CS223818B2

CS223818B2 - Means for afinity for the jeundice virus

Info

Publication number: CS223818B2
Application number: CS764537A
Authority: CS
Inventors: Lars-Olov Andersson; Hakan G Borg; Gudrun M Einarsson
Original assignee: Kabi Ab
Priority date: 1975-07-09
Filing date: 1976-07-08
Publication date: 1983-11-25
Also published as: NO148339C; FI55868B; DE2630753C2; IE43952L; FI761997A; AU1568476A; AT355215B; IE43952B1; DK308476A; GB1531558A; AU510068B2; ATA500576A; NZ181384A; PL191019A1; FI55868C; US4168300A; NL7607647A; NO148339B; PL105363B1; IL49752A

Description

Předmětem vynálezu jsou prostředky s afinitou pro virus hepatitidy, vyznačující se tím, že sestávají z matrice, propustné pro vodu, obsahující včleněný spacer, která je tvořena buď vysokomolekulárním uhlohydrátem jako celulózou, agarózou nebo polyamidovou plastickou hmotou, jako je polyakrylamid, s výhodou zesítěné bisepoxidem, glutardialdehydem, divinylsulfonem, dibrompropanolem nebo epichlorhydrinem, přičemž na tuto matrici je navázaná hydrofobní sloučenina jako ligand kovalentní vazbou některou z následujících skupin:

—O—C—NH—, II NH —O—C—NH—NH—,

NH —NH—(CH₂)₂__Ó—NH—, —C—NH—, —NH-CO—.

Vynález se týká prostředku s afinitou pro virus žloutenky.

^Virus žlouten^{ky typ} B, známý jako vmus sérové hepatitidy je . rozšířen v biologickém materiálu jako krvi, plazmě, séru, moči a výkalech. Tento virus se může šířit při používání plazmy k léčebným účelům a může být také přítomen v odpadních vodách a dalších materiálech, které obsahují biolo^gic^ké lá^tky v ^dosta^tečném množství a^bymohlo dojít k rozšíření choroby.

Virus hepatitidy typ B je možno zjišťovat imunologickými metodami vzhledem ke struktuře povrchového antigenu viru, HBsAg, přičemž tento antigen je rovněž znám jako australský antigen, Au-antigen.

Způsoby zjišťování Au-antigenu jsou prozatím tyto:

Ausria II 125, sestava pro radioimunologické stanovení, Abbott Laboratories North Chicago, USA.

Hepanosticon, sestava pro hemaglutinační stanovení, Organon, Oss, Holandsko.

Immunodiffusion, ID, Berg et al., Vox Sang. sv. 22 (1972) str. 1.

Immunoelectro-osmoforesis, IEOP, Hansson a Johnsson, Vox Sang. sv. 21 (1971), str. 531.

Při zkoumání krevního vzorku má největší citlivost sestava Ausria, avšak při zkoumání biologických materiálů, při němž je· zapotřebí provádět ještě další pomocné stupni stoup^á se zvetaováním počtu Úclito stupňů přesnost ostatních systémů ve srovnání s uvedeným systémem.

V případě krevních dárců, z nichž se přijímají pouze ' ti, kteří jsou dlouhou dobu negativní při použití nejcitlivějších zkoušek je možno snížit nebezpečí _ žloutenky podstatnou měrou. V případě, že se rozlišování provádí tímto způsobem, však není použito velké množství odebrané krve. Z toho vyplývá, že by bylo velmi žádoucí nalézt prostředky, vhodné pro běžné použití při ' odběru velkých množství krve i průmyslový způsob frakcionace plazmy, při němž by docházelo k selektivnímu odstraňování viru hepatitidy a tím i ke kvahtnějším ^do^dávkám krve do nemocnic, což se týká i krevních složek, jako je sérum, plazma a jednotlivé frakce plazmy.

I když citlivost známých zkoušek byla podstatně zlepšena použitím radioimunologlckého způsobu, stále zůstává nebezpečí hepatitidy i v těch zkouškách, u nichž bylo dosaženo negativního výsledku. Při konce-ntrarn viru hepatitidy . z^půso^bem ^po^dle vynálezu dochází ke zkouškám, které se provádějí na vysoce koncentrovaných vzorcích, čímž se zvyšuje přesnost stanovení viru he^tftidy’.

