SU1638163A1 - Способ получени конъюгата авидина с коллоидным золотом - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к анализу биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологического материала с помощью электронной микроскопии. Целью изобретени   вл етс  улучшение качества целевого продукта за счет увеличени  его стабильности. Способ заключаетс  в присоединении авидина к коллоидному золоту при обработке зол  золота 20-200-кратным мольным избытком авидина с последующим отделением несв завшегос  авидина, при этом перед присоединением авидина золь стабилизируют сывороточным иммуноглобулином G при соотношении 30-100:1 с отделениемнесв завшегос  иммуноглобулина, а авидин активируют обработкой 1-16%-ным раствором глутарово- го альдегида, после присоединени  авидина его закрепл ют в конъюгате обработкой 0,002-0,02 М раствором боргидрида натри . Использование предлагаемого способа позвол ет улучшить качество целевого продукта за счет увеличени  его стабильности в 7-9 раз, а также повышени  чувствительности визуализации с использованием целевого продукта в 10 раз. 2 табл. fcrf fe а со со сь со

Description

Изобретение относитс  к области анализа биологических материалов с использованием биотиновых меток и может быть использовано в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, иммуноанализе и исследовании биологических материалов с помощью , электронной микроскопии.

Целью изобретени   вл етс  улучшение качества целевого продукта.

Способ получени  конъюгата авидина (А) с коллоидным золотом (КЗ) заключаетс  в стабилизации зол  КЗ путем смешивани  с водным раствором сывороточного им-муноглобулина Г (ИгГ), отделением несв завшегос .ИгГ (например, ультра- центрифугированием или гель-хроматографией ) и последующим смешением с авидином, предварительно активированным 1-16%-ным раствором глутаровогоальдегида при мольном отношении ави- дин: КЗ 20-200:1, с последующим закреплением авидина в конъюгате обработкой 0,002-0,02 мол рным раствором (0,08- 0,8 г/л) боргидрида натри  и отделением несв завшегос  авидина (например, гель- хроматографией или ультрацентрифугированием ). Чувствительность метода визуализации на его основе составл ет 2-3 пг био-ДНК в пробе, а врем  жизни такого конъюгата превышает 7 мес (свойства коньюгата не измен ютс  в течение 7 мес с момента его получени ). Чувствительность метода визуализации с использованием конъюгата, полученного известным способом , около 20 пг био-ДНК в пробе, а врем  жизни такого конъюгата 3-4 нед.

П р и м е р 1. Получение конъюгата авидина с коллоидным золотом через иммуноглобулин Г.

А. К 60 мл 0,005% зол  золота (размер частиц 10 + 2 нм, оптическое поглощение при длине волны 520 нм (D520 0,8, мольна  концентраци  8 х моль/л) в 0,01 М растворе КаСОз при рН 9,5 добавл ют при перемешивании 1 мл раствора ИгГ(2,3 мг/мл, отношение ИгПКЗ 30:1) в 0,01 М растворе КаСОз при рН 9,5 (изоэлектрическа  точка ИгГ7,5). Смесь выдерживают30 мин и затем добавл ют бычий сывороточный альбумин до концентрации 1 мг/мл. Выделение КЗ, стабилизированного ИгГ (И-КЗ), провод т методом гель-хроматографии.

Б. Присоединение авидина к И-КЗ. К 0,5 мл раствора авидина (2 мг/мл) в 0,1 М КНСОз при рН 9,0 добавл ют 0,05 мл 25%- ного раствора глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин и затем нанос т на колонку размером 1 х 20 см, заполненную сорбентом Sephaclex G-50 (Pharmacia, Швеци ), уравновешенную 0,1 М раствором КНСОз рН 9,0. Элюцию ведут в том же буфере со скоростью 20 мл/ч. В данных услови х происходит полное отделение активированного авидина от непрореагировавшего глутарового альдегида. Фракции, содержащие авидин, объедин ют и добавл ют к 2 мл раствора I/I-КЗ (Dsao 5,0, отношение ави- дин:КЗ 150:1).в 0,1 М КНСОз при рН 9,0. Через 30 мин добавл ют 0,02 М раствор боргидрида натри  до конечной концентрации 0,002-0,01 М. Смесь выдерживают 30 мин и затем добавл ют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 10 мг/мл. Выдел ют образовавшийс  конъ- югат АИ-КЗ методом гель-хроматографии.

