CN103592438B - 肝损伤新诊断标志物调钙素的elisa检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明“肝损伤新诊断标志物调钙素的ELISA检测试剂盒”，属于生物领域。本发明提供了一株新的小鼠杂交瘤细胞系GB118，保藏号为CGMCC：6909。该细胞系能够产生高效价，特异性，灵敏性好的单克隆抗体。本发明基于该单克隆抗体，从纯化抗体，优化反应条件等方面建立了用于检测调钙素蛋白的ELISA方法和试剂盒。实验数据表明，本发明提供的试剂盒和检测方法，具有良好的灵敏性，稳定性和特异性，能够很好地运用于调钙素蛋白的检测以及调钙素蛋白与肝损伤的相关关系中的研究。

Description

肝损伤新诊断标志物调钙素的ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肝损伤患者血清中调钙素水平的ELISA检测试剂盒及检测方法。
背景技术
肝脏炎症是各种原因损伤肝脏的共同后果，尤以各种病毒感染、药物损伤等因素多见。我国是HBV感染的高流行区，乙肝表面抗原阳性率为7.18％，而HCV感染者大约为3800万，近年来由于生活方式改变等多种因素的影响，酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病等亦有明显增多。HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌，是主要的疾病死亡原因之一。因此，病毒性肝炎仍然是严重威胁我国广大人民群众健康的最主要传染病之一。
肝脏炎症损伤程度对确定患者的诊断和治疗非常重要，例如对于慢性乙肝炎患者，肝脏炎症是进行抗病毒治疗的重要指征。目前，临床上广泛应用的肝脏损伤血清学指标主要是谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。多项研究表明，血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致。在转氨酶正常的慢性无症状HBV感染者中，肝组织完全正常的仅占极少数，大约90％左右的感染者有不同程度的肝组织炎症及纤维化。王福生等发现在86例血清ALT持续正常、HbeAg阴性的慢性乙肝感染者，组织病理均表现为不同程度的炎症，其中达G2级以上者站16.3％。而何金秋等发现在46例ALT正常的慢乙肝患者中，有20例(43.5％)患者肝组织炎症分级达G2级以上，而38例ALT轻度升高(1-2倍正常值上限)的患者中，28例(73.7％)达到G2级以上。由此可见，ALT和AST作为目前仅有的肝脏炎症指标，其临床意义具有一定的局限性。基于这一点共识，临床医生常常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，以明确肝脏炎症的真实情况。但该检查为创伤性检查，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作为诊断和疗效判断的常规手段。此外由于“酶胆分离”现象的存在，转氨酶对重型肝炎的诊断意义更差。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转氨酶的不足。
调钙素(regucalcin)是肝细胞胞浆中的一种可溶性蛋白质，含量非常丰富，占肝脏可溶性蛋白总量的2％，在肝脏损伤时可释放入血，国外研究表明调钙素在ALT正常的肝炎患者血清中升高，并且在重型肝炎患者血清中亦显著升高，提示其有可能作为反映肝脏炎症的新的血清标志物。人类调钙素基因位于染色体Xq11.3－11.23，cDNA长度为1438bp，分子质量为33KD。调钙素主要分布在肝细胞的细胞质、细胞核及肾近曲小管的刷状缘等处，提示与肝肾疾病密切相关。调钙素与衰老有关，因此又被称为衰老标记蛋白(Senescence markerprotein-30)。调钙素在多种组织、细胞内发挥着重要的生理作用，最主要的作用是调节细胞内钙稳态，此外还具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和(或)苏氨酸磷酸酶的作用，从而影响蛋白质磷酸化－去磷酸化这一细胞内重要的调节功能。调钙素还具有抑制细胞增殖的作用。
Yamaguchi M等研究发现，当间断给予大鼠CCL4诱导肝损伤时，ALT、AST等指标在第3天和第6天显著升高，在第18天和30天时恢复正常。而调钙素除了在第3天和第6天显著升高，在第18天和30天时仍显著高于正常，这与组织学恢复速度相吻合。Isogai M等予大鼠腹腔内注射半乳糖胺或者CCl4灌胃同样引起大鼠血清中ALT、AST和调钙素显著升高。Yamaguchi M等还检测了42例肝病患者血清中调钙素水平(包括急慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者)，发现血清中调钙素水平与ALT水平不完全平行，其中18例ALT和AST水平正常，而调钙素水平却显著升高，其浓度为3.7～69.6ng/ml。正常人血清中则不能检测到调钙素。Wei L等应用蛋白质组学和WB的方法研究发现，调钙素只在急性肝衰竭小鼠血浆中升高，并且仅在存活的小鼠中恢复至正常水平，而在正常小鼠为阴性。采用WB法对4例急性肝衰竭患者血清进行检测显示，患者血清中调钙素是正常人的3.65±0.34倍。因此，Wei L等认为调钙素在急性肝衰竭中不仅具有诊断意义，而且也有可能协助判断预后。