V Američan Chemical Society, srpen 1972 New York, USA, S. E. Charm a B. L. Wong uvedli způsob izolace žloutenkového viru z krevní plazmy při použití kozích protiláte^{k p}roti. tomuto viru. Ú^plná ^pu^blikacc· b^y ^la uveřejněna v Biotecři. ' Bⁱoeng^, sv. IQ (1974) str. 593. Použití tohoto způsobu v technickém měřítku je omezeno omezenou možností dodávky protilátek. Mimoto je nebezpečí průniku imunogenního materiálu z protilátky, protože způsob je jinak adaptován na frakcionaci plazmy lidského původu a výsledná plazma má být užita v nemocnicích.

Složky prostředku podle vynálezu _ jsou velmi snadno dostupné a vyrábí se v techtoctám meřhku zn^ámýmⁱ syntetic^kými způsoby. Neobsahují imunogenní materiál, jejich afinita pro virus hepatitidy je vysoká a specifická a reakce mezi těmito látkami a virem hepatitidy je rychlá a iroverzibilní, , takže . nevzniká žádné . riziko při zacházení s těmito prostředky, jakmile dojde k vazbě viru hepatitidy. )

Předmětem vynálezu jsou prostředky s afinitou pro virus hepatitidy, vyznačující se tím, že sestávají z matrice, propustné pro vodu, obsahující včleněný spacer, která je ^tvo^řena ^bud vysokornolelkulárním uúofydrátem jako celulózou, agarózou nebo polyamidovou plastickou hmotou, jako je polyakrylamid, s výhodou zesítěné bisepoxidem, glutardialdehydem, divinylsulfonem, di^brom^pro^pano^íem ne^bo e^pichlor^hydrinem, přičemž na tuto matnici je navázaná hydrofobní sloučenina jako ligand kovalen-tní vazbou některou z následujících skup ‘ n:

—O—C—NH—,

NH ' — O—C—NH—NH—, II ·

NH

-NH-(CH₂)₂_₆-NH—C—NH—, —NH—CO—.

^Účinn^á lát^ka ^pro prostředty ^po^dle vyn^álezu se získá tak, že se naváže lignad na · mateři^ ^který tooří ^getovou matricň

Spacer, .zajišťující vzdálenost mezi částicemi matri^c^e, může obsahovat na^pr^íkla^d n^á•sleeující kovalentní vazby:

—O—C—NH—,

NH —O—C—NH—NH—,

II

NH — NH-(CH2)2-6-NH—, —C—O—NH—.

—NH—CO—.

Materiálem pro matrici, propustnou pro.

vod^ mů^že být na^př^íkla^d ^tyami! jako polyakrylamid, nebo uhlohydrát jako celu223813

Ligand/uhlíkový řetězec Au-intigen ve vzorku plazmy po zpracování lézá nebo agaróza, popřípadě se vznikem příčných můstků vytvořených bis-epoxidem, dialdehydem kyseliny glutarové, d vinylsulfonem, dibrompropanolem, epichlorhydrinem apod.

Vysoce žádoucí vlastností je hydrofobní charakter lignadu, jehož vliv na izolaci v ru hepatitidy je shrnut v následující tabulce, která uvádí výsledky, dosažené při odstraňování viru hepatitidy z plazmy lidí s hepatitidou.

V tabu.lco se uvádějí výsledky zjišťování viru hepatitidy v lidské plazmě, která byla vysoce Au-pozitivní. Při stanovení bylo užito vždy téže matrice, změny byly pouze ve složení spacer.

Afinita viru hepatitidy pro takto získané prostředky byla stanovena pomocí imunobiologických zkoušek. V tabulce je uvedeno silné a úplné navázání viru hepatitidy na prostředek jako —, to znamená, že po zpracování plazmy tímto prostředkem již nebylo možno imunologickou zkouškou zjistit žádný virus. Označení 4- znamená, že v plazmě zůstalo nevýznamné množství viru hepatitidy. Označení znamená, že v plazmě zůstalo původní množství Au-antigenu nebo bylo toto množství jen o málo sníženo po zpracování prostředkem podle vynálezu. Matricí v tomto případě byla vždy agaróza (Sepharose 4B}.

