JPH1026623A - 肝疾患患者血清の鑑別方法 - Google Patents
肝疾患患者血清の鑑別方法Info
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- JPH1026623A JPH1026623A JP18044896A JP18044896A JPH1026623A JP H1026623 A JPH1026623 A JP H1026623A JP 18044896 A JP18044896 A JP 18044896A JP 18044896 A JP18044896 A JP 18044896A JP H1026623 A JPH1026623 A JP H1026623A
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- JP
- Japan
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- regucalcin
- serum
- antibody
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 血清中のレギュカルチンを測定すること
による肝疾患患者血清の鑑別方法。 【効果】 肝疾患患者の血清を漏れなく鑑別することが
可能である。
による肝疾患患者血清の鑑別方法。 【効果】 肝疾患患者の血清を漏れなく鑑別することが
可能である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肝機能マーカーと
して肝臓に局在するCa2+結合蛋白質であるレギュカルチ
ンを測定することによる肝疾患患者血清の鑑別方法に関
する。
して肝臓に局在するCa2+結合蛋白質であるレギュカルチ
ンを測定することによる肝疾患患者血清の鑑別方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】肝機能マーカーとしては、従来、GOT、G
PT等の酵素の血中への漏洩を指標としてきた。しかし、
これらの酵素は肝臓に特異的に存在するものではなく、
健常人の血清であってもある程度の数値を示すため、こ
れらのみから明確に判断することは困難で、ときにGOT
やGPTのデータ的には正常値を示す肝疾患患者を見落す
場合などがあった。従って、従来は複数の指標から総合
的に判断せざるを得なかった。
PT等の酵素の血中への漏洩を指標としてきた。しかし、
これらの酵素は肝臓に特異的に存在するものではなく、
健常人の血清であってもある程度の数値を示すため、こ
れらのみから明確に判断することは困難で、ときにGOT
やGPTのデータ的には正常値を示す肝疾患患者を見落す
場合などがあった。従って、従来は複数の指標から総合
的に判断せざるを得なかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このようなことから、
肝疾患患者の血清を明確に鑑別し得る方法の提供が望ま
れる。
肝疾患患者の血清を明確に鑑別し得る方法の提供が望ま
れる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】ところで、レギュカルチ
ンは、ラット肝細胞質から単離された新しいCa2+結合蛋
白質であり、等電点はpH5.20、Ca2+結合定数は4.19×10
5M-1を示し、６〜７個の高親和性Ca2+結合部位を持ち、
α−ヘリックス構造を34％含んでいる。レギュカルチン
は、Ca2+が結合すると構造がルーズになるという特徴を
有する。また、レギュカルチンはCa2+による肝臓の酵素
の活性化を制御していることが知られており、Ca2+によ
る細胞内情報伝達系の制御因子としての役割を果してい
るものである。
ンは、ラット肝細胞質から単離された新しいCa2+結合蛋
白質であり、等電点はpH5.20、Ca2+結合定数は4.19×10
5M-1を示し、６〜７個の高親和性Ca2+結合部位を持ち、
α−ヘリックス構造を34％含んでいる。レギュカルチン
は、Ca2+が結合すると構造がルーズになるという特徴を
有する。また、レギュカルチンはCa2+による肝臓の酵素
の活性化を制御していることが知られており、Ca2+によ
る細胞内情報伝達系の制御因子としての役割を果してい
るものである。
【０００５】このレギュカルチンは、GOT、GPT等の既存
の肝機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するも
のであり、また上記生理的役割を果たしていることか
ら、本発明者はレギュカルチンの肝機能マーカーとして
の可能性について鋭意検討を重ねた結果、肝疾患患者の
血清ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健
常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、
