DE2630753A1 - Mittel mit affinitaet zu hepatitisvirus - Google Patents

Mittel mit affinitaet zu hepatitisvirus

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DE2630753A1 DE19762630753 DE2630753A DE2630753A1 DE 2630753 A1 DE2630753 A1 DE 2630753A1 DE 19762630753 DE19762630753 DE 19762630753 DE 2630753 A DE2630753 A DE 2630753A DE 2630753 A1 DE2630753 A1 DE 2630753A1
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Description

Die Erfindung betrifft Mittel, die eine Affinität zu Hepatitisvirus besitzen sowie Verfahren zur Entf ernung/Konzentiierung von Hepatitisvirus aus Gemischen, enthaltend biologisches Material.
Hepatitisvirus B, auch bekannt als Serumhepatitis, wird verbreitet durch biologisches Material wie Blut, Plasma, Serum, Urin und Stuhl. Hepatitis B kann so verbreitet werden durch Plasuiafraktionen, die für therapeutische Zwecke angewandt werden. Es kann auch in Abwasser und anderen Abfällen vorhanden sein, umfassend biologisches Material in ausreichender Menge um die Krankheit zu verbreiten.
Hepatitisvirus B kann nachgewiesen werden durch immunologische Verfahren, beruhend auf der Struktur des Virenoberflächeiiantigens ΉΒ Ag, das bekannt ist als Australia-Antigen, Au-Antigen.
*) (viral surface antigen)
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L INSPECTED
üei eier Entwicklung des erfindungs gemäß en Verfahrens
wurden zum Nachweis des Antigens die folgenden Methoden angewandt :
Ausria II 125, Analyseneinheit zur Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen, Abbott Laboratories, Worth Chicago,USA;
Hepanosticon, Analyseneinheit zur Durchführung umgekehrter Hämagglutinationsveriahren, Organon, Oss, Holland; Immunodiffusion, ID, Berg et al., Vox Sang. Band 22 (1972) Seite 1;
Immunoelektro-Osmoforesis, IEOP, Hansson und Johnsson, Vox Sang. Band 21 (1971), Seite 531.
Bei der Anwendung zur Untersuchung von Blutproben besitzt der Ausriatest die höchste Empfindlichkeit, aber zur Untersuchung von Fraktionen von biologischem Material nimmt die Genauigkeit bei der Bestimmung der Wirkung der durchgeführten Stufen zu, wenn v/eitere· Tests unter Anwendung eines anderen Bestimmungssystems durchgeführt werden.
v7enn man in der klinischen Praxis nur auf anerkannte Blutspender zurückgreift, die auch bei dem empfindlichsten Bestimmungsverfahren Hepatitis-negativ sind, ist es möglich, die Gefahr einer Hepatitisübertragung wesentlich herabzusetzen. Um dies zu erreichen, wird ein wesentlicher Teil der verfügbaren Blutmenge nicht ausgenutzt und Substanzen, die für eine industrielle Technologie geeignet sind sowie ein Verfahren, das zur industriellen Plasmafraktionierung zur selektiven Entfernung von Hepatitisvirus geeignet ist, sichert eine bessere Versorgung der Krankenhäuser bezüglich Blutserum, Plasma und Plasmafraktionen.
Obwohl die Empfindlichkeit der Bestimmungen wesentlich verbessert wurde durch die radioimmunologischen Verfahren, bleibt noch die Gefahr, daß Hepatitis im Blut und Plasmafraktionen auch dann vorhanden ist, wenn man ein
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negatives Untersuchungsergebnis erhält. Eine Konzentrierung von iuepatitisvirus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren macht eine Untersuchung hochkonzentrierter Proben möglich, wodurch die Genauigkeit des angewandten Bestinmungsverfahrens für Hepatitis wesentlich verbessert wird.
Auf einem Treffen der American Chemical Society im August 1972 in New York, USA, zeigten S.E. Charm und B.L. Wong ein Verfahren zur Entfernung von Hepatitisvirus aus Blutplasma mit Hilfe von Ziegenantikörpern gegen Hepatitisvirus. Diese Untersuchung wurde.in Biotechn. Bioeng. Band 16 (1974), Seite 593, veröffentlicht. Eine technische Anwendung dieses Verfahrens ist jedoch stark eingeschränkt durch die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern. Außerdem muß die Gefahr eines Auslaugens von immunogenem Material aus dem Antikörperträger in Betracht gezogen werden, wenn das Verfahren auf die Fraktionierung von Plasma menschlichen Ursprungs angewandt werden soll und die entstehenden Plasmafraktionen in Krankenhäusern angewandt werden sollen.