TABULKA

Ligand/uhlíkový řetězec Au-antigen ve vzorku plazmy po zpracování

hexylamin	4-^!4-
glycylnorleucin	-F4-
glycyl-DL-f enylalanin	4-4-
cyklopentylamin	+4-
cykloheptylamin	4-4-
fenylethy lamin	4-4-
hexamethylendiamm [spacer]
kyselina benzoová	4-4·
hexamethylendiamin (spacer)
kyselna heptanová	4-4-
hexamethylendiamin (spacer)
kysel na jantarová	4-4-
hexamethylendiamm (spacer)
kyselina ftalová	4-'4-
oktylamin	—
decylamin	—
doclecylamtn	—
oktadecylamin	—
hexamethylendiamm (spacer)
kyselina oktyljantarová	—
cystamin (spacer) kyselina
oktyljantarová (příklad 11)	—
hexamethylendiamm (spacer)
kyselina naftyloctová
(příklad 12)	—
hexamethylendiamm (spacer)
kyselý jantaran cholesterolu
(příklad 13)	—

hexamethylendiamm (spacer) kyselina cholinová (příklad 14)—

V dalších příkladech byla materiálem Sepharosa 4B, v níž byly vytvořeny různým způsobem příčné můstky.

ethy lendiamin (spacer) kyselina oktyljantarová (příklad 1)— butylendiamin (spacer) kyselina oktyljantarová (příklad 1)— hexamethy lendiamin (spacer) kyselina oktyljantarová (příklad 1)— hexamethylendiamin (spacer) kyselina dodecyljantarová (příklad 2]— kaprylhydrazid (příklad 3)— tetradecylanrn (příklad 6)—

2-ammododekan (příklad 7)— ethylendiamin (spacer) kyselina undecen-10-ová (příklad 8)—

Materiály pro matrici v posledním pokusu byl polyakrylamid propylen (spacer) decylamin (příklad 10)—

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát Sepharózy ethylendiaminu a kyseliny jantarové

Výroba derivátu gelu

Aktivace přípravku Sepharose byla prováděna tak, že 100 ml dobře sedimentovaného přípravku Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) bylo promyto vodou. Přebytečná kapalina byla odstraněna filtrací za odsávání ještě před tím, než byl gel přenesen do roztoku 4 g bromkyanu ve 100 ml destilované vody. Po 15 minutách stálého míchání a chlazení vodou na pH 11,0 na bodu 6 až 7 minut. Toto pH bylo udržováno přidáváním 4 M roztoku hydroxidu sodného.

К vytvoření konjugátu ethylendiaminu byl aktivovaný gel promyt na skleněném filtru chladným roztokem 0,5 M kyselého uhličitanu sodného a uhličitanu sodného o pH 9,8, načež byl přenesen do roztoku 10 g ethylendiamnu ve 100 ml destilované vody, přičemž pH tohoto roztoku bylo upraveno na 9,8 použitím koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se pak míchá 20 hodin při teplotě místnosti a takto získaný gel se důkladně promyje.

ml vodné suspenze výsledného· gelu se uvede v suspenzi ve 20 ml dioxanu. Pak se po kapkách za stálého míchání při teplotě místnosti přidá čerstvě připravený roztok 6 g anhydridu kyseliny oktyljantarové v 60 ml dioxanu. Hodnota pH se udržuje v rozmezí 7,5 až 8 přidáním zředěného roztoku hydroxidu sodného. Adsorpční činidlo se důkladně promyje dioxanem, směsí dioxanu a vody v poměru 2 : 1, vodou, 1 M chloridem sodným a pufrem, který sestává z 0,05 M TRIS, 0,02 M citronanu sodného a 0,10 M chloridu sodného při pH 7,5. Dále bude tento pufr uváděn jako pufr к provádění zkoušek.

Dosažená míra požadované vazby ve vztahu ke kyselině ethyl jantarové byla sledována protonovou magnetickou rezonancí (HA 100) a bylo zjištěno, že bylo dosaženo vazby na 4,8 %.

Při provádění této reakce je možno se stejným výsledkem užít místo ethylendlaminu 1,4-diaminobutan a 1,6-diaminohexan.

Test na Au-antigen

Směs vzorků plazmy, pozitivní na Au-antigen s titrem 1: 64 podle IEOP a 1 : 32 podle ID byla výchozím materiálem к provádění následujících zkoušek. Titry jsou uvedeny ve vztahu ke standardnímu antigenu.