但遗憾的是国内外尚没有检测血清调钙素的试剂盒，极大地限制了临床应用及科研研究。目前有关该标志物与肝细胞损伤之间的关系仍然缺乏系统的对照研究，对肝衰竭患者相关研究仅进行了4例血清学WB检测。显然，评价调钙素的临床意义急需标准规范的试剂盒。尽管该课题组前期进行了一些研究，但由于某些限制，蛋白及抗体等未进行纯化，因此建立的双抗体夹心ELISA检测方法有待进一步优化。中国发明专利申请CN102901829A,检测钙调素水平的ElISA试剂盒及方法，公开了一株抗钙调素蛋白的单克隆抗体DC091，保藏号为CGMCC No.6509。是申请人实验室同期实验中获得的另外一株可用于检测血清钙调素的单克隆抗体，各方面表现优良。
发明内容
本发明根据上述领域的需求，基于筛选到的分泌调钙素蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及多抗构建了灵敏特异的调钙素ELISA检测方法和检测试剂盒，技术方案如下：
小鼠杂交瘤细胞系GB118，保藏号为CGMCC No.6909。
由所述小鼠杂交瘤细胞系GB118产生的抗血清
一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由上述杂交瘤细胞系GB118分泌而得。一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由上述的杂交瘤细胞系GB118制备而得。
一种结合调钙素蛋白的抗体，其重链可变区由上述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列所定义，和/或其轻链可变区由上述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列所定义。
一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于：所述酶标板微孔内包被有含权利要求2所述的单克隆抗体的包被液。
所述包被液中的单克隆抗体的浓度为0.5μg/ml。
所述ELISA试剂盒还包括抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
用于非诊断目的检测调钙素水平的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，酶联免疫反应中的第一抗体为权利要求2～4任一所述的抗体。
所述双抗夹心ELISA方法，还包括采用抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗；
所述抗调钙素蛋白多抗的工作稀释倍数为1000，所述酶标二抗的工作稀释倍数为5000。
所述ELISA方法中，在加多抗后反应条件为：37℃90分钟，加入酶标二抗后反应条件为37℃30分钟。
本发明一方面的贡献在于获得了一株优异的分泌调钙素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明另一方面的主要贡献在本发明基于该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，经过抗体纯化以及ELISA反应参数的选择和优化，提供了一种灵敏特异的检测调钙素蛋白的ELISA方法和试剂盒。根据中华人民共和国医药行业标准《酶联免疫吸附法检测试剂盒》(YY/T1183-2010)对该ELISA方法进行评价，各项指标均达到行业标准要求，该方法和试剂盒用于检测调钙素，灵敏度可达到ng/ml的水平，与其它蛋白无交叉反应，可用于特异性检测调钙素。
基于本发明所得的单克隆抗体，本领域技术人员采用现有技术，例如测序技术以及重组分子生物学技术等能够毫无疑义地获得其氨基酸序列，进而获得具有相同的抗原结合特性的嵌合抗体、人源化抗体，单链抗体，F(ab)2，小分子抗体，抗原结合片段等蛋白或多肽，这些衍生抗体的共性在于其抗原结合区的由本发明的单克隆抗体的对应区域的氨基酸序列所定义。
本发明的方法检测调钙素水平并非都有诊断目的有关，该方法的一个最主要的用途在于用于调钙素蛋白与肝损伤之间的相关性研究。本发明请求保护这种实施为非诊断目的检测。
在本发明的检测方法中，主要优化了单抗，多抗以及二抗之间的搭配，实验结果证明，本发明的10号单抗+多抗+羊抗兔酶标二抗是最优搭配。
本发明的检测方法中，还对上述搭配中的各种抗体的使用浓度进行了优化，实验表明一抗10号抗体的包被浓度为0.5μg/ml，多抗的工作稀释倍数为1000倍，酶标二抗的工作稀释倍数为5000倍。
本发明的检测方法中，还进一步对于双抗夹心ELISA反应中各步骤的反应条件以及试剂进行了优化和选择。最终得出稳定性，灵敏性以及特异性的表现良好的最优实施方式：
调钙素双抗体夹心ELISA检测方法基本建立，反应条件为：
①抗体组合：10号单抗+多抗+羊抗兔HRP酶标二抗
②蛋白及抗体稀释液：5％酪蛋白样品稀释液；封闭液：10％GS封闭液
③包被浓度：0.5μg/ml，包被条件：4℃过夜
④标准品选用不同浓度的市售调钙素蛋白，加样后4℃过夜
⑤多抗浓度：1:1000，反应条件：37℃90min
⑥羊抗兔HRP酶标二抗浓度：1:5000，反应条件：37℃30min
专业术语：
