JPH05500858A - 脱髄性神経障害特に多発性硬化症の診断手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脱髄性神経障害特に多発性硬化症の診断手段本発明は、脱髄性神経障害、特に多 発性硬化症ＳＥＰを１ｎｖｉｔｒｏで診断する手段に関する。

世界保健機関の統計調査によれば、ＳＥＰは世界中に広まっている病気であり、 特に温暖及び寒冷諸国に多く見られる。

フランスでは５０，０００件が報告されているが、実際の数はこれを上回ると思 われる。温暖又は寒冷地帯に属する欧州及び北米の国々、並びに南半球の対応す る地帯では同じ割合で患者が発見されている。

ＳＥＰの研究の結果、遺伝的及び／又は地理的要因、更には伝染性の要因といっ た様々な要因が発病に関与し得ることが判明した。これらの物質の性質と、　Ｓ ＥＰの発病でこれらの物質が作用するメカニズムはまだ解明されていない。

しかしながら、この病気がある段階で、変性ミニリンの斑の形成を伴う中枢神経 系ｍ織でのミニリンの自己免疫攻撃に進展することは確認されている。

また、マクロファージ及び種々のタイプのリンパ球の浸潤と、星状細胞による斑 の最終的単離も観察されている。

これまでに実施された生化学的分析では、抗原性を付与されており、この病気で 産生される抗体の免疫学的ターゲットを構成するミニリンの特異的成分（脂質、 核酸又はタンパク質のいかんを問わず）を同定することはできながった。

ＳＥＰ患者の髄液中にミニリンの主なタンパク質系又は脂質系抗原に対する抗体 が存在することを立証しようとする実験が失敗した後、ある研究者グループがミ ニリン関連糖タンパク質ＭＡＳ（Ｍｙｅｌｉｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｇｌｙ ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、次いでミニリン寡突起神経膠細服糖タンパク質ＭＯＧ（ Ｍｙｅｌ　ｉｎ−Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ）に注目したが、結果は明らかにされていない。

別の方法として、ＳＥＰ患者の髄液中に存在する抗体が、ウィルスエピトープ、 特に［ＩＴＬＶ−１タイプのレトロウィルスに対するものであるか否かを調べる ことからなる方法が提案された。しかしながら、この方法は、反応の特異性が不 十分であるため、神経障害以外の神経学的病気にががった患者において極めて多 くの陽性反応が観察されるという結果を示した。

本発明者がマンノースに富んだグリカンと結合する特定のレクチンを研究したと ころ、これらのレクチンは、脱髄性神経障害患者、より特定的には多発性硬化症 患者の髄液及び血液中に存在する抗体によって特異的に認識される抗原に対応す ることが判明した。

本発明の目的は、この種のレクチンを脱髄性神経障害のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に 使用することにある。

本発明の目的はより特定的には、前記病気の診断手段、即ち前記レクチンを用い てこれらの病気を早期に検出する方法と、この診断を行うためのエレメントを含 んだキットとを提供することにある。

従って本発明は、脱髄性神経障害、特にＳＥＰの診断に、マンノースに富んだグ リカンを認識するレクチン又はそのタンパク質系サブユニットを使用することを 特徴とする。

これらのレクチン又はそのサブユニットは、それぞれ可溶性小脳レクチンＣ５Ｌ （ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ　５ｏｌｕｂｌｅ　１ｅｃｔｉｎ）又はそのタンパク質 系サブユニットとの間に免疫学的親族関係を有する。

「免疫学的親族関係（ｐａｒｅｎｔＡ　ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｉｑｕｅ）」という 表現は、これらの内因性レクチン又はそのサブユニットが、それぞれＣ５Ｌ又は そのサブユニットを認識する抗体との閏で抗原−抗体タイプの複合体を形成でき ることを意味する。