Do každé ze 6 zkumavek se přidá 2 ml plazmy pozitivní na Au-antigen a 2 ml suspenze, sestávající ze 3 dílů sedimentovaného adsorpčního činidla v pufru к provádění zkoušek a z jednoho dílu téhož pufru. Vzorky se míchají 1, 2, 5, 10, 20 a 30 minut a gel se odstraní odstředěním. Jednotlivé supernatanty se pak zkoumají na přítomnost Au-antigenu. V těchto případech byly všechny vzorky negativní při použití metod ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 2

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát přípravku Sepharose, hexamethylendiaminu a kyseliny dodecyljantarové

Příprava gelu í

Pro tvorbu příčných můstků v přípravku Sepharose se 100 ml tohoto gelu smísí se 2 ml epichlorhydrinu a 0,5 g borohydridu sodíku. Směs se energicky míchá hodinu při teplotě 60 °C. Pak se gel důkladně promyje teplou vodou a smísí se s roztokem 0,25 g borohydridu sodíku v 50 ml 2 M roztoku hydroxidu sodného. Směs se zahřívá v autoklávu hodinu na 120 °C. Pak se gel promyje alkalickým roztokem borohydridu sodíku. Pak ise pomalu přidává koncentrovaná kyselina octová tak dlouho, až pH směsi dosáhne hodnoty 4. Pak se gel promyje velkým množstvím vody.

Další zpracování takto získaného gelu se provádí způsobem podle příkladu 1.

ml výsledného gelu se přenese na skleněný filtr a promyje směsí dioxanu a vody v poměru 2 : 1, načež se zfiltruje za odsávání a přenese do čerstvého roztoku 1 g kyseliny dodecyljantarové, 1,5 g ve vodě rozpustného karbodiimidu, a to N-cyklohexyl-N^l- [ β- (N-methylmorfolinethyl) ] -karbodiimid-p-toluensulfonátu v 60 ml směsi dioxanu a vody v poměru 2 : 1. Směs se míchá hodinu při teplotě místnosti a pak se přenese na skleněný filtr a důkladně se promyje dioxanem, směsí dioxanu a vody v poměru 2:1, 1 M chloridem sodným, vodou a pufrem к provádění zkoušek.

Výsledná hodnota vazby vztažené na použitou alifatickou kyselinu byla stanovena protonovou magnetickou rezonancí (HA 100) a měla hodnotu 2,0 %.

Test na Au-antigen

Plazma, pozitivní na Au-antigen při titru 1: 128 podle ID a IEOP byla výchozí látkou pro následující zkoušky. Sloupec o rozměrech 1,6 χ 1 cm byl naplněn gelem v pufru к provádění zkoušek. Pak se uvede 7 ml plazmy, pozitivní na Au-antigen ve styk s gelem pod tlakem při průtoku 5 ml za hodinu. Pak se pod tlakem sloupcem nechá procházet pufr к provádění zkoušek tak dlouho, až se již nevymývá žádná bílkovina, což se sleduje v ultrafialovém světle. Takto získaný eluát byl negativní při zkouškách ID, IEOP, Hepanosticon. Dialýzou za použití tlaku byl eluát desetkrát koncentrován a příslušné zkoušky byly znovu provedeny s negativním výsledkem.

Příklad 3

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát sepharózy a kaprylhydrazidu

Výroba derivátu gelu

Ethylkarpylá-t byl převeden na odpovídající hydrazid hydrazmolýzou. 10 ml ethylesteru se smísí s 10 ml 98% hydrazinhydrátu. Přidá se 22 ml ethanolu jako rozpouštědla a směs se míchá až do vyčeření a pak se nechá stát při teplotě místnosti 15 hodin. Krystalizující hydrazid se oddělí filtrací a promyje se při teplotě místnosti směsí ledové vody a vodného methanolu v poměru 1: 1.

Přípravek Sepharose 4B byl aktivován stejným způsobem jako v příkladu 1.