本发明所用的术语“单克隆抗体”指由杂交瘤细胞分泌产生的无杂质的单一免疫球蛋白。
本发明所用的术语“抗体”，指杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，以及基于原单克隆抗体的抗原结合区域序列信息，采用重组分子生物方法获得的嵌合抗体，人源化抗体，抗原结合片段，小分子抗体等具有与原单克隆抗体相同的抗原结合特性的分子。
生物保藏信息
保藏号：CGMCC No.6909
生物材料名称：小鼠杂交瘤细胞GB118
保藏日期：2012年11月29日
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区大屯路
附图说明
图1.调钙素重组蛋白基因测序结果。
图2.调钙素蛋白诱导前/后的上清及沉淀的电泳分析。
1.诱导前上清，2.诱导后上清，3.诱导前沉淀，4.诱导后沉淀，M.marker。
图3.重组调钙素蛋白GST亲和层析电泳分析。
1.粗提蛋白，2.流穿峰，3.洗脱峰。
图4.纯化重组调钙素蛋白电泳分析。
图5.腹腔接种杂交瘤细胞后BALB/c小鼠腹水产生情况。
左为对照BALB/c小鼠，右为腹水BALB/c小鼠。
图6.腹腔接种杂交瘤细胞后抽取BALb/c小鼠腹水。
图7.市售蛋白、重组蛋白与自制多抗及10号单抗的WB分析。
图8.单抗效价测定，其中，横坐标抗体稀释倍数，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
图9.多抗效价测定，其中，横坐标抗体稀释倍数，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
图10.ELISA方法以市售调钙素蛋白为标准品的标准曲线。
横坐标：调钙素浓度(ng/ml)，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
图11.调钙素重组蛋白浓度与校正浓度的相关性。
横坐标：重组蛋白校正浓度ng/ml，纵坐标：重组蛋白浓度ng/ml。
图12.双抗体夹心ELISA方法调钙素蛋白线性检测范围。
横坐标：调钙素蛋白浓度(ng/ml，lg)，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
图13.血清调钙素对慢加急/亚急性肝衰竭的诊断ROC曲线。
具体实施方式
下面通过具体试验数据说明本发明的技术方案。
实施例1 调钙素蛋白及抗体的制备、纯化及验证
1实验材料
1.1实验动物
BALB/c小鼠，清洁级，8周龄，体重18g～20g，雄性，购自中国军事医学科学院实验动物中心。
新西兰大耳白兔，清洁级，体重2.5～3.0kg，雌性，购自中国军事医学科学院实验动物中心。
1.2实验材料
可表达调钙素蛋白的质粒pGEX-4T-regucalcin((记载于李莉，高秀来，宋一志等.融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达.首都医科大学学报,2006,27(6):788-791.)
杂交瘤细胞系DC091(保藏号：CGMCC No.6509；分泌本发明的中用到的18号抗体)和杂交瘤细胞系GB118细胞(保藏号：CGMCC No.6909；分泌本发明的中用到的10号抗体)，培养条件：RPMI1640基础培养基+20％胎牛血清+1％青霉素/链霉素，温度：37℃，CO2浓度：5％。
1.3实验试剂
RPMI1640基础培养基 美国Sigma公司
弗氏抗原佐剂 美国Sigma公司
胎牛血清 美国Hyclone公司
青霉素-链霉素 北京康为世纪生物科技有限公司
胰酶粉 北京康为世纪生物科技有限公司
Hank’s液 美国Hyclone公司
DMSO冻存液 北京化工厂
调钙素市售单抗 美国Abcam公司
调钙素市售蛋白 美国Abcam公司
ITPG诱导剂 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
BL21感受态细菌 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
正辛酸 美国Sigma公司
硫酸铵 国药集团化学试剂有限公司
羊抗鼠及羊抗兔IgG(H+L)HRP 北京中杉金桥有限公司
PVDF膜 美国Bio-Rad公司
Fermentas预染蛋白Marker 立陶宛Fermantas公司
ECL发光试剂盒 北京四正柏生物科技有限公司
1.4主要试剂的配制
1.5实验仪器
光学倒置显微镜 日本OLYMPUS，CKX41型
CO2孵育箱 美国Thermo公司
台式离心机 上海安亭科学仪器厂
恒温水浴箱 北京市长风仪器仪表公司
温控摇床 New Brunswich USA
磁力搅拌器 北京北德科学器材有限公司
GST层析柱 美国GE Healthcare公司
超声碎菌仪 宁波新芝科器研究所
电泳仪 美国Bio-Rad公司
湿转转膜仪 美国Bio-Rad公司
全能型成像分析系统 美国Bio-Rad ChemiDoc MP
2实验方法和结果
2.1调钙素蛋白的表达
①调钙素质粒的基因测序：将可表达调钙素-GST融合蛋白的质粒pGEX-4T-regucalcin送检至宝生物工程(大连)有限公司进行基因测序，并在基因数据库(gene Bank)内与调钙素基因序列进行比较。