Die erfindungsgemäßen Mittel und das Verfahren besitzen nicht die Nachteile des bekannten Verfahrens. Die Substanzen sind leicht verfügbar zur Herstellung im technischen Maßstab unter Anwendung an sich bekannter Verfahren. Sie erfordern kein immunogenes Material. Ihre Affinität gegenüber Hepatitisvirus ist hoch und spezifisch und die Reaktion zwischen den Substanzen und dem Hepatitisvirus ist schnell und irreversibel, sodaß nicht die Gefahr eines Auslaugens bei der Handhabung der neuen Mittel besteht, nachdem Hepatitisvirus daran gebunden ist.
Die erfindungsgemäßen Mittel umfassen ein wasserdurchlässiges Matrixmaterial, z.B. ein wasserunlösliches Gel in Form von hochmolekularen Kohlenhydraten oder Kunststoff materialien, enthaltend - gegebenenfalls durch ein
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(spacer)
Bindeglied, in der Matrix eingebaut - einen hydrophoben Liganden, bestallend aus einer Kohlenstoff kette von mehr als 7 Kohlenstoffatomen oder einem kondensierten Ringsystem.
Die aktiven Substanzen der erfindungsgemäßen Mittel werden erhalten durch Kupplung des betreffenden Liganden an sin gelbildendes Matrixmaterial.
Alle der untersuchten kovalenten Bindungen
- O -C -NH- ; -0-0"-NH-NH-;
11 Jl
NH
-NH - (CH2)2_6 - NH - ; - C - O - NH - ; - NH - CO -
erwissen sich als gleichwertig und streng untergeordnet*) der Struktur des Liganden für die Durchführbarkeit des
Verfahrens.
Auch die Art des wasserdurchlässigen Matrixmaterials, z.B. Polyamidkunststoffe "wie Polyacrylamid, Kohlenhydrate wie Cellulose, Agarose - gegebenenfalls vernetzt durch
Bis-epoxid, Glutardialdehyd, Divinylsulfon, Dibrompropanol, Epiehlorhydriii - ist von geringerer Bedeutung gegenüber
dem Liganden.
In hohem Maße bestimmendfür die Affinität zu
Hepatitisvirus ist der hydrophobe Charakter des Liganden wie durch die folgenden Tabelle gezeigt wird, die die
Untersuchungen zur Entfernung von Hepatitisvirus aus
menschlichem Plasma, das mit Hepatitisvirus infiziert ist, zusammenfaßt.
Tabelle
Bindung von Hepatitisvirus aus stark Au-positivem menschlichem Plasma
*) (von geringerer Bedeutung)
../5 609883/1314
Wie aus der Tabelle hervorgeht, wurde das gleiche Matrixmaterial angewandt und nur der Ligand variiert.
Die Affinität von Hepatitisvirus zu den Mitteln wurde bestimmt durch die oben angegebenen immunologischen Bestimmungsverfahren. 3ine starke und vollständige Bindung von Hepatitisvirus an ein Mittel wird als " - " bezeichnet, was bedeutet, daß kein Hepatitisvirus in der Plasmaprobe nach der Behandlung nachweisbar ist. Die Bezeichnung " + " bezeichnet uii\«;esentliche verbleibende Mengen an Hepatitisvirus in der Plasmaprobe, " ++ ' bezeichnet unveränderte oder leicht verringerte Mengen an Au-Antigen in der Plasmaprobe nach der Behandlung.