Gel se promyje roztokem, který slouží ke tvorbě konjugátu a pak se zfiltruje ve vakuu. Vazby se dosáhne tak, že se aktivovaný gel přenese do 100 ml nasyceného roz toku kaprylhydrazidu ve směsi dimethylform-amidu a 0,2 M ^kyseté^ho uMtóttanu sodného v poměru 1:1. Htánota pH zůstává v ^průbě^hu rea^kce nezměněna. ^Reakční směs se míchá 15 hodin při teplotě místnosti. Výsledný ^pro^du^kt se ^důkla^dn^{ě p}romyje ďmethylformamidem, směsí dimethylformamidu a vody v poměru 1:1, 1 M chloridem sodným, vodou a pufrem k provádění zkoušek.

Míra vazby hydrazidu se stanoví protonovou magnetickou rezonancí ·(HA 100) a je v tomto· ^př^ípadě ^2,3 %.

Test na Au-antigen

Plazma, pozitivní na Au-antigen s titrem 1 : 128 při stanovení ID a IEOP je výchozím materiálem; pro následující zkoušky. Ke 2 ml suspenze, 'seistáviající ze 3 dílů dobře sedimentovaného adsorpčního činidla v pufru ^{k p}rová^děm zkou^še^k a z ¹ díto téhož pu^fru se přidají 2 ml plazmy, pozitivní na Au-antigen. Směs se opatrně míchá 30 m.nut a pa^k se ^ge^l odděH odstře^ním. Zmkaný superna-tant byl negativní na Au-antigen při provádění zkoušek ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 4

Odstranění Au-antigenu z roztoku albuminu adsorpcí na konjugát sepharózy a ethylendiaminu a kyseliny oktyljantarové

Příprava derivátu gelu

Konju^{gát g}elu ^byl pripraven stejným. způsohern jako v příkladu 1.

Test na Au-antigen

Roztok albuminu, pozitivní na Au-antigen s titrem 1 : 64 při provádění zkoušek ID a IEOP a získaný frakcionací plazmy, pozitivní na Au-antigen je výchozím materiálem k provedení zkoušky. Adsorpce se provádí po částech způsobem' podle příladu 3. Supernatant se zkouší na Au-antigen a je negativní při zkouškách ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 5

Odstranění Au-antigenu z koncentrátu koagulačního faktoru konjugátem sepharózy, ethylendiaminu a kyseliny oktyljantarové

Výroba derivátu gelu

Konjugát gelu se získá způsobem podle příkladu 1.

Test na Au-antigen

Plazma, pozitivní na Au-antigen se užij’e pro· frakcionací koncentrátu, který obsahuje koagulační faktory П, ^VII, ^IX a X. Připra v^í se roztok s o^bsahem ¹ % ^bílkovm^y. ^Ten^to roztok má thr Au-an^tigenu ¹: ³² pn stanovení podle ID. Na skleněný filtr s vrstvou 5 ml derivátu gelu v pufru k provádění zkoušek se přidá 10 ml zkoumaného roztoku bílkoviny a gel se pak promyje 3 x 5 ml pufru k provádění zkoušek. Eluáty se zkouší na přítomnost Au-antigenu a jsou nega^tivní ^po^dle z^půso^{bů ID}, ^IEOP a ^Hepanosticon.

Příklad 6

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát se^pha.rózy a tetradecylaminu

Výroba derivátu gelu ^Sepharóza se akttvuje z^působem po^dle příkladu 1.

Reakce se provádí tak, že se přidá 100 ml sepharózy, aktivované bromkyanem po dosažem rovno^žnéhio· stavu v 95% ethanolu a po filtraci za odsávání k roztoku 22 g tekaMc^aminu ve ¹⁰⁰ m^l 9⁵% ethanolu. Směs se nechá stát při teplotě místnosti za stálého míchání 48 hodin. Gel se pak dů^kladn^{ě p}rom^yje ^te^plým ⁹⁵% etha^tem, směsí vody· a ethanolu v poměru 1:1, 1 M chloridem sodným, vodou a pufrem k provádění zkoušek.

Výtěžek reakce se stanoví protonovou magnetickou rezonancí ' (HA 100j, při níž zjištěno ^4,3 %.

Test na Au-antigen

Plazma, pozitivní na Au-antigen s titrem 1: 128 podle · stanovení ID a IEOP je výchozí látkou pro· následující reakce. Do· skleněného· filtru s vrstvou 10 ml gelu v pufru k provádění zkoušek se přidá 35 ml plazmy. Gel se promyje 3 x 10 ml pufru a eluáty se zkouší na Au-antigen. Eluáty byly negativní při ID, IEOP, Hepanosticon a Ausria.