可溶性小脳レクチンＣＳＬはＺＡＮＥＴＴ＾らによりＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＮｅ ｕｒｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ、１９８７．ｐ、ＩＺ５０−１２５７に記述され ている。この論文には、マウス小脳がらのＣＳＬ及びそのサブユニットの単離が 報告されている。これらのＣＳＬ及びその前駆体サブユニットは、Ｔｒｉ、ｒｏ ｎ　Ｘ−１００’のような中性洗剤に溶解しない環タンパク質に担持されている マンノースに富んだグリカンに対する親和性を特徴とする。

前記論文に記載のマウス小脳がらの抽出によって得られるようなサブユニットは 、分子量（ＰＨ）が３１５ｋＤａ、３３ｋＤａ及び４５ｋＤａである。

前述のよ、うな使用は、 −患者からの採取試料、特に髄液、血液又は血漿液、例えば血漿もしくは血清を 、抗原−抗体タイプの反応を生起させる条件で、前述のような内因性レクチンと 共にインキュベートし、 −生成したイムノグロブリン複合体を一般的なイムノグロブリン検出方法によっ て検出する ことを特徴とする多発性硬化症及び他の脱髄性神経障害の診断方法の実現につな がった。

この本発明の検査は更に、一般的な生物医学的免疫分析に属するものであるため コストが抑えられるという利点も有する。

この検査を髄液試料に適用した結果、後述の実施例で明らかなように、大きな感 度と著しい特異性とに起因して病気を早期に発見できることが判明した。

また、臨床的に多発性硬化症と診断されており、且つ大部分が髄液中に抗ＣＳＬ 抗体を有するような患者については、血液中又は血漿及び血清のような血漿液中 に抗ＣＳＬ抗体が存在することが確認された。

例えば、多発性硬化症患者の血漿の１〜１０００倍希釈物を用いると、抗ＣＳＬ 抗体の存在が極めて明白に示される。

これらの抗体の存在が神経組織に特異的なものではなく、また可溶性小脳レクチ ンがＳＥＰにおいて優先的ターゲットであることを示すこれらの結果は注目に値 する。

また、この検査を行うために血液又は血漿液を使用すると、入院を必要とする腰 椎穿刺より遥かに簡単に実施できる血液採取を行うだけでよいため、検査の実用 性が大幅に増加する。

更に、この検査はほんの数マイクロリットルの血液で実施できる。

本発明の方法に基づいて行った診断を裏付けるためには、例えば白質に散在する 病変を可視化できるＩＮＭＲ（核磁気共鳴）を用いて補足的試験を行うことがで きる。

本発明の診断方法で使用する内因性レクチンはある程度まで精製したレクチン又 は純粋調製物である。

レクチン又はそのサブユニットは哺乳類、鳥類及び魚頭の組織中に広く分布して おり、種々の精製方法によって、但し有利にはマンノースに富んだグリカンに対 する前記レクチンの親和性を利用する方法を用いて、前記組織から単離できる。

　′ ＣＳＬか、又はＣＳＬに対して免疫学的親族関係を有する内因性レクチン、例え ば別の哺乳動物、鳥、魚又はそれほど進化していない他の生体から単離したＣＳ Ｌレクチンを使用する。

一変形例では、これらのレクチンのサブユニットを１種類又は複数種用いて本発 明の診断方法を実施する。

好ましいＣＳＬサブユニットは前出のＺＡＮＥＴＴＡらの方法で得られるような サブユニットである。

この種のサブユニットとしては特に、４５ｋＤａ、３３ｋＤａ及び３１．５ｋＤ ａのものが挙げられる。

内因性レクチン又はそのサブユニットを被検試料と共にインキュベートする操作 は、緩衝媒質中で室温で実施すると有利である。

より特定的には、イオン強度が比較的高いほぼ中性のｐＨの緩衝媒質、例えばＴ ＢＳタイプの緩衝液（０，１５ＭのＮａＣｌを含むｐｔ１７．ＺのＩＯＩＩＭＴ ｒｉｓ−ＨＣＩ）、又はＰＢＳタイプの緩衝液（０，１５８のＮａＣ１を含む！ ７．２の２５ｍＭ　Ｎａ■２ＰＯ，−Ｎａ２ＨＰＯ４）を使用する。