その測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用である
ことを見出し、本発明を完成した。
の肝機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するも
のであり、また上記生理的役割を果たしていることか
ら、本発明者はレギュカルチンの肝機能マーカーとして
の可能性について鋭意検討を重ねた結果、肝疾患患者の
血清ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健
常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、
その測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用である
ことを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、血清中のレギュカルチ
ンを測定することを特徴とする肝疾患患者血清の鑑別方
法を提供するものである。
ンを測定することを特徴とする肝疾患患者血清の鑑別方
法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明において、血清中のレギュ
カルチンの測定方法は特に限定されず、ELISA法、RIA
法、EIA法等、通常の手段により行うことができる。例
えばELISA法による場合では、抗レギュカルチン抗体を
固相化し、そこに被検血清を結合させ、次いで標識抗レ
ギュカルチン第２抗体を結合させた後、結合した標識抗
体を測定することにより行われる。より具体的には、イ
ムノプレートに抗レギュカルチンIgGを固相化し、そこ
に検量線用の種々の濃度のレギュカルチンあるいは患者
血清を結合させ、更にビオチン標識抗レギュカルチンIg
G及びペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合
させた後、発色基質にて発色測定し、検量線より患者血
清の濃度を算出することができる。また、抗レギュカル
チン抗体としては、ポリクローナル抗体、抗レギュカル
チン抗体産生ハイブリドーマから作製された抗レギュカ
ルチンモノクローナル抗体のいずれを用いることもでき
る。
カルチンの測定方法は特に限定されず、ELISA法、RIA
法、EIA法等、通常の手段により行うことができる。例
えばELISA法による場合では、抗レギュカルチン抗体を
固相化し、そこに被検血清を結合させ、次いで標識抗レ
ギュカルチン第２抗体を結合させた後、結合した標識抗
体を測定することにより行われる。より具体的には、イ
ムノプレートに抗レギュカルチンIgGを固相化し、そこ
に検量線用の種々の濃度のレギュカルチンあるいは患者
血清を結合させ、更にビオチン標識抗レギュカルチンIg
G及びペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合
させた後、発色基質にて発色測定し、検量線より患者血
清の濃度を算出することができる。また、抗レギュカル
チン抗体としては、ポリクローナル抗体、抗レギュカル
チン抗体産生ハイブリドーマから作製された抗レギュカ
ルチンモノクローナル抗体のいずれを用いることもでき
る。
【０００８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。なお、実施例に用いた試薬等は全て市販のものであ
る。ただし、抗レギュカルチン抗体は精製したレギュカ
ルチンをウサギに免疫し作製したものである。
明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。なお、実施例に用いた試薬等は全て市販のものであ
る。ただし、抗レギュカルチン抗体は精製したレギュカ
ルチンをウサギに免疫し作製したものである。
【０００９】実施例１ （抗レギュカルチンIgGの作製）プロテインＡカラムを
0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）で平衡化した
後、0.45μｍのフィルターでろ過した抗レギュカルチン
血清を注入した。非吸着画分溶出液の吸光度がベースラ
インに戻るまで0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）
で洗浄した。洗浄後、0.1Ｍグリシン緩衝液（pH7.2）で
IgG分画を溶出した。溶出液は１Ｍトリス溶液で中和し
た。得られたIgG分画は蒸留水にて一晩透析後、凍結乾
燥して使用時まで-70℃に保存した。
0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）で平衡化した
後、0.45μｍのフィルターでろ過した抗レギュカルチン
血清を注入した。非吸着画分溶出液の吸光度がベースラ
インに戻るまで0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）