Příklad 7

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát sepharózy a ²-am.inodekanu

Příprava derivátu gelu

2-dodekan se převádí na odpovídající amin reakcí s hydroxylaminem za vzniku oximu s následnou katalytickou hydrogenací a oďstraňovárám vo^dy. Sepharóza 'se získává způsobem podle příkladu 1.

Reakce se provádí tak, že se přidá. 100 ml gelu, aktivovaného bromkyanem, pro-mytého · ⁹⁵% ethanolem a zWtrovaného za . o^dsávání k roztoku 10 g 2-annnododekan'u ve ¹⁰⁰ ml ⁹⁵% ethanolu. ^měs se nech^á stát 48 hodin za stálého míchání při teplotě místnosti, načež se gel důkladně promyje tep^lym ⁹⁵% ethanolem, směs^í vo^dy a ethanoto v poměru 1:1, 1 M chloridem sodným, vodou a pufrem к provádění zkoušek.

Výtěžek reakce se stanoví protonovou magnetickou rezonancí (HA 100) a je 1,0 %.

Test na Au-antigen

Plazma, pozitivní na Au-antigen s titrem 1: 128 podle metod ID a IEOP je výchozí látkou pro· následující zkoušky, které byly provedeny způsobem podle příkladu 3. Supernatant byl negativní při testování způsoby ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 8

Odstranění Au-antigenu z plazmy ads.orpcí na konjugát sepharózy a kyseliny ethylendiamin-lO-undecenu

Příprava derivátu gelu

Adiční produkt sepharózy a ethylendiaminu byl získán způsobem podle příkladu 1. К čerstvě připravenému roztoku 1,85 g kyseliny undecylenové a 2,1 g dicyklohexylkarbodiimidu ve 100 ml dioxanu se přidá 100 ml konjugátu sepharózy a ethyelndiaminu, načež se tento konjugát uvede do rovnovážného stavu s dioxanem s následnou filtrací ve vakuu. Suspenze gelu se nechá stát za stálého míchání 15 hodin při teplotě místnosti, promyje se dioxanem, směsí dioxanu a vody v poměru 1:1, 1 M chloridem sodným a pufrem к provádění zkoušek.

Výtěžek výsledného materiálu, vztaženo na nasycenou alifatickou kyselinu byl zjištěn protonovou magnetickou rezonancí (HA 100) a jeho hodnota je 2,3 °/o.

Test na Au-antigen

Výchozím materiálem je plazma, pozitivní na Au-antigen s titrem· 1 : 128 podle metod ID a IEOP. Zkoušky byly prováděny způsobem podle příkladu 3. Supernatant byl negativní na Au-antigen při způsobech ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 9

Odstranění Au-antigenu z koncentrátu plasminogenu adsorpcí na konjugát sepharózy a kaprylhydrazidu

Způsob výroby derivátu gelu

Konjugát gólu byl připraven způsobem podle příkladu 3.

Test na Au-antigen

К 2 ml roztoku plasminogenu se přidá 0,5 ml plazmy, vys.oce pozitivní na Au-antigen, takže směs je rovněž vysoce pozitivní na

Au-antigen při způsobech ID a Ausria. Směs se nechá projít sloupcem o rozměru 4 cm s obsahem 10 ml konjugátu gelu v rovnovážném stavu v pufru к provádění zkoušek. Odebrané frakce byly zkoumány, eluát s obsahem plasminogenu byl negativní při provádění zkoušek ID a Ausria.

Příklad 10

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát polyakrylamidu a propylendecylaminu

Způsob výroby derivátu gelu

Polyakrylamid, Biogel P 300 se nechá nabobtnat ve vodě a pak se důkladně promyje 0,05 M pufrem s fosforečnanem sodným o pH 7,0. Při aktivaci se smísí 20 ml suspenze gelu v pufru (0,5 suchého gelu na 25 ml pufru) s 5,0 ml glutardialdehydu a směs se inkubuje 18 hodin při teplotě 37 °C. Pak se gel důkladně promyje dioxanem, směsí dioxanu a vody v poměru 3 : 2, vodou s pufrem к provádění zkoušek.

