende antiserer.

Ved de eventuelle fraksjoneringsfremgangsmåter utvinnes de fraksjoner, som med det spesifikt mot PP^ reagerende antisera viser en immunologisk reaksjon, spesielt en immunpre-sipitering.

Det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppnåelige PP5

er spesielt egnet til å fremstille, spesifikt derimot rettede antisera. Dyr immuniseres etter kjente metoder med PP^ og av blodet av dyrene utvinnes antiserum. Ved hjelp av disse nye antisera lar PP^ seg påvise i kroppsvæskene ved immuno-logiske metoder, som eksempelvis hemagglutinasjonshemmings-prøven, komplimentbindingsreaksjonen, radioimmunoassay, lateksagglutinasjon og lignende følsomme metoder.

Således lar det seg vise at PP5 under svangerskapet fremtrer

i liten konsentrasjon i den svangres blod. Videre er PP^

av betydning i tumordiagnostikken. Det kan påvises i blod i tumorvev fra syke med trofoblastiske tumorer. Vanligvis består de tilsvarende diagnostiske midler i det vesentlige av anti-PP,- og ved bestemte fremgangsmåter, spesielt i radioimmunologiske prøvesystemer, medføres PP^ selv som standardstoff. I diagnostiske midler til påvisning mot PP^-rettede antilegemer er PP^ reagensets vesentlige be-standdel .

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal forklares nærmere

ved hjelp av følgende eksempel.

150 ml av et anti-PP5~serum fra kaniner dialyseres mot 0,02

molar fosfatpuffer (pH 7,0) og kromatograferes for adskillelse av immunglobuliner på DEAE-cellulose. Immunglobulinfraksjonen (1,3 g protein) omsettes deretter med 258 g spesielt renset agarose i kuleform ("Sepharose" 4B fra Pharmacia Uppsala,

Sverige), som var blitt aktivert med 16,1 g bromcyan og så-

ledes bundet kovalent til denne bærer.

Fremgangsmåten er omtalt av Axen R., Porath J., Ernbach S.,

Nature 214, 1302, (1967).

Ved hjelp av et på denne måte fremstilt immunadsorbens kan placentaproteinet PP^ isoleres fra dets oppløsninger,

spesielt fra PP^-anrikede placentaekstraheringsfraks joner.

2-i__^IiEi?S2iD2_5Y_EER_f ^.Ei^SSDtå^strakt

(Utvinning av placentafraksjon V)

2.1. Anrikning av PP^ eggehvitefraks jon.

150 kg dypfrosne placentaer knuses og ekstraheres med 150

liter av en 0,5%-ig vandig natriumkloridoppløsning. Eks-

traktet innstilles med 2 normal natriumhydroksyd på pH 8 og blandes med 50 liter av en 3%-ig vandig oppløsning av diaminoetoksyakridinlaktat ("Rivanol"). Etter en oppholdstid på 1 time fjernes det overstående som inneholder PP,- sammen med gammaglobulin, blandes med 5% fast natriumklorid (11 kg)

til utskillelse av ennu i oppløsningsn gjenblivende rivanol, filtreres og blandes med 26,5%, referert til væskevekten av fast ammoniumsulfat og gjennomrøres godt. Etter 1 time frafUtreres utfellingen.

500 g av den på filteret samlede utfelling oppløses i 500 ml destillert vann og dialyseres mot en 0,01 molar tris-(oksy-metyl)-aminometan (i det følgende forkortet "tris")-saltsyre-pufferoppløsning av pH-verdi 7,0 som inneholder 0,05%

natriumazid. Den dialyserte oppløsning sentrifugeres (placentafraksjcn V) .

Det overstående oppfylles med samme pufferoppløsning til 2000 ml, innstilles med 0,1 normal natriumhydroksydoppløsning til pH

8,0 og utrøres med 250 g fuktige DEAE-cellulose en time.

Deretter adskilles DEAE-cellulosen ved filtrering fra oppløs-ningen, vaskes to ganger med hver gang 1 liter 0,01 molar tris-saltsyre-puffer av pH-verdi 8,0 og elueres deretter tre ganger med hver gang 500 ml 0,02 molar tris-saltsyre-puffer,

pH 6,5, som inneholder 0,85% natriumklorid og 0,0 5% natriumazid.