Испытани - конъюгатов А-КЗ и АИ-КЗ. Нитроцеллюлозные фильтры с нанесенной био-ДНК в диапазоне 10 нг - 0,1 пг инкубируют в растворе конъюгата А-КЗ или АИ-КЗ

(Dsao 0,5) в присутствии 0,1 М К2НР04, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в течение часа, промывают в течение часа в трех сменах раствора 0,1 М

К2НР04 и 0,1% детергента Tween-20 и в течение 15 мин в бидистиллированной воде. После этого провод т физическое серебр ное усиление по стандартной методике. Серебр ный усилитель (0,077 М гидрохинон,

0,0055 М лактат серебра в 0,2 М цитратном буфере, рН 3,85) готов т непосредственно перед употреблением смешиванием 10 мл концентрированного цитратного буфера (23,5 гтринатрийцитрата дигидрата и 25,5 г

гидрата лимонной кислоты на 100 мл воды), 60 мл воды, 15 мл раствора гидрохинона (0,95 г на 15 мл воды) и 15 мл раствора лактата серебра (0,11 г на 15 мл воды). Усиление ведут 20 мин при красном свете, поеле чего закрепл ют изображение в фотографическом фиксаже и отмывают в воде . Затем фильтры высушивают и фотомет- рируют в отраженном свете на приборе ДО-1. Достоверным считают сигнал, превышающий на 0,1 оптическую единицу фон (3-кратное превышение паспортной точности измерени  прибора ДО-1), а соответствующее этому сигналу количество био-ДНК определ ют как чувствительность метода.

Испытани  конъюгатов провод т сразу после получени , через 40 дней и через 200 дней хранени  в растворе 0,1 М К2НР04 и 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при рН 7,5 в холодильнике (4°С). Результаты испытаний приведены в табл. 1.

П р и м е р 2. Подбор концентраций глутарового альдегида (ГА) при обработке авидина.

Опыт провод т так же, как в примере 1.

Измен ют концентрацию ГА при обработке авидина. Испытани  полученных конъюгатов провод т, как в примере 1. Результаты представлены ниже:

П р и м е р 3, Подбор отношени  ави- дин:КЗ.

Опыт провод т аналогично примеру 1. Измен ют отношение авидин:КЗ. Испытани  полученных конъюгатов провод т, как в примере 1. Результаты приведены ниже:

П р и м е р 4. Подбор условий обработки боргидридом натри .

Опыт провод т, как в примере 1. Измен ют концентрацию боргидрида натри . Испытани  провод т, как в примере 1. Результаты представлены в табл. 2.

П р и м е р 5. Вли ние соотношени  ИгПКЗ на чувствительность визуализации с использованием этого конъюгата приведено ниже:

При ИгГ:КЗ б золь неустойчив и легко коагулирует при уменьшении рН или добавлении соли; при ИгПКЗ 6-30 комплекс устойчив к указанным воздействи м, но частицы КЗ еще способны сорбировать дополнительные порции молекул иммуноглобулина Г (ИгГ); при соотношении ИгГ.КЗ S 30 поверхность частиц КЗ насыщаетс  и последующие порции ИгГ остаютс  в растворе, т.е. образуетс  стабильный комплекс посто нного состава. Дл  получени  конъюгата важным  вл етс  именно стабильность по составу получаемого комплекса иммуноглобулина Г с ко/ лоидным золотом , Использование именно такого стабилизированного комплекса дл  получени  конечного конъюгата давало наилучшие результаты. При использовании комплекса.

который не подвергалс  стабилизации по составу (т.е. при соотношении ИгПКЗ 30), конъюгаты получались с более низкой чувствительностью .

Перед св зыванием с глутарирован- ным авидином комплекс иммуноглобулина Г с коллоидным золотом отдел етс  от избытка молекул ИгГ, не св завшихс  с КЗ.

Соответственно в реакцию вступает стабилизированный комплекс ИгГ-КЗ и эффективность реакции определ етс  соотношением авидин:ИгГ-КЗ, численно равным приведенному соотношению авидинжоллоидное зол ото (2 0-2 00 :1).

Дл  стабилизации зол  КЗ могут быть использованы ИгГ из сыворотки быка, человека и в основном лошади (как наиболее дешевый). Все они дают целевые конъюгаты

авидина с КЗ с одинаковыми свойствами.

Использование р да других белков (все они дают менее прочные комплексы с КЗ) приводит к получению конъюгата авидина с КЗ с гораздо более низкой чувствительностью (опыты провод т аналогично примеру 1, только вместо ИгГ используют бычий сывороточный авидин, овальбумин и цитох- ром С).

Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет получать конъюгаты авидина с КЗ улучшенного качества. Так, чувствительность визуализации био- тинсодержащих веществ возрастает в 10 раз (до 2-3 пг вместо 20 пг), а стабильность - с 3-4 нед до 7 мес.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  конъюгата авидина с коллоидным золотом, включающий обработку зол  коллоидного золота 20-200-кратным мол рным избытком авидина и отделение несв завшегос  авидина, о т- личающийс  тем, что, с целью улучшени  качества целевого продукта, перед обработкой авидином золь коллоидного

   золота стабилизируют водным раствором сывороточного иммуноглобулина Г при соотношении иммуноглобулина и коллоидного золота 30-100:1 с последующим отделением несв завшегос  иммуноглобулина , авидин предварительно активируют 1-16%-ным глутаровым альдегидом, а после обработки зол  авидином конъюгат инкубируют в присутствии 0,002-0,02 М раствора боргидрида натри .

   Таблица 1

   Таблица 2