Reakce se provádí přidáním suchého gelu к roztoku 3 g decylaminu ve 30 ml směsi dioxanu a vody (60:40) při pH 8. Směs se nechá stát při 4 °C 18 hodin, pak se gel promyje dioxanem, směsí dioxanu a vody (60 : 40), vodou a pufrem· к provádění zkoušek.

Test na Au-antigen

Plazma pozitivní na Au-antigen s titrem 1 : 128 podle ID a IEOP se užije ke zkouškám, prováděným podle příkladu 3. Supernatant je negativní na Au-antigen podle ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 11

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát sepharózy, cystaminu a kyseliny oktyljantarové

Způsob výroby derivátu gelu

Adiční produkt sepharózy a cystaminu se získá redukcí způsobem podle příkladu 1 reakcí s 0,05 M merkaptoethanolu v 0,1 M uhličitanovém pufru o pH 8,5 po dobu 1 hodiny. Gel se pak důkladně promyje uhličitanovým pufrem, vodou a dioxanem. К roztoku 1.2 g kyseliny oktyljantarové ve 40 ml dioxanu se přidá roztok 1,84 g dicyklohexylkarbodiimidu v 10 ml dioxanu a 25 ml adičníhoi produktu sepharózy a cystaminu. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti se přidá ještě 1,84 g dicyklohexylkarbodiimidu. Po dalších 2 hodinách se gel promyje dioxanem. Tento postup se znovu opakuje a produkt se promývá důkladně dioxanem, směsí dioxanu a vody, vodou a 0,1 M uhličitanovým pufrem o· pH 8,5. Zbývajrn thio-lové sku^pin^y se blokuj taK že se na ^gel. ^působí 6⁰ mg jodoacetamteu na dobu 45 minut. Pak se gel promyje pufrem k provádění zkoušek.

Test na Au-antigen

Plazma pozitivní na Au-antigen s titrem 1: 32 podle ID je výchozím materiálem pro zkoušky, které se provádějí po jednotlivých vsáz^kác^h z^působem· ^podte ^příkla.du ³. Supernatant je negativní na Au-antigen při provádění zkoušek ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 12

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugáty sepharózy a kyseliny hexamethylendiaminnaftyl-l-octové

Způsob výroby derivátu gelu

Adiční produkt sepharózy a hexamethylendiaminu se získá způsobem podle příkladu 1.

ml výsledného gelu se· přenese na skleněný filtr a proimyje směsí dioxanu a vody v ^pom^ěru ³ : 2, načež se su^ší za odsávání, pak se přenese do čerstvě připraveného roztoku 1,1 g kyseliny naftyl-l-octové ve 30 ml směsi dioxanu a vody v poměru 3 : 2. K suspenzi gelu se přidá za stálého míchání 2,65 g ve vodě rozpustného· karbodilmⁱdu, a to ^N-cyklohexyl-^N‘-[^/M^N-methy^lmorfolinoethyl ) ] karbodiimid-p-toluensulfonátu, načež se pH upraví na hodnotu 4,8 zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Směs se nec^{há h}odinu srát při te^plotě místnostb nače^ž se ^přidá je^{ště 2,65 g té}ho^ž ve vodě rozpustného karbodiimidu. Směs se nechá jes^tě hodinu stót za steteho míchání, načež se přenese na skleněný filtr*, důkladně se promyje dioxanem, směsí dioxanu a vody v poměru 3:2, 1 M chloridem sodným, vodou a pufrem· k provádění zkoušek.

Výtěžek adičního· produktu, vztaženo na kyselinu naftyl-l-octovou, byl stanoven protonovou magnetickou rezonancí (HA 100), jeho· ho^dnota je ^3,0 %.