De forenede eluater tilsettes 30% ammoniumsulfat, referert

til væskevekt og det hele omrøres. Utfellingen som inneholder PP^ oppløses med 100 ml destillert vann og dialyseres mot en 0,1 molar tris-saltsyrepuffer pH 8,0, som inneholder 1,0 mol NaCl pr. liter og 0,1% natriumazid. Man får 200 ml av en oppløsning med ca. 6% eggehvite og ca. 30 mg PP^. Av denne fraksjon kan det isoleres PP^ ved immunadsorpsjon.

Den under 2.1 foranstilte anrikningsfremgangsmåte er ikke vesentlig for oppfinnelsen. Immunadsorpsjonen kan også gjennomføres direkte med placentafraksjon V.

2.2. Immunadsorpsjon av PP^

Immunadsorbenset suspenderes i 0,1 molar tris—HCl-puffer

(pH 8,0), som inneholder 1,0 mol/liter NaCl og 0,1% NaN^

(nedenstående pufferoppløsning I), fylles deretter i en kromatografisøyle (3 x 20 cm) og etterspyles med pufferopp-løsning I. Deretter lar man det langsomt vandre 100 ml av en PP^-holdig oppløsning gjennom søylen, idet PP^

bindes immunadsorptivt. Man vasker søylen med puffer I

og eluerer deretter det adsorberte protein med 0,5 molar glycin-HCl-puffer (pH 2,5). De PP5~holdige eluater innstilles med 1 normal NaOH på pH 7,0 og inndampes i ultra-filter til ca. 10 ml. Utbytte pr. adsorpsjon rundt 2 mg PP5.

Adsorbenset i søylen nøytraliseres umiddelbart etter elueringen av PPg igjen med pufferoppløsning I og vaskes grundig, det kan deretter igjen anvendes til immunadsorptiv binding av PP^.

Det ved immunadsorpsjon fremstilte protein er hyppig forurenset ved uspesifikt bundet serumprotein (hovedsakelig IgG og dessuten noe IgA). Adskillelsen av disse følgeproteiner lykkes, f.eks. ved gelfiltrering, molekylsiktfraksjonering, f.eks. fortrinnsvis ved hjelp av tverrnettdannet dekstran som "Sepha-dex" G - 100, serumproteinene kan imidlertid også fjernes ved immunadsorpsjon, dvs. ved hjelp av bærerbundne antilegemer mot serumproteiner.

Anvendelsen av PP5 til fremstilling av anti-PP5~serum er som følger: Det ble immunisert kaniner med det rensende PP^ under anvendelse av aluminiumhydroksyd som adjuvans over et tidsrom på

6 uker.

PP^ oppløses i fysiologisk koksaltoppløsning (konsentrasjon 0,0 6 mg/3 ml) og under tilsetning av aluminiumhydroksyd til en suspensjon. Kaninene får i 5 på hverandre følgende dager injisert hver 0,06 mg protein i 3 ml suspensjon pr. dyr intravenøst.

Deretter lar man dyrene hvile i 9 dager. Deretter immuni-serer man igjen i 5 på hverandre følgende dager med overnevnte like mengder antigen, lar dyrene igjen hvile i 9 dager og injiserer endelig i 5 på hverandre følgende dager hver gang 0,06 mg antigen. Etter en fornyet ventetid fra 7-9 dager blodtappes dyrene. Etter koagulering av blodet frafiltreres serum fra blodkaken og utvinnes.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til isolering og ytterligere rensning av det placentaspesifikke protein PP^, idet placenter ekstraheres med en vandig saltoppløsning, ekstraktet blandes med en oppløsning av diaminoetoksyakridinlaktat, adskilles fra utfellingen, det i det overstående gjenblivende diaminoetoksyakridinlaktat utfelles med natriumklorid, det overstående blandes med ammoniumsulfat, utfellingen adskilles, oppløses i vann, dialyseres mot en puffer av pH 7 og den dialyserte oppløsning sentrifugeres og anrikes eventuelt ytterligere, karakterisert ved at denne oppløsning ved en pH-verdi mellom 4 og 9 bringes i berøring med et på en uoppløselig bærer bundet antilegeme mot PP^, adskiller bæreren som inneholder bundet PP,-fra den flytende fase og til utløsning av PP^ behandler med et vandig medium av pH-verdi 2-4 eller med en oppløsning av et stoff som dissosierer en proteinbinding ved en pH-verdi på 4-9 og renser med i og for seg kjente isoleringsfremgangsmåter etter immunadsorpsjonen inntil en renhet på over 99%.