Ligand/Kohlenstoffkette
Die Matrix bei dieser Versuchsreihe war Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden)
-Hexylamin -Glycyl-no rleuc in -Glycyl-DL-phenylalanin -Cyclopentylamin -Cycloheptylamin -Phenyläthylamin
-Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Benzoesäure
-Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Heptansäure
-Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-Bernsteinsäure
-Hexamethylen-diamin (Bindeglied)-■Phtalsäure
Au-Antigen in der Plasmaprobe nach der Behandlung
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-Gotylamin -
-Dscyiaixin -
-DDdecylamin «Ostadecylainin
-Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Octyl-
büi'-nsteinsäure
-Cysteamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Baispiel 11)
-Hexamethylendiamin (Binde sglied) -iiaphtyle ssigsäure
(3-3ispiel 12)
-Hexamethylendiamin (Bindeglied)-Cholesterin- hydrogensuccinat (Beispiel 13)
-Hexamethvlendiarain (Bindeglied)-Chol-säure
(Beispiel 14)
DiG Matrix in dieser Reihe war Sepharose 4B, die auf
verschiedene Weise vernetzt v/ar
-Äthylendiainin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure
(Beispiel 1)
-BMtylenaiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäure (Beispiel 1)
-Haxamethylendiamin (Bindeglied)-Octylbernsteinsäare (Beispiel 1)
-Hjxamethylendiamin ( Bindeglied)-Dodec3rlbern- stsinsäure (Beispiel 2)
-Caprylhydrazid (Beispiel 3) -
-Tstradecylamin (Beispiel 6) -
-(2-iUnino-dodecan) (Beispiel 7)
-Äthylendiarain (Bindeglied)-Undeceen-IO-säure
(Beispiel 8)
Die Matrix in dieser Reihe war Polyacrylamid (Bio-Rad,
Richmond, Calif., USA
-Propylen (Bindeglied)-Decylamin (Beispiel 10) -
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
näher erläutert:
../7
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Beispiel 1 Entfernung von Au-Antigen..aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-(Äthylendiamin-Octylbemsteinsäurej-Konöugate
Herstellung des Gelderivats
Die Aktivierung von Sepharose wurde durchgeführt durch vorsichtiges Waschen von 100 ml entsprechend sedimentierter Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals? Uppsala, Schweden) mit Wasser,, Die überschüssige Flüssigkeit wurde anschließend abgesaugt, bevor das Gel in eine Lösung von 4 g Cyanogenbromid in 100 ml destilliertem Wasser gegeben wurde. Mach 15 Minuten langer Gleichgewichtseinstellung*) unter Rühren und I5iskühlung wurde die Gelsuspensiony? Minuten bei einem pH-wert von 11,0 aktiviert . Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4m Natriumhydroxidlösung konstant gehalten.
Zur Kupplung mit Äthylendiamin wurde das aktivierte Gel auf einem Glasfilter mit kalter 0,5m Natriumbicarbonat-Carbonatlösung pH 958 gewaschen, bevor es in eine Lösung von 10 g Äthylendiamin in 100 ml destilliertem Wasser, deren pH-Wert mit Hilfe von konz. Salzsäure auf 9»8 eingestellt war, gegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das entstehende Gelprodukt wurde gründlich gewaschen.
25 ml der wäßrigen Suspension des entstehenden mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden in 20 ml Dioxansuspendiert. Eine frische Lösung von 6 g Octy!bernsteinsäureanhydrid in 60 ml Dioxan wurde unter Rühren bei Raumtemperatur zugetropft. Der pH-Wert wurde durch Zugabe einer verdünnten Natriumhydroxidlösung zwischen 7,5 und 8 gehalten. Das Adsorptionsmittel wurde gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (2:1), Wasser, 1m Natriumchloridlösung und •einem Puffer, bestehend aus 0,05m Iris, 0,02m Natriumcitrat und 0,10m Natriumchlorid pH 7,5 gewaschen. Dieser Puffer wird im folgenden als Testpuffer bezeichnet. *) (Äquilibrierung)
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Die Ausbeute an Kupplungsprodukt (coupling yield), bezogen auf Octylbernsteinsäure, wurde durch das protonmagnetische Resonanzspektrum (HA 100) bestimmt und erwies sich als 4,8 ?o.
1,4-Diaminobutan und 1,6-Diaminohexan können mit entsprechenden Ergebnissen anstelle von Äthylendiamin verwendet werden.
Au-Antigentest
Eine zusammengegebene Menge (pool) von Au-Antigen positivem Plasma mit einem Titer von 1:64,entsprechend IEOP und 1:32 entsprechend ID, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Titerwerte sind im Verhältnis zu einem Standard-Antigen angegeben.