内因性レクチンＣＳＬに固定されたイムノグロブリンを検出する操作は、標識し た抗ヒトＩｇイムノグロブリンもしくは標識した抗ＩｇＧイムノグロブリンか、 又は非免疫的分子を用いて行うのが有利である。

イムノグロブリンは特に酵素又は放射性反応体で標識する。

酵素としては、現在最も一般的に使用されている標識酵素に対応するペルオキシ ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、トガラクトシダーゼが挙げられる。

一般的な反応体は放射性ヨウ素からなる。非免疫的分子は例えば標識したプロテ ィンＡからなる。放射性標識は通常ヨウ素で行う、勿論、前述の抗原−抗体反応 を明らかにするものであれば、他の酵素もしくは放射性反応体、又は他の形態の 標識を使用することもできる。

本発明は、 −少なくとも１種類の前述のような内因性レクチン又はそのサブユニットの１つ と、 −　インキュベーション及び／又は検出操作に必要な溶媒及び物質 とを含むことを特徴とする診断キットも提供する。

本発明の他の特徴及び利点は、ある程度まで精製したＣＳＬの製造と、多発性硬 化症患者における抗ＣＳＬ抗体の存在を検出するための前記ＣＳＬの使用とに関 する以下の実施例で明らかにされよう。

これらの実施例は第１図〜第３図を参照しながら説明する。

第１図及び第３図はそれぞれ髄液及び血漿の採取試料を用いて得たイムノプロッ トの写真である。　第２図は診断分布ヒストグラムである。

えＵ 、　庁ま　？−ＣＳＬの　ツー　シ　ンの＝前出のＺＡＮＥＴＴＡらの論文に記 述されているようにマンノースを用いてＣＳＬの特異的可溶化を行う、　ＣＳＬ は若いマウスの小脳から採取したものである。この操作及び後続の操作は、プロ テアーゼ阻害物質即ちフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ　＞とｐ−） シル−アルギニンのメチルエステル（それぞれ０．１及び０．３１１Ｍ）とを使 用直前に加えたＭ新液を用いて４℃で行う。

精製マンノースの存在下で可溶化した物質（ＴＮＭフラクション）を、１５％ト リクロロ酢酸の添加により３０分間４℃で沈降させ、次いで４℃で遠心する。

沈渣を純粋メタノール中で洗浄する０弱い空気流で乾燥し、次いでＬａｅｎｎｌ ｉの解離Ｍｆｒ液中１ｍｇ／ｍｌの割合で可溶化する。その後、９０℃で５分間 加熱してから電気泳動にがける。

電気泳動は、厚さ０．７５ｍｍのゲルプレート上でＬａｅｍａｌｉ緩衝システム 中でＳＯＳを存在させてポリアクリルアミドゲル（１３％）上で行う。

ＣＳＬに富んだフラクション２００μＩを長さ１３ｆ）＋ｍにわたって配置し、 １５＋ｉ＾の一定した電流下で６時間移動を生起させる。

ゲルを一般的な方法によってニトロセルロースフィルタに移す。

０．４八ｍｐの電流強さで電圧を一定（３６Ｖ）にして４時間移動させ後、プロ ットの縁をアミドブラック（＾ｍ１ｄｏ　Ｂｌａｅｋ”）で着色する。ニトロセ ルロースフィルタの残りを、１５０ｍＭのＮａＣＩを含むｐＩＩ７．２のＴｒｉ ｓ−ＨＣＩＭ衝液（７ＢＳ緩衝液）（１０ａＭ）中のウシ血清アルブミンＢＳ＾ （３％）溶液で室温で２時間飽和させる。

このフィルタを水で洗浄し、使用するまで４℃で水中に保存する。

２、　々の　の東　の　７　ｆにＴ萱　７フークシ　ン　イン　ユベート　”− 前記ニトロセルロースフィルタを幅２１のバンド状に切断し、これらのバンドを 、ＴＢＳ［漬液中３％のＢＳ＾溶液を０．７５ｍ！入れたインキュベーション容 器の通路上に移す。