②将可表达调钙素-GST融合蛋白的质粒pGEX-4T-regucalcin感染感受态细菌BL21，200μl感受态细菌悬液与10μl质粒混合，冰上放置30分钟后，42℃水浴90s，热击后迅速置于冰上冷却3分钟。之后将BL21/pGEX-4T-regucalcin 1:1000接种于20ml含有氨苄青霉素(浓度为100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃200rpm摇床过夜。
③诱导蛋白表达：将上述菌液1:100的转接到1L含有氨苄青霉素(浓度为100μg/ml)LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.93，加入诱导剂异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，37℃，220rpm诱导3小时，培养液经9000rpm离心30分钟收集菌体，共4.2g。
④粗蛋白提取：在上述离心后菌体中加入破菌液，3”-3”冰浴超声20min，4℃9000rpm离心20min，留取沉淀，做为纯化制备用的粗蛋白。采用含8M尿素的变性蛋白缓冲液对包涵体沉淀进行溶解。
⑤变性蛋白复性：采用半换液透析复性方式，利用变性剂尿素浓度由8M到0M梯度降低的复性缓冲液1-7，对变性蛋白进行复性获得调钙素融合蛋白。
2.2调钙素融合蛋白的纯化
纯化所使用的GST柱为美国GE Healthcare公司生产，填料型号为Glutathione Sepharose 4Fast Flow，规格为直径1.5cm×高5cm，装填料共7ml，纯化缓冲液分别为BufferA，BufferB，BufferC。
①装柱：将粗蛋白液以及柱纯化缓冲液经0.45μm滤膜过滤待用。连接泵、层析柱和检测器待用。
②过柱：设置柱流速为0.5ml/min，Buffer A平衡柱子10个柱体积，70ml，平衡介质。
③上样：过滤后的粗蛋白液上样，上样后用Buffer B冲洗柱子10个柱体积，70ml，收集流穿液。
④洗脱：最后采用含有还原性谷胱甘肽(GSH)的Buffer C缓冲液冲洗柱子30个柱体积，210ml，收集洗脱液，即含有目的蛋白。
⑤浓缩及除菌：将已制备的调钙素融合蛋白装入处理过的透析袋内，埋于PEG20000中进行浓缩，将浓缩约10倍后的蛋白，以透析方式更换为缓冲液体系(1×PBS，1mM EDTA)中，经0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存。
⑥蛋白制备结束后，利用紫外分光光度计分别测定280nm及260nm波长下OD值，浓度的确定公式为C(浓度，mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
2.3杂交瘤细胞的培养
准备：打开水浴箱，调至42℃预热，紫外灯消毒超净台，RPMI-1640完全培养基，胰酶以及Hank’s液预热。
①细胞复苏：30分钟后，液氮中取出两株杂交瘤细胞DC091和GB118冻存管，立即投入水浴箱中，快速晃动至冻存液完全融解；将细胞冻存悬液移入10ml离心管中，加入约5ml 1640完全培养基(含20％胎牛血清及1％青霉素/链霉素)，用吸管吹匀；将细胞悬浮液离心，1000rpm，5min；后弃上清液，于沉淀物中再加入约5ml 1640完全培养基，轻轻用吸管吹匀，移入培养瓶，显微镜下观察细胞状态、形态，置入含5％CO2培养箱中37℃培养。
②细胞传代：CO2培养箱中取出细胞瓶，显微镜下观察细胞生长状况，细胞贴壁生长，生长致密，形态饱满；弃去培养基，加入适量Hank’s液，轻摇后弃去Hank’s液，加入适量胰酶，2～3分钟后倒掉胰酶，加入适量培养基，并用吸管轻轻吹打，再次观察细胞形态，可见大量细胞开始脱落，将细胞瓶中细胞液分装至其余两个细胞瓶中，补充1640完全培养基至5ml左右，继续置CO2培养箱中培养，传代完成。
③细胞冻存：将其中一部分吹散的细胞液置入离心管，于离心机进行离心，1500rpm，10分钟，离心后去除上清液，加入900μl全血清及100μl DMSO冻存液，边加边摇晃，使之充分混匀，吸取细胞悬液置冻存管中，在管壁上标记好细胞名称，冻存日期，归属人等。放入冰箱4℃保存30min后转至-20℃保存2小时，再转至-80℃过夜，次日转至液氮中保存。
2.4单克隆抗体的制备
DC091及GB118两株细胞进行小鼠腹腔接种产生单克隆抗体。步骤如下
①石蜡油诱导：选取BALB/c小鼠进行腹腔注射石蜡油诱导，0.5ml/只。
②腹腔接种：10～14天后，将培养至5×105-106的杂交瘤细胞弃去培养基，用1×PBS重悬清洗两次后对小鼠进行腹腔接种，0.5ml/只。
③抽取腹水，获得单抗：7～10天后观察小鼠腹腔腹水生成情况，根据鼠的健康状况可一次杀鼠取腹水，或间隔数日抽取腹水几次。将抽取的腹水2000rpm离心10min，去除沉淀，留取上清，上清液中则含有大量单克隆抗体。
2.5调钙素单抗的纯化
采用最常用的辛酸-硫酸铵法对已制备的8号及10号单抗进行纯化：
①腹水用60mmol/L醋酸缓冲液(pH7.4)稀释4倍，用4mol/LNaOH调节pH值至4.5。
②加正辛酸：由于腹水量大于3ml，故加入正辛酸25μl/ml，磁力搅拌30min，以6000rpm高速4℃离心30min，收集上清液。
③透析：透析袋经双蒸水煮沸10min及常温双蒸水清洗处理，将高速离心后上清液装袋4℃透析，透析液为1×PBS 3000ml以上，边磁力搅拌边透析，每2小时更换一次透析液，透析12小时。