Zu jedem von 6 Prüfröhrchen wurden 2 ml Au-Antigen positives Plasma und 2 ml einer Suspension von 3 Teilen gründlich sedimentiertem Adsorbens, das mit Testpuffer äquilibriert war, und einen Teil des gleichen Puffers gegeben. Die Proben wurden 1, 2, 5, 10, 20 bzw. 30 Minuten bewegt und die Gele durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden auf Au-Antigen untersucht und erwiesen sich entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.·
Beispiel 2 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-(Hexarnethylendiamin-Dodecylbernsteinsäure)-Kon jugate
Herstellung des Gelderivats
Zur Vernetzung von Sepharose wurden 100 ml des Gels mit 2 ml Epichlorhydrin und 0,5 g Natriumborhydrid vermischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 6O0C stark gerührt. Das Gel wurde gründlich mit warmem Wasser gewaschen und·mit einer Lösung von 0,25 g Natriumborhydrid in 50 ml 2m Natriumhydroxidlösung vermischt. Das Gemisch wurde
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1 Stunde im Autoklaven auf 1200C erhitzt. Das Gel wurde anschließend mit einer alkalischen ilatriumborhydridlösung gewaschen. Es wurde konz. Essigsäure langsam zugegeben bis der pH-Wert des Gemisches 4 betrug. Schließlich wurde das Gel mit reichlich Wasser gewaschen. .
Die Herstellung des Sepharose-Hexamethylendiamingels erfolgte entsprechend Beispiel 1.
25 rnl des entstehenden mit dem Bindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan-Wasser (2:1) gewaschen und anschließend trocken gesaugt . und in eine frische Lösung von 1 g Dodecylbernsteinsäure,1,5 g wasserlöslichem Carbodiimid, N-Cyclohexyl-N' -£~ß- (N-me thylmorpholino-äthyl )__7-carbodiimid-p-toluol-sulfonat in 60 ml Dioxan-Wasser (2:1) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, bevor es auf einen Glasfilter gegeben und gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (2:1), 1m Natriumchloridlösung, Wasser und dem Testpuffer gewaschen wurde.
Die Ausbeute an Kupplungsprodukt in Werten für die angewandte Fettsäure wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA 100) bestimmt und ergab sich als 2 %,
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Eine Säule (D = 1,6 H = 1,0 cm) wurde mit dem^Testpuffer äquiiibrierten Gel gepackt. 7 ml des Au-Antigens positivem Plasmas wurden in Kontakt mit dem Gel gebracht, wobei 5 ml/h hiiidurchflossen. Der Testpuffer wurde zugegeben (zugepumpt) bis kein Proteinmaterial mehr eluiert wurde, was durch UV-Untersuchung nachgewiesen wurde. Das gesammelte Eluat war nach ID, IEOP und Hepanosticon negativ. Durch Druckdialyse wurde das Eluat 10-fach konzentriert und war bei den Hepatitistests immer noch negativ.
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../10
- 1ü -
Beispiel 3 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-Caprylhydrazid-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Äthylcaprylat wurde durch Hydrazinolyse in. das entsprechende Hydrazide umgewandelt. 10 ml des Äthylesters wurden mit 1ü ml 98-;&Lgem Hydrazinhydrab vermischt. 22 ml Äthanol wurden als Lösungsmittel zugegeben bis das Reaktionsgemisch klar wurde und anschließend wurde die Lösung 15 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das kristallisierende Hydrazid wurde abfiltriert, mit Eiswasser und wäßrigem Methanol (1:1) von Raumtemperatur gewaschen.
Die Sepharose 4B wurde entsprechend Beispiel 1 aktiviert.
Das Gel wurde mit einer Lösung des Kupplungsmittels gewaschen und vakuumfiltriert. Die Kupplung wurde erreicht durch Überführung des aktivierten GsIs in 100 ml einer gesättigten Lösung von Caprjrlhydrazid in Dimethylformamid (DMF)-0,2m IJatriumbicarbonat (1:1). Der pH-Wert wurde während der Kupplungsreaktioii, die innerhalb von 15 Stunden bei Raumtemperatur stattfand, unverändert gelassen. Das enstehende Produkt wurde gründlich mit DMF, DMF-Wasser (1:1),1m-Natriumchloridlösung, Wasser und Testpuffer gewaschen.
Die Ausbeute an Kupplungsprodukt, bezogen auf Hydrazid wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA100) bestimmt und ergab sich als 2,3 %»
Au-Antigente st
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128, entsprechend ID und IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Zu 2 ml einer Suspension, bestehend aus 3 Teilen sorgfältig sedimentiertem Adsorbens, äquilibriert mit dem Test-
609883/13U ../11
puffer -und einem Teil des gleichen Puffers, wurden 2 ml Au-Antigen positives Plasma gegeben. Das Gemisch wurde 30 Hinuten leicht bewegt und das Gel durch Zentrifugieren abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit war Au-Antigen negativ, entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon.