軽く撹拌しながら室温で１時間以上インキュベートした後、０．７５ｍ１の髄液 を加える。

前記バンドを室温で３時間撹拌し、次いで２時間にわたり１５回繰り返して洗浄 し、ＴＢＳＭ　ｆｉ液中３％のＢＳ＾溶液中で１゜分間インキュベートし、更に ２時１ｍ　ＴＢＳ中で洗浄する。

３　−　Ａ　の　： 洗浄後のバンドにＢＳ＾（ＴＢＳ中３％の溶液１．５ｍ１）を加え、室温で３０ 分間インキュベートしてがら、ＩＩＲＰ又はアルカリ性ホスファターゼ（最終希 釈度１１５００）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧを加えル０．：、、　Ｉ）　Ｉｇ ＧハＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社又ハＰＥＬＦＲＥＺ　ＢＩＯ−ＣＩＴＥＭＩＣＡＬ 社から入手したものである。

試料５：４℃で約１４時間撹拌し、前述のように洗浄する。

試料の検出は、ＨＲＰ用にクロロナフトールを使用し、アルカリ性ホスファター ゼ用に基質Ｐｒｏｍｅｇａ’を用いる方法によって行う。

室温で反応させた後、バンドを水で洗浄し、紙フィルタの間で乾燥する。

陽性試料は、ＣＳＬの特徴である分子１４５．３３又は３１．５ｋＤａのバンド の着色を示す試料に対応する。このＣＳＬバンドの着色は、髄液中に抗体が存在 していない場合の実験、又は多発性硬化症以外の神経学的病気の患者の髄液を用 いて行った実験では観察されない。

先−１１ 第１図の写真は、多発性硬化症又は他の神経学的疾患にかかった患者の髄液中に 抗ＣＳＬ抗体が存在することを明らかにするイムノプロットのサンプルを示して いる。

第１図ａ）〜ｇ）の結果は下記の状況に対応する：ａ）抗原として使用したタン パク質調製物のアミドブラック７による着色状態（ＣＳＬに富んだ若いマウスの 小脳のＴＮＮフラクション）、ある程度まで精製したこの調製物には、ＣＳＬの サブユニットの特徴である分子量３１．５．３３及び４５ｋＤａのバンドが観察 される。

ｂ）髄液を使用せずに、）ＩＲＰ又は八ＫＰで標識したヤギ抗ヒト抗体を用いた 場合の着色状態。

Ｃ）機械的外傷に起因した髄膜出血を有する患者の髄液を用いた場合の様相、バ ックグラウンドが着色され、明確に規定された着色バンドは存在しない。

ｄ）及びｇ）は抗ＣＳＬ抗体源として多発性硬化症患者の髄液を用いた場合のＣ ＳＬバンド免疫検出に対応する。抗原−抗体複合体の検出は、ＨＲＰ又は八ＫＰ で標識した抗ヒトイムノグロブリンを用いて行う、ＣＳＬの着色サブユニットは 患者毎に異なることが観察される。　３１．５ｋＤａのサブユニットはｄ）１〜 ３に見られ、４５ｋＤａサブユニツトはｄ）４〜９に見られる０ｍつかの事例で は、ＣＳＬの３１．５及び３３ｋＤａサブユニツトが４５ｋＤａサブユニツトと は異なる着色状態で強く着色されている。

ｅ）及びｆ）は多発性硬化症以外の神経学的病気にかかった患者の髄液を用いて 同様に行った実験に対応する。ｅ）は脳血液関門に作用しない非伝染性疾患に対 応し、ｆ）はウィルス性髄膜炎に対応する。４つの事例で、６７ｋＤａのバンド が免疫反応の結果着色された。これら一連の実験にかけられた患者については、 前記バンドが病気の急性期にしか観察されない、幾つかの事例では、４０ｋＤａ 及び２７ｋＤａのバンドが検出されている。

これらの結果から明らかなように、多発性硬化症患者のイムノプロットは他の神 経学的病気の患者のイムノプロットと全く異なっている。髄液を加えない場合（ 第１図ｂ）参照）、又は髄液が多発性硬化症以外の病気の患者に由来するもので ある場合（第１図ｃ）、ｅ）及びｆ））にはバンドは着色されない。