で洗浄した。洗浄後、0.1Ｍグリシン緩衝液（pH7.2）で
IgG分画を溶出した。溶出液は１Ｍトリス溶液で中和し
た。得られたIgG分画は蒸留水にて一晩透析後、凍結乾
燥して使用時まで-70℃に保存した。
【００１０】（ビオチン標識抗レギュカルチンIgGの作
製）抗レギュカルチンIgG 10mgを、５mlの0.05Ｍ重炭酸
緩衝液（pH8.5）に溶解後、NHS-LC-Biotion 3.7mgを添
加して37℃で１時間反応することにより、ビオチンを抗
レギュカルチンIgGに結合させた。反応終了後、0.01Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で一晩透析した後、0.4
％ブロックエースで１mg protein/mlに調整して使用時
まで-70℃で凍結保管した。
製）抗レギュカルチンIgG 10mgを、５mlの0.05Ｍ重炭酸
緩衝液（pH8.5）に溶解後、NHS-LC-Biotion 3.7mgを添
加して37℃で１時間反応することにより、ビオチンを抗
レギュカルチンIgGに結合させた。反応終了後、0.01Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で一晩透析した後、0.4
％ブロックエースで１mg protein/mlに調整して使用時
まで-70℃で凍結保管した。
【００１１】（レギュカルチン濃度の測定）抗レギュカ
ルチンIgGを５mlの蒸留水で溶解後、0.1Ｍ炭酸緩衝液
（pH9.7）で30μg/mlに希釈し、96穴イノムプレートに5
0μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートすること
により、抗レギュカルチンIgGをイムノプレートに固相
化した。固相化終了後、0.05％ Tween20を含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）（以下、「TPBS」と略
す）で３回洗浄した。次に、１％ブロックエース溶液を
各ウエルに250μlずつ分注し、37℃で１時間インキュベ
ートすることによりブロッキングを行った。ブロッキン
グ終了後、TPBSで３回洗浄し、0.4％ブロックエースで
１〜15ng/mlに調整したレギュカルチン及び２倍又は10
倍に希釈した肝疾患患者血清を50μlずつ分注し、４℃
で一晩インキュベートした。インキュベート終了後、TP
BSで３回洗浄し、ビオチン標識抗レギュカルチンIgGを
0.4％ブロックエース溶液で30μｇ/mlに調整して各ウエ
ルに100μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートを
行った。インキュベート終了後、TBPSで３回洗浄し、0.
4％ブロックエース溶液で10,000倍に希釈したペルオキ
シダーゼ標識ストレプトアビジンを各ウエルに100μlず
つ分注し、37℃でインキュベートした。インキュベート
後、TPBSで５回洗浄し、基質溶液〔o-フェニレンジアミ
ンを0.1Ｍナトリウムリン酸クエン酸緩衝液（pH5.0）で
３mg/mlに希釈し、30％過酸化水素水を20μl/100mlにな
るように加えたもの〕を各ウエルに100μlずつ添加後、
室温で15分間酵素反応を行った。酵素反応の停止は、４
Ｎ硫酸を各ウエルに100μlずつ添加後、プレートミキサ
ーで撹拌することにより行った。吸光度の測定はEIAリ
ーダーにて検出波長492nmで行った。既知の濃度のレギ
ュカルチンで検量線を作成し、肝疾患患者血清中のレギ
ュカルチン濃度を算出した。
ルチンIgGを５mlの蒸留水で溶解後、0.1Ｍ炭酸緩衝液
（pH9.7）で30μg/mlに希釈し、96穴イノムプレートに5
0μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートすること
により、抗レギュカルチンIgGをイムノプレートに固相
化した。固相化終了後、0.05％ Tween20を含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）（以下、「TPBS」と略
す）で３回洗浄した。次に、１％ブロックエース溶液を
各ウエルに250μlずつ分注し、37℃で１時間インキュベ
ートすることによりブロッキングを行った。ブロッキン
グ終了後、TPBSで３回洗浄し、0.4％ブロックエースで
１〜15ng/mlに調整したレギュカルチン及び２倍又は10
倍に希釈した肝疾患患者血清を50μlずつ分注し、４℃
で一晩インキュベートした。インキュベート終了後、TP
BSで３回洗浄し、ビオチン標識抗レギュカルチンIgGを
0.4％ブロックエース溶液で30μｇ/mlに調整して各ウエ
ルに100μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートを
行った。インキュベート終了後、TBPSで３回洗浄し、0.