Beispiel 4 Entfernung von Au-Antigen von einer Albuminlösung durch Adsorption an Sepharose-fÄthylendiamin-OctjrlbernsteinsaurefKonjugat
Herstellung des Gelderivats
Das Gelkonjugat wurde, entsprechend Beispiel 1 hergestellt.
Au-Antigente st
Eine Au-Antigen positive Albuminlösung, Titer 1:64, entsprechend ID und IEOP, die erhalten worden war durch Fraktionierung von Au-Antigen positivem Plasma, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich, entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon,als negativ.
Beispiel 5 Entfernung von Au-Antigen aus einem Coagulationsfaktor-Konzentrat durch Adsorption an Sepharose-(Athylendiamin-Octylbernsteinsäure)-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Das Gelkonjugat v/urde entsprechend Beispiel 1 hergestellt.
Au-Antigentest
Ein Au-Antigen positives Plasma wurde zur Fraktionierung eines Konzentrats, enthaltend die Coagulationsfaktoren II, VII, IX und X, angewandt. Eine 1-%ige Proteinlösung wurde hergestellt und es zeigte sich, daß sie einen Au-Antigentiter von 1 :'32 entsprechend ID besaß. Auf einen
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../12
~ 12 -
Glasfilter, enthaltend ein Bett von 5 ml des Gelder!vats, das mit dem Testpuffer äquilibriert war, wurden 10 ml der zu untersuchenden Proteinlösung gegeben und das Gel mit 3 x 5 ml des Testpuffers gewaschen. Die Eluate wurden auf Au-Antigen,entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon, untersucht. Sie erwiesen sich als negativ.
Beispiel 6 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-Tetradecylamin-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Sepharose wurde entsprechend Beispiel 1 aktiviert.
Für die Kupplungsreaktion wurden 100 ml mit Cyanogenbromid aktivierter Sepharose, die mit 95 % Äthanol äquilibriert und durch Absaugen getrocknet v/orden war, . . zu einer Lösung von 22 g Te trade cylainin in 100 ml 95-%igem Äthanol gegeben. Das Gemisch wurde 43 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gel wurde gründlich mit v/armem 95-/oig©n Äthanol, wäßrigem Äthanol (1:1), 1m Natriumchloridlösunc, V/asser und Testpuffer gewaschen. Die Ausbeute der Kupplungsreaktion wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA100) bestimmt und ergab sich als 4,3 %.
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128 nach ID und IEOP wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Auf einen Glasfilter, enthaltend ein Bett von 10 ml des Gelderivats, äquilibriert mit dem Testpuffer, wurden 35 ml Plasma gegeben. Das Material wurde mit 3 x 10 ml Testpuffer gewaschen und die Eluate auf Au-Antigen untersucht. Sie erwiesen sich nach ID, IEOP, Hepanosticon und Ausria als negativ.
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../13
Beispiel 7 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an 5epharose-(2-Amino-dodecan)-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
2-Dodecan wurde durch Umsetzung mit Hydroxylamin unter Bildung des Oxiras und anschließende katalytische Hydrierung und Eliminierung von V/asser in das entsprechende Amin umgewandelt. Die angewandte Sepharose wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.
Zur Kupplung wurden 100 ml mit Cyanogenbromid aktivierten G'els, das mit 95-/oigem Äthanol gewaschen und durch Absaugen getrocknet worden war, zu einer Lösung von 10 g 2-Amino-dodecan in 100 ml 95-/*>igem Äthanol gegeben.
Das Gemisch wurde 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend gründlich mit v/armem 95->;oigem Äthanol, wäßrigem Äthanol (1:1), 1m liatriumchloridlösung, Wasser und Testpuffer gewaschen.
Die Ausbeute an Kupplungsprodukt wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA100) bestimmt und ergab sich zu 1 %.
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128 nach ID und IJiIOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt und die überstehende Flüssigkeit erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.
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Beispiel 8 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Sepharose-(Athylendiaminündecen-1Q-säurefKonjugat
Herstellung des Gelderivats
Das Sepharose-Äthylendiamin wurde entsprechend Baspiel 1 erhalten.