２４０Å以上の異なる患者に対応するこれらの実験の間に２５５の髄液試料を分 析した。多発性硬化症と診断された患者の場合は、２回想上分析した試料の結果 が常に同じである。

これらの結果を第２図にまとめた。

第２図ａは、Ｃ３Ｌを抗原として用いた免疫化学検査による分析で陽性の結果を 出した試料及び陰性の結果を出した試料の比率を示しており（１：全試料、２： 陰性試料、３：陽性試料）、 第２１Ｎｂは、多発性硬化症であると診断された患者の試料、その確率が高い患 者の試料及びその可能性がある患者の試料について、陽性の結果を出した試料及 び陰性の結果を出した試料の比率を示しており（１：全陽性試料、２〜４：それ ぞれ臨床的に多発性硬化症と診断された患者の試料、その確率が高い患者の試料 及びその可能性がある患者の試料で陽性の結果を示したもの、５：臨床的に多発 性硬化症と診断された患者の試料で陰性の結果を示したもの）、第２図Ｃは、多 発性硬化症以外の異なる病気であると診断された患者の試料について、該検査で 陽性の反応を示した試料の比率を示している（１：全試料、２：多発性神経障害 （白い部分）並びに小脳及び錐体症候群（黒い部分）、３：髄膜炎、４：脳水腫 、５：他の疾患）。

多発性硬化症以外の様々な神経学的病気（痴呆、パーキンソン、前庭症候群、偽 球症候群、錐体外症候群、痛み、腰痛、髄膜炎、出血等）の患者に由来する１７ ０の異なる髄液については陰性の結果が得られた。

出血性髄膜炎患者に対応する試料群は、バックグラウンドの着色と、ＣＳＬバン ドとは無関係の６７ｋＤａのバンドに特異的な着色とを示す。

多発性硬化症に関する５１の試料（臨床的に多発性硬化症と診断された患者の試 料、多発性硬化症である確率が高い患者の試料、並びに多発性硬化症の可能性が ある患者の試料と含む）については、４７の試料にＣＳＬバンドの着色が見られ る。陰性の結果を示したのは４つの試料だけである。

これら４つの試料は、臨床的に多発性硬化症と診断された患者に由来するもので ある。多発性硬化症と診断されなかったのにＣＳＬバンドの着色が検出された試 料は３０ある。これらの試料は、多発性神経障害（４例）、小脳及び錐体症候群 （６例）、オリーブ橋小脳皮質萎縮（１例）、Ｎ膜炎（７例）、脳水腫（４例） 及び他の病気（敗血病、ＢＲＯＮＮ−ＳＥＱＵＡＲＤ　Ｃ３Ｄ１、腫瘍及びてん かん、感覚障害、照射後性（ｐｏｓｔｒａｃｌｉｑｕｅ）白質脳炎、末梢ＰＦ） を含む少数の病気に対応する。これらの試料をＩＲＭで特異性検査にかける。

検査の特異性を、実際に陰性の試料と偽陽性の試料との和に対する実際に陰性の 試料の比であると定義すれば、この検査の特異性は最低８５％である。これは、 この検査の特異性が高いことを意味する。

感度に関する値は約９３．５％である（実際の試料と偽陰性の試料との和に対す る実際に陽性の試料の比）。

これらの結果から明らかなように、抗ＣＳＬ抗体の存在の検出は、多発性硬化症 であるという診断をくだすための良好な基準となる。

ｉ−創ｉへ良能 ヘパリンの存在下で採取した血液の遠心によって得た血漿を凍結し、検査時まで 一８０℃で保存する。

種々の神経学的病気の患者から採取した一連の血漿試料について、抗ＣＳＬ抗体 の存在を免疫応答（ｉｍｍｕｏｏｒ！ｐｌ　１ｑｕｅ）方法で調べた結果を第３ 図に示す。

ａ）及びｂ）はアミドブラックによる着色を示しており、ａ）は分子質量マーカ ー（質量はｋＤａで表される）の着色を示し、ｂ）はこの検査で使用したタンパ ク質の着色を示している（矢印の尖頭はＣＳＬの特徴的サブユニット（３１，５ 〜３３及び４５ｋＤａ）の位置を示している。