4％ブロックエース溶液で10,000倍に希釈したペルオキ
シダーゼ標識ストレプトアビジンを各ウエルに100μlず
つ分注し、37℃でインキュベートした。インキュベート
後、TPBSで５回洗浄し、基質溶液〔o-フェニレンジアミ
ンを0.1Ｍナトリウムリン酸クエン酸緩衝液（pH5.0）で
３mg/mlに希釈し、30％過酸化水素水を20μl/100mlにな
るように加えたもの〕を各ウエルに100μlずつ添加後、
室温で15分間酵素反応を行った。酵素反応の停止は、４
Ｎ硫酸を各ウエルに100μlずつ添加後、プレートミキサ
ーで撹拌することにより行った。吸光度の測定はEIAリ
ーダーにて検出波長492nmで行った。既知の濃度のレギ
ュカルチンで検量線を作成し、肝疾患患者血清中のレギ
ュカルチン濃度を算出した。
【００１２】かくして得られた健常人及び肝疾患患者の
血清中のレギュカルチン濃度を表１に示す。参考のた
め、GOT値及びGPT値も常法に従い測定し、表１に併せて
示した。
血清中のレギュカルチン濃度を表１に示す。参考のた
め、GOT値及びGPT値も常法に従い測定し、表１に併せて
示した。
【００１３】
【表１】
【００１４】健常人の血清中のGOT値は10〜38U/l、GPT
値は４〜35U/lであるが、肝疾患患者の中には有意に高
値を示さず正常範囲のものがあった。これに対し、肝疾
患患者の血清中のレギュカルチン濃度は明らかに上昇し
ている一方、健常人の血清中のレギュカルチン濃度は検
出限界（0.5ng/ml）以下であり、肝疾患患者と健常人の
血清を明確に鑑別できた。
値は４〜35U/lであるが、肝疾患患者の中には有意に高
値を示さず正常範囲のものがあった。これに対し、肝疾
患患者の血清中のレギュカルチン濃度は明らかに上昇し
ている一方、健常人の血清中のレギュカルチン濃度は検
出限界（0.5ng/ml）以下であり、肝疾患患者と健常人の
血清を明確に鑑別できた。
【００１５】
【発明の効果】本発明方法によれば、肝疾患患者の血清
を漏れなく鑑別することが可能である。
を漏れなく鑑別することが可能である。
Claims (1)
- 【請求項１】 血清中のレギュカルチンを測定すること
を特徴とする肝疾患患者血清の鑑別方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18044896A JPH1026623A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 肝疾患患者血清の鑑別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18044896A JPH1026623A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 肝疾患患者血清の鑑別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1026623A true JPH1026623A (ja) | 1998-01-27 |
Family
ID=16083416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18044896A Pending JPH1026623A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 肝疾患患者血清の鑑別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1026623A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003026408A1 (fr) * | 2001-09-20 | 2003-04-03 | Japan Science And Technology Agency | Modèle animal présentant une surexpression de régucalcine |
| WO2003038444A3 (en) * | 2001-10-31 | 2004-04-01 | Pfizer Prod Inc | Biomarkers of liver function |
| WO2005041648A1 (ja) * | 2003-11-04 | 2005-05-12 | Japan Science And Technology Agency | 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物 |
| CN103592438A (zh) * | 2013-05-29 | 2014-02-19 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | 肝损伤新诊断标志物调钙素的elisa检测试剂盒 |
-
1996
- 1996-07-10 JP JP18044896A patent/JPH1026623A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003026408A1 (fr) * | 2001-09-20 | 2003-04-03 | Japan Science And Technology Agency | Modèle animal présentant une surexpression de régucalcine |
| US7355093B2 (en) | 2001-09-20 | 2008-04-08 | Japan Science And Technology Agency | Model animal with overexpression of regucalcin |
| WO2003038444A3 (en) * | 2001-10-31 | 2004-04-01 | Pfizer Prod Inc | Biomarkers of liver function |
| WO2005041648A1 (ja) * | 2003-11-04 | 2005-05-12 | Japan Science And Technology Agency | 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物 |
| CN103592438A (zh) * | 2013-05-29 | 2014-02-19 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | 肝损伤新诊断标志物调钙素的elisa检测试剂盒 |
| CN103592438B (zh) * | 2013-05-29 | 2015-06-03 | 首都医科大学附属北京佑安医院 | 肝损伤新诊断标志物调钙素的elisa检测试剂盒 |
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