Zu einer frischen Lösung von 1,85 g Undecylensäure und 2,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Dioxan wurden 100 ml Sepharose-Äthylendiamiri-Konjugat nach Äquilibrieren mit Dioxan und Vakuumfiltration zugegeben. Die Gelsuspension wurde 15 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur stehengelassen, mit Dioxan, Dioxan-Wasser (1:1), 1m Natriumchloridlösung und Testpuffer gewaschen.
Die Kupplungsausbeute, bezogen auf die Fettsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz (KA100) bestimmt und ergab sich zu 2,3 %.
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128 nach ID und IJiiOP, v/urde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Es zeigte sich, daß die überstehende Flüssigkeit entsprechend ID, IBOP und Hepanosticon Au-Antigen negativ war.
Beispiel 9 Entfernung von Au-Antigen aus Plasrninogenkonzentrat durch Adsorption an ßepharose-Caprylhydrasid-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Das Gelderivat wurde entsprechend Beispiel 3 erhalten.
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Au-Antigente st
Zu 2 ml einer Plasminogenlösung wurden 0,5 ml stark Au-positives Plasma gegeben und das Gemisch war stark Aup'ositiv nach ID und Ausria. Das Gemisch wurde durch eine /+-cm-Säule geleitet, die mit 10 ml Gelkonjugat beschickt war, das mit Testpuffer äquilibriert war. Die Fraktionen wurden gesammelt und untersucht. Das plasminogenhaltige Eluat erwies sich nach ID und Ausria als negativ.
Beispiel 10 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch Adsorption an Polyacrylamid-(Propylen-Decylamin)-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Polyacrylamid, Biogel P 300 (Bio-Rad, Richmond, Calif., USA) wurde in Wasser gequollen und gründlich mit 0,05 m Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen. Für die Aktivierung wurden 20 ml der Gelsuspension in Puffer (0,5 trockenes Gel/25 ml Puffer) mit 5,0 ml Glutardialdehyd vermischt und 18 Stunden bei 370C inkubiert. Anschließend wurde das Gel gründlich mit Dioxan, Dioxan-Wasser (3:2), Wasser und Testpuffer gewaschen.
Au-Antigente st
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:128 nach ID und IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Der Versuch wurde entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit erwies sich bei der Untersuchung entsprechend ID, IEOP und Hepanosticon als Au-negativ.
Beispiel 11 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma .durch Adsorption an Sepharose-(Cysteamin-Octylbernsteinsäure-)Konjugat
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Herstellung des Gelderivats
Das Sepharose-Cysteamin wurde erhalten durch Reduktion von Sepharose-Cystamin, das entsprechend Beispiel 1 hergestellt worden war, mit 0,05 m i-'iercaptoäthanol in 0,1 m Carbonatpuffer pH 8,5 innerhalb einer Stunde. Das Gel wurde ausgiebig mit dem Carbonatpuffer, Wasser und schliei31ich mit Dioxan gewaschen. Zu einer Lösung von 1,2g Octylbernsteinsäure in 40 ml Dioxan wurde eine Lösung von 1,84 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dioxan und 25 ml Sepharose-Cysteamin zugegeben, wach 2-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden weitere 1,84 g Dicyclo-hexylcarbodiimid zugegeben. Zwei Stunden später wurde das Gel mit Dioxan gewaschen. Die Reaktion wurde wiederholt und anschließend ausgiebig mit Dioxan,- Dioxan-Wasser, V/asser und 0,1m Carbonat pH 8,5 gewaschen. Die verbleibende Thiolgruppen wurden durch Behandlung des Gels mit 60 mg jodacetamid innerhalb von 45 Minuten blockiert. Schließlich wurde das Gel mit dem Testpuffer gewaschen.
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:32 nach ID, wurde als Ausgangsmaterial angewandt= Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies"sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.
Beispiel 12 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-(Hexamethylen-diamin-Naphtyl-1 -essigsäur e)-Konjugat
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Herstellung des Gelderivats
Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.