Test na Au-antigen

Výchozím produktem byla plazma pozitivní na Au-antigen s titrem 1 : 32 při provádění zkoušky ID a s titrem 1: 64 při provádění zkoušky IEOP. Adsorpce byla prováděna po jednotlivých vsázkách způsobem podle příkladu 3. Supernatant byl negativní na Au-antigen při provádění zkoušek ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 13

Odstranění Au-antigenu z plazmy adsorpcí na konjugát sepharózy hexamethylendiaminu a choleste.rolhydrogenjantaranu

Způsob výroby derivátu gelu

Adiční produkt sepharózy hexamethylendiaminu se zte^ z^půso^bem ^po^dle příkladu 1.

ml výsledného· gelu se přenese na skleněný filtr a ^promyje se ^dioxanem^, 1% triethylaminem· dioxanu a znovu, dioxanem, načež · se suší za odsávání · a pak se přenese do· čerstvě připraveného roztoku 0,5 g cholesterolhydrogenjantaranu ve 25 ml dioxanu. Reakce se provádí přidáním 0,35 g dicyklohexylkarbodiimidu v roztoku v 1 ml dioxanu. Konjugát se tvoří stáním za stálého· míchání při. tepote mfetnosti. Po· 2 hodirá^ se přidá další podíl karbodiimidu a za další · 2 hodiny se výsledný gel důkladně ^prom^yje dioxanem, 9měs^í dioxanu a vod^ vodou a. nakonec pufrem k provádění zkoušek.

Test na Au-antigen

Výchozí tetkou je ^ptezma pozitivní na Au-anti^gen s htrem ¹: ⁶⁴ po^dle ^{ID a 1 128}podle IEOP. Adsorpce se provádí po· vsázkách způsobem, podle příkladu 3. Supernatant je negativní na Au-antigen při provádění zkoušek ID, IEOP a Hepanosticon.

Příklad 14

Mste-ancm Au-anttgenu z ptezm^y afoorprn na konjugát sepharózy, hexamethylendiaminu a kyseliny cholinové

Způsob výroby derivátu gelu

Adiční produkt sepharózy a hexamethyléndiaminu se získá způsobem· podle příkladu 1.

Vazba kyseliny cholinové na takto· získaný gel se provádí způsobem podle příkladu ¹³ s ^tím roz^dílem.^, že se roz^pust^{í 0,5} g kyseliny cholinové ve 100 ml dioxanu.

Výtěžek adičního· produktu, vztaženo· na kyselinu cholinovou, se stanoví protonovou magnetickou rezonancí (HA 100) a má hodnotu ^5,8 %.

Test na Au-antigen ^Výchoz^ím· matertetem byte ptezma ^pozitivní na Au-antigen s titrem 1: 32 při provádění metody ID. Adsorpce se provádí po jednotlivých vsázkách způsobem podle příkladu 3. Supernatant je negativní na Au-antigen pH ^prov^áděn^í z^kou^še^k ГО, ^IEOP a Hepanosticon.

Claims

1. Prostředky s afinitou pro virus hepatitidy, vyznačující se tím, že sestávají z matrice, propustné pro vodu, obsahující včleněný spacer, která je tvořena buď vysokomiolekulárním uhlohydrátem jako celulózou, agarózou, nebo polyamidovou plastickou hmotou, jako je polyakrylamid, s výhodou zesítěné bisepoxidem, glutardialdehydem, divinylsulfonem, dibrompropanolem nebo epichlorhydrinem, přičemž na tuto matrici je navázaná hydrofobní sloučenina jako ligand kovalentní vazbou některou z následujících skupin:

—O—C—NH—, II NH — O—C—NH—NH—, II

NH

-NH-(CH₂)₂.._ó-NH—C—NH—, —NH—CO—.

2. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím·, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny hexamethylendiaminnaftyl-l-octové.

3. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a hexamethylendiaminocholesterolhydrogensukcinátu.

4. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny hexamethylendiamincholinové.

5. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matirce je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny ethylendiaminoktyljantarové.

6. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro* vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny hexamethylendiamindodecyljantarové.

7. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kaprylhydrazidu.

8. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro* vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a tetradecylaminu.

9. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a 2-aminodekanu.

10. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny ethylendiamin-lO-undecenové.

11. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že pro· vodu propustná matrice je tvořena konjugátem agarózy a kyseliny cystaminoktyljantarové.

12. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že propustná matrice je tvořena konjugátem polyakrylamidu a propylendecylaminu.

13. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že hydrofobní sloučeniny obsahují uhlíkový řetězec s více než 7 atomy uhlíku.

14. Prostředky podle bodu 1, vyznačující se tím, že hydrofobní sloučeniny obsahují kondenzovaná jádra.