④硫酸铵沉淀：根据透析后抗体体积，按每毫升0.27g的浓度加入硫酸铵，磁力搅拌30min。以4000rpm高速4℃离心15min，弃上清，收集离心后沉淀，用1×PBS溶解，其中PBS用量与原始腹水体积相同。
⑤透析：将粗提抗体装袋于1×PBS中4℃透析，边磁力搅拌边透析，以去除硫酸铵成分，透析液3000ml以上，透析24小时，其间更换5次透析液，可通过奈氏试剂检测是否透析干净，若橘红色变为蓝色则应继续延长透析时间。
单抗制备结束后，利用紫外分光光度计分别测定280nm及260nm波长下OD值，浓度的确定公式为C(浓度，mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
2.6多克隆抗体的制备及纯化
①皮下注射免疫：将调钙素蛋白0.5ml(即100ug)与弗氏抗原佐剂0.5ml混合，充分乳化，于背部及后肢不同部位多点(约4-5点)皮下注射免疫新西兰大耳白兔，每隔2周进行1次加强免疫，总计免疫5次。
②在第5次免疫后的10-14天进行心脏取血，4℃，10,000rpm离心10min，收集上清液即初步获得调钙素兔抗人多克隆抗体。
③多克隆抗体的纯化
多克隆抗体的纯化与单抗纯化基本相同，详见2.5。纯化后分别测定280nm及260nm波长下OD值计算多抗浓度。
2.7调钙素蛋白、单克隆抗体和多克隆抗体的Western Blot验证
通过以上方法，我们自行制备并纯化了调钙素蛋白、鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体，对于其是否真实有效，我们采用市售调钙素蛋白(购于美国Abcam公司)进行Western Blot方法的验证。
①样品处理：将自制调钙素蛋白、市售调钙素蛋白及各20μl，与2×loading buffer 20μl及β-巯基4μl充分混合，98℃煮沸5分钟，使之充分裂解。
②配胶与灌胶：清洗玻璃板，纱布擦干后置于温箱中晾干后取出。由于调钙素市售蛋白及自制融合蛋白的分子量分别为34kd和60kd左右，因此选择配置12％分离胶凝胶及5％浓缩胶。
12％分离胶 5％浓缩胶
去离子水 3.3ml 3.4ml
30％聚丙烯酰胺 4.0ml 0.83ml
1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 2.5ml ——
1.0M Tris-HCl(pH 6.8) —— 0.63ml
10％SDS 100μl 50μl
10％AP 100μl 50μl
TEMED 4μl 5μl
③上样与电泳：安装电泳槽，加入500ml SDS-PAGE电泳液，确保无渗漏。每孔加入蛋白5μl，80V电泳30min，待溴酚蓝压成一条直线时，转换为120V，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。
④转膜(湿转)：配置1000ml 1×转膜缓冲液倒入转膜槽备用。将凝胶取出，切去多余部分，按照凝胶大小剪出略大的滤纸2张和大小相近的PVDF膜1张，将PVDF膜置于甲醇中活化10～15秒，将凝胶、滤纸及PVDF膜浸泡入转膜缓冲液中，自负极至正极依次为滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸，注意在液面下操作，轻轻赶压使之勿留气泡，于4℃恒流100mA湿转2小时。
⑤封闭：配置5％脱脂奶粉，4℃封闭过夜。
⑥孵育一抗：分别孵育调钙素自制10号单抗(以1×PBS稀释至1:1000)及调钙素自制多抗(以1×PBS稀释至1:200)，室温下摇床孵育3小时，之后1×PBS洗膜3次，每次各10分钟。⑦孵育二抗：以1×PBS将羊抗鼠/兔二抗稀释至1:5000，室温下摇床孵育2小时，之后1×PBS洗膜3次，每次各10分钟。
⑧显色：将ECL发光试剂A 500μl与试剂B 500μl混合后，将膜均匀浸透，置于凝胶成像系统中曝光显色，曝光时间约为20-30秒，记录结果。
2.8调钙素单克隆抗体和多克隆抗体的ELISA验证及效价测定
①抗原包被：分别选择调钙素市售蛋白及调钙素自制蛋白进行包被，包被液为碳酸缓冲液(pH9.6)，包被浓度分别为1μg/ml，2μg/ml，均为100μl/孔，4℃过夜。
②封闭：采用3号封闭液37℃封闭2小时，自动洗板机洗3次。
③检测物：加入调钙素8号及10号单抗，以无关蛋白腹水单抗(抗心肌肌球蛋白单抗)作为阴性对照。另外加入调钙素自制多抗，并以正常兔血清作为阴性对照。所有检测物均进行倍比稀释，最高稀释倍数为1:1280万，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗板5次。
④二抗：分别加入1:10000稀释的羊抗鼠辣根过氧化物酶酶标二抗及羊抗兔辣根过氧化物酶酶标二抗，100μl/孔，37℃孵育1小时，洗板5次。
⑤显色及终止：加入TMB显色液A液50μl，B液50μl，37℃避光显色20min，之后加入终止液50μl/孔进行终止。
⑥读数：在450/630nm双波长下读取OD值结果。
3实验结果
3.1调钙素蛋白的表达及纯化
3.1.1基因测序证实表达确为调钙素
将在包涵体内表达的调钙素蛋白送检基因测序，并在gene Bank中与调钙素基因序列进行比较，二者符合率为100％，证实调钙素蛋白表达有效，见图1。