陽性の結果を示した試料は上方に番号を記し、他の試料は下方に番号を記した。

星印の試料は多発性硬化症の診断がくだされた患者に由来するものである。

ＳＥＰ患者の大部分について、３１．５及び３３ｋＤａバンドの強度の着色が見 られる。陰性の結果（例えばＬＣＲの場合の血漿が示す）は試料Ｎｏ、１１につ いて得られた。この試料は、核磁気共鳴描像によって斑の像を示さない、星印の 試料は、プラズマホレシス（ｐｌａｓ彌ａｐｈｏｒ＆ｓｅ）の前（０７及び２４ ）及び後（０８及び２５）で血漿を採取した多発性神経障害患者に対応する。低 い血漿濃度（この検査では１．５μｍ）では、プラズマホレリス後に抗ＣＳＬ抗 体の減少が観察されるが、より高い濃度（試料２４及び２５の場合は１５μｍの 血漿）では検出可能な状態が維持される。試料Ｎｏ、２１は、抗ＩｇＧで固定し た抗体の検出後にＬＣＲで最初に陰性結果を示したｉｇ＾の箱内合成ＳＥＰに対 応する。従って、抗１ｇＧの代わりに抗１．を使用すれば、この陽性の結果が明 らかにされる。

ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＦＩＧＵＲＥ　３ ・　・　＊　＄　・　・−・・　・　・・　Ｉ＄ａｂ　ａｏｏｏ　１１１　２２ ｂ４６８　０１３　２３ ・ 国際調査報告 一一一−Ａｗｌ１ｗｌｉｗｌｌｅ、ＰＣＴ／ＦＲ９０１００６３Ｂ国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．脱髄性神経障害、特に多発性硬化症ＳＥＰの診断における、マンノースに富 んだグリカンに対して親和性を示す内因性レクチン又はそのタンパク質系サブユ ニットの使用であって、前記レクチン又はそのサブユニットが、それぞれ可溶性 小脳レクチンＣＳＬ又はそのタンパク質系サブユニットとの間に免疫学的親族関 係を有するものである前記使用。
2. ２．−患者からの採取試料、特に髄液、血液又は血漿液、例えば血漿もしくは血 清を、抗原−抗体タイアの反応を生起させる条件で、前述のような内因性レクチ ンと接触させ、−一般的なイムノグロブリン検出方法によって、イムノグロブリ ン複合体が生成したか否かを調べることを特徴とする多発性硬化症及び他の脱髄 性神経障害の診断方法。
3. ３．完全に又はある程度まで精製したレクチン調製物を使用することを特徴とす る請求項２に記載の方法。
4. ４．レクチンのサブユニットを１つ又は複数使用することを特徴とする請求項２ 又は３に記載の方法。
5. ５．ＣＳＬか又はＣＳＬの１つもしくは複数のサブユニット、特に分子量が４５ ＫＤａ、３３ＫＤａ又は３１．５ＫＤａのサブユニットを使用することを特徴と する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. ６．前記接触操作を、緩衝媒質中室温でのインキュベーションによって実施する ことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．内因性レクチンＣＳＬに固定されたイムノグロブリンの検出を、有利には、 標識した抗ヒトＩｇイムノグロブリンもしくは標識した抗ＩｇＧイムノグロブリ ンを用いるか、又は非免疫的分子を用いて行うことを特徴とする請求項１から６ のいずれか一項に記載の方法。
8. ８．−前述のような少なくとも１種類のＣＳＬタイアの内因性レクチン又はその サブユニットの１つと、−インキュベーション及び／又は検出操作に必要な溶媒 及び物質 とを含むことを特徴とする、多発性硬化症、より一般的には脱髄性神経障害の診 断キット。