25 ml des entstehenden mit dem.Bindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan-V/asser (3!2) gewaschen und durch Absaugen getrocknet und zu einer frischen Lösung von 1,1 g IJaphtyl-1 -essigsäure in 30 ml Dioxan-Wasser (3:2) gegeben. Zu der Gelsuspension wurden 2,65 g wasserlösliches CarboaiiniidjN-Cyclohexyl-N8-/""ß-(N-me thylmorpholinoäthyl )__7-car'DOQ-iimid—p-toluolsulfonat unter Rühren zugegeben und anschließend der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 4,3 eingestellt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur wurden 2,65 g wasserlösliches Carbodiimid nochmals zugegeben. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde unter Rühren stehengelassen und anschließend auf einen Glasfilter gegeben und gründlich mit Dioxan, Dioxan-V/asser (3:2), 1m Natriumchloridlösung, Wasser und dem Testpuffer gewaschen.
Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Naphtyl-1-essigsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA1OO) bestimmt und ergab sich zu 3 %»
Au-Antigentest
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:32 nach ID und Titer 1:64 nach LtiOP wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde entsprechend Beispiel 3 ansatzweise durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.
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Beispiel 13 .entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-{Hexametliylen-diamin-Cholesterin-hydrogen-succinai^-Konjugat
Herstellung des Gelderivats
Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.
20 ml des mit dem Eindeglied versehenen Gels wurden auf einen Glasfilter gegeben und mit Dioxan,10 % Triäthylansin in Dioxan und wieder mit Dioxan gewaschen und anschließend trocken gesaugt und au einer frischen Lösung von 0,5 g Chclesterinhydrogen-succinat in 25 ml Dioxan gegeben. Die Reaktion wurde eingeleitet durch Zugabe von 0,35 g Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dioxan. Die Kupplung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach 2 Stunden wurde eine weitere Menge Carbpdiiniid zugegeben und weitere 2 Stunden später wurde das gekuppelte Gel ausgiebig mit Dioxan, Dioxan-Wasser, V/asser und schließlich mit dem Testpuffer gewaschen.
Au-Antigente st
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:64 nach ID und 1:128 nach IEOP, wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzweise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sichmch ID, IEOP und Hepanosticon als negativ.
Beispiel 14 Entfernung von Au-Antigen aus Plasma durch
Adsorption an Sepharose-(Hexamethylen-diamin-Cholsäure)-Konöugat
Herstellung des Gelderivats
Das Sepharose-Hexamethylendiamin wurde entsprechend Beispiel 1 erhalten.
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Die Kupplung von Cholsäure an das mit dem Bindeglied versehene Gel wurde entsprechend Beispiel 13 durchgeführt mit der Ausnahme, daß 0,5 g Cholsäure in 100 ml Dioxan gelöst wurden.
Die Kupplungsausbeute, bezogen auf Cholsäure, wurde durch protonenmagnetische Resonanz (HA100) untersucht und ergab sich zu 5)8 /o.
Au-Anti g e nt e s t
Au-Antigen positives Plasma, Titer 1:32 nach ID wurde als Ausgangsmaterial angewandt. Die Adsorption wurde ansatzv/eise entsprechend Beispiel 3 durchgeführt. Die . überstehende Flüssigkeit wurde auf Au-Antigen untersucht und erwies sich nach ID-y IEOP und Hepanosticon als negativ.
../Patentansprüche
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Claims (5)

  1. Patentansprüche
    Pi J Mittel mit Affinitä-b zu Hepatitisvirus, bestehend aus einem wasserdurchlässigen Matrixmaterial, das ein Bindeglied (spacer) enthalten kann und an das ein hydrophober Ligand gekuppelt ist.
  2. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine kovalente Bindung gebildet wird durch eine Gruppe der Formel
    - O - C - NH - ;
    NH
    - O - C - NH - NH - ;
    Il
    NH
    NH - (CH2)2_6 -NH; - C - NH - ; - NH - CO - .
  3. 3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasser-permeable Matrixmaterial ein hochmolekulares Kohlenhydrat oder ein Polyamid ist, vorzugsweise vernetzt mit Bis-epoxid, Glutardialdehyd, Divinylsulfon, Dibrompropanol oder Epichlorhydrin.
  4. 4. Mittel nach Anspruch 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet , daß der hydrophobe Ligand in Form einer Kohlenstoffkette mit mehr als 7 Kohlenstoffatomen oder eines kondensierten Ringsystems vorliegt.
  5. 5. Anwendung der Mittel nach Anspruch 1 bis 4 zur Entfernung und/oder Konzentrierung von Hepatitisvirus aus biologischem Material.
    6231
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