3.1.2调钙素蛋白在包涵体内表达：将IPTG诱导前后的上清液及沉淀进行电泳分析(图2所示)，发现诱导后沉淀组蛋白在理论的融合蛋白位置(即60Kd)左右出现明显阳性条带(红色箭头所示)，因此初步判断调钙素蛋白主要在包涵体内表达。
3.1.3大量诱导调钙素蛋白结果
大量诱导培养后菌体湿重4.2g，经GST柱纯化后获取蛋白浓度为323.4μg/ml，纯度为90.8％，共25ml，总量为8.08mg，见图3和图4
3.2单克隆抗体的制备
3.2.1DC091及GB118两株生长状态良好的杂交瘤细胞于BALB/c小鼠腹腔接种后7-10天，小鼠腹水产生较明显，根据小鼠健康情况，尽可能多地抽取腹水，离心，弃去油脂等杂质后，初步获得调钙素18号单抗及10号单抗各15ml，见图5和图6。
3.2.2经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后，获得8号及10号单抗各10ml，浓度分别为2.3mg/ml，2.2mg/ml。
3.3多克隆抗体的制备
总计5次免疫新西兰大耳白兔第15天左右，抽取动脉血，离心后血清即含有大量调钙素多克隆抗体，共收集血清约30ml，经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后共获得调钙素多抗20mg，浓度为2.37mg/ml。
3.4调钙素蛋白及抗体的验证
对自制调钙素重组蛋白、市售调钙素蛋白进行电泳，分别孵育调钙素10号单抗、自制调钙素多抗。
结果显示：三种抗体均可于自制重组蛋白及市售蛋白反应，由于重组蛋白为调钙素与GST的融合蛋白，分子量大小约60KD，故阳性条带(黄色箭头所示)出现在60KD左右。而市售蛋白仅含调钙素，故在34KD左右出现阳性条带(红色箭头所示)，由此可证实自制单抗及多抗的准确性，见图7。
3.5自制单抗及多抗的ELISA验证
以市售蛋白包被酶标板，分别加入18号单抗、10号单抗、多抗及市售调钙素单抗进行检测，结果表明我们自行制备的18号单抗、10号单抗及多抗均可与市售调钙素蛋白反应，即含有调钙素有效成分。
抗体稀释倍数 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 1:20480
18号单抗 2.898 2.936 2.877 2.960 2.900 2.673 1.900 1.030 0.740 0.316 0.251 0.198
10号单抗 1.013 0.868 0.888 1.097 0.615 0.696 0.734 0.641 0.466 0.302 0.231 0.161
多抗 2.846 2.792 2.822 2.62 2.673 2.89 2.528 1.956 1.143 0.754 0.363 0.253
抗体稀释倍数 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400 1:204800
市售单抗 1.289 1.283 1.194 1.043 0.814 0.609 0.446 0.271 0.185 0.119 0.089 0.077
3.6单抗的ELISA效价测定
经ELISA方法检测后，无关腹水单抗的OD值平均为0.027，以阴性对照值的2.1倍作为阳性参考值，则18号及10号单抗的效价分别为1:64万及1:512万，见图8。
稀释倍数 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:1280 1:2560 1:5120 1:1万 1:2万
无关腹水单抗 0.097 0.065 0.045 0.033 0.024 0.017 0.027 0.021 0.020 0.015 0.016 0.019
18号单抗 2.909 2.874 2.798 2.870 2.809 2.778 2.763 2.645 2.470 1.939 1.292 0.836
10号单抗 2.326 2.008 1.825 1.742 1.796 1.668 1.451 1.314 1.356 1.572 1.261 1.554
稀释倍数 1:4万 1:8万 1:16万 1:32万 1:64万 1:128万 1:256万 1:512万 1:1024万 1:2048万 1:4096万 1:8120万
无关腹水单抗 0.029 0.026 0.025 0.021 0.022 0.014 0.017 0.017 0.015 0.015 0.022 0.016
18号单抗 0.782 0.344 0.197 0.134 0.076 0.040 0.037 0.030 0.029 0.031 0.038 0.067
10号单抗 0.727 0.205 0.146 0.133 0.127 0.122 0.075 0.063 0.047 0.051 0.030 0.039
3.7多抗的ELISA效价测定
经ELISA方法检测后，正常兔血清的OD值平均为0.135，以阴性对照值的2.1倍作为阳性参考值，则调钙素多抗的效价为1:64万，见图9。
稀释倍数 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:1280 1:2560 1:5120 1:1万 1:2万
正常兔血清 0.182 0.173 0.175 0.151 0.133 0.129 0.127 0.121 0.123 0.139 0.132 0.132
调钙素多抗 3.0665 3.0545 3.025 2.9725 2.8985 2.8645 2.644 2.637 2.531 2.048 1.428 0.885
稀释倍数 1:4万 1:8万 1:16万 1:32万 1:64万 1:128万 1:256万 1:512万 1:1024万 1:2048万 1:4096万 1:8120万
正常兔血清 0.129 0.129 0.125 0.127 0.126 0.128 0.125 0.132 0.127 0.125 0.128 0.126
调钙素多抗 0.672 0.4245 0.312 0.262 0.233 0.2075 0.203 0.1975 0.1925 0.1825 0.1945 0.203
实施例2 调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的建立
1.实验材料
1.1实验试剂
试剂名称 购买来源
调钙素市售蛋白 美国Abcam公司
辣根过氧化物酶标二抗羊抗鼠 美国KPL公司
辣根过氧化物酶标二抗羊抗兔 美国KPL公司
羊抗鼠/兔HRP稀释液 湖州英创生物科技有限公司
包被液及包被稳定剂 同昕生物技术(北京)有限公司
显色剂 同昕生物技术(北京)有限公司
终止液 同昕生物技术(北京)有限公司
主要试剂的配制：
1.2实验仪器
紫外光分光光度仪UV-2550 日本SHIMADZU公司
恒温孵育箱 广州贵翔仪器有限公司
酶标仪Model 680 美国Thermo公司
96孔板 深圳金灿华实业有限公司
其他试剂及仪器同前。
2实验方法
2.1调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的建立
2.1.1调钙素单抗及多抗的辣根过氧化物酶(HRP)标记
①取抗体(18号单抗、10号单抗及多抗)各0.5ml，稀释至2mg/ml。
②活化HRP：称取5mgHRP，加入500μl的醋酸钠缓冲液，将500μl0.06mM高碘酸钠加入HRP中，4度搅拌30min，将500μl0.16mM乙二醇加入HRP中，室温10min搅拌。
③将活化好的HRP加入透析的抗体中，每种抗体加80μl，CB缓冲液透析过夜。
④将抗体从透析袋中取出，每个抗体加入5mg/ml硼氢化钠100μl，4度2小时。
⑤测量体积，加入等体积的饱和硫酸铵，12000rpm离心15min，沉淀用150μl1×PBS稀释，PBS透析，2小时换一次透析液，取出，加入甘油保存。
2.1.3棋盘滴定法明确最佳抗体组合(两步法)
①包被：包被抗体分别选用18号单抗、10单抗、多抗三种抗体，包被液为碳酸盐缓冲液(pH9.6)，包被浓度选择两种即1μg/ml与0.5μg/ml，100μl/孔，包被条件为4℃过夜。
②封闭：10％山羊血清封闭液100μl/孔，封闭条件为37℃2小时。
③检测物：对1例患者血清及15μg/ml自制调钙素蛋白(阳性对照)进行检测，100μl/孔，37℃30分钟。
④二抗：二抗选用之前已进行HRP标记的抗体，对于18号包被板，二抗分别选用HRP标记的10号单抗及多抗，同样对于10号包被板，二抗分别选用HRP标记的18号单抗及多抗；对于多抗包被板，二抗分别选用HRP标记的18号单抗及10号单抗。其中HRP酶标二抗的浓度分别采用1:500及1:1000进行稀释。加样量为100μl/孔，反应时间为37℃20分钟。
⑤显色：TMB显色剂(同昕生物)A液及B液各50μl/孔，37℃10分钟。
⑥终止及读数：加入终止液50μl/孔，在450/630nm双波长下读取OD值。
最终确定最佳抗体组合为：10号单抗+多抗
2.1.4三步法提高反应性
由于两步法的反应灵敏性不及三步法，因此在两步法初步确定最佳抗体组合的基础上，选择三步法对双抗体夹心方法进行改进。
①包被：包被抗体选择两步法确定的10号单抗，包被浓度在0.5μg/ml与1μg/ml中择优选择，100μl/孔，包被条件为4℃过夜。
②封闭：10％山羊血清封闭液100μl/孔，封闭条件为37℃2小时。
③检测物：对正常人血清及自制调钙素蛋白(阳性对照)进行检测，其中调钙素蛋白选择不同浓度，即15μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml，0.05μg/ml，0.005μg/ml，100μl/孔，反应时间为37℃60分钟。
④二抗：二抗选用之前确定的多抗，浓度在1:500及1:1000稀释倍数中择优选择，加样量为100μl/孔，反应时间为37℃60分钟。
⑤羊抗兔/鼠酶标二抗：根据最佳二抗选择羊抗兔/鼠HRP酶标二抗，稀释倍数暂选择1:10000，加样量为100μl/孔，反应时间为37℃60分钟。
⑥显色：TMB显色剂的A液及B液各50μl/孔，反应时间为37℃15分钟。
⑦终止及读数：加入终止液50μl/孔，在450/630nm双波长下读取OD值。
2.1.5样品稀释液及封闭液的选择
在上述三步法基础上，对两种样品稀释液(5％BSA样品稀释液、5％酪蛋白样品稀释液)及封闭液(5％BSA及10％山羊血清)分别进行选择。在酶标板封闭时，分别选用5％BSA及10％山羊血清封闭液，封闭条件均为37℃2小时。在调钙素蛋白及抗体稀释过程中，分别选用5％BSA及5％酪蛋白样稀两种样品稀释液进行稀释。其余反应条件均相同。
2.1.6酶标二抗最佳工作浓度的确定
在三步法最佳抗体组合，并采用最佳的封闭液及样品稀释液的基础上，对酶标二抗浓度进行摸索，分别进行1:5000，1:10000及1:15000的比例进行稀释，检测物分别为正常人血清及自制调钙素蛋白(250ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，5ng/ml及1ng/ml)，以确定酶标二抗的最佳工作浓度。
2.1.7样本最佳检测时间的确定
之前对于三步法的样本检测时间、二抗反应时间及酶标二抗反应时间分别采用常用的60min、60min、60min，现对三步反应时间进行摸索，以确定最佳反应时间。
对加入样本后反应时间进行三个条件的比较：①37℃60min②37℃90min③4℃过夜，其余反应条件均未进行改变，比较本底(即“空白+酶”孔)以及自制调钙素蛋白(300ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml)的检测结果。
2.1.8二抗及酶标二抗最佳反应时间的确定
经查阅文献，对二抗及酶标二抗的最佳反应时间进行如下两种条件的比较：①二抗60分钟，酶标二抗60分钟；②二抗90分钟，酶标二抗30分钟。其余反应条件均未进行改变，比较本底(即“空白+酶”孔)以及自制调钙素蛋白(300ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，5ng/ml，1ng/ml)的检测结果。
2.1.9市售蛋白与重组蛋白的相关性比较
由于经济学原因，在摸索实验条件的过程中所使用的阳性对照均为自制调钙素重组蛋白，现对市售调钙素蛋白(美国Abcam公司)与自制调钙素重组融合蛋白的关系进行比较。
在已建立的三步法双抗体夹心ELISA检测方法的基础上，阳性对照分别选择市售调钙素蛋白(150ng/ml，75ng/ml，37.5ng/ml，18.75ng/ml，9.375ng/ml)与自制调钙素重组蛋白(100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml)进行检测，依据市售调钙素蛋白浓度与OD值建立标准曲线(结果见图10)，明确上述方法是否同样适用于市售调钙素蛋白。同时计算重组蛋白OD值所对应的浓度(即为校正浓度)，并与重组蛋白浓度进行对比，明确市售调钙素蛋白与自制调钙素重组蛋白的定量对应关系。
2.2调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的评价
至此对于双抗体夹心ELISA检测方法的建立已基本完成，根据中华人民共和国医药行业标准《酶联免疫吸附法检测试剂盒》(YY/T 1183-2010)的要求，进行了线性检测范围、灵敏度、精密度、特异性及稳定性等指标的评价。
2.2.1线性检测范围
在已建立的双抗体夹心ELISA检测方法基础上，对不同浓度市售调钙素蛋白(150ng/ml，75ng/ml，37.5ng/ml，18.75ng/ml，9.375ng/ml，4.6875ng.ml及2.344ng/ml)进行检测，绘制标准曲线，明确该方法的线性检测范围。
2.2.2最低检测限(即灵敏度)
在已建立的双抗体夹心ELISA检测方法基础上，对不含抗原的0点浓度(即样品稀释液)进行20次重复检测，计算该20孔OD值的平均值(AV)与标准差(SD)，得到最低检测限所对应的的OD值(AV+2SD)，按照标准曲线计算AV+2SD所对应的的浓度即为该方法的最低检测限(即灵敏度)。
2.2.3可重复性(即批内差)
选择某一浓度市售蛋白在同一板内进行重复检测10次，计算其均值(AV)、标准差(SD)及变异度(CV＝AV/SD)，以明确板内各孔检测结果的可重复性。一般要求批内变异度<10％。
2.2.4特异性
由于所采用的自制调钙素重组蛋白为GST与调钙素的融合蛋白，为确定GST对双抗体夹心ELISA检测方法的特异性的影响，在已建立的双抗体夹心ELISA检测方法中，加入不同倍比稀释的GST蛋白(由质粒空载体表达)，记录其OD值。
另外进行中和实验验证特异性：选取7例肝功能受损患者血清，7例健康人血清，共14例，每份血清分为两份，
其中一份标本加入本本实施例1中2.5所测浓度的单抗隆抗体50μl，使血清中调钙素被“中和”浓度下降；
第二份标本加入等体积的PBS对照液，测量两份标本的吸光度并观察吸光度受到抑制的程度。
2.2.5稳定性
将已包被并封闭的酶标板于37℃恒温箱内放置一周，进行加速破坏性保存，并设置酶标板于4℃保存为对照，比较二者OD值的相对偏差，明确该检测方法的稳定性，一般要求其OD值下降不可超过20％。根据《中国生物制品规程2000》，37℃放置1天相当于试剂盒2-8℃放置2个月。
3实验结果
3.1调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的建立
3.1.1棋盘滴定法确定最佳抗体组合(两步法)
18号单抗、10号单抗及多抗三种抗体两两组合：①18号单抗包被+10号单抗-HRP；②18号单抗包被+多抗-HRP；③10号单抗包被+18号单抗-HRP；④10号单抗包被+多抗-HPR；⑤多抗包被+18号单抗-HRP；⑥多抗包被+10号单抗-HRP。经过不同包被浓度(0.5μg/ml及1.0μg/ml)，不同二抗浓度(1:500及1:1000)，通过“两步法”反应，对调钙素蛋白(15μg/ml)及1例患者血清进行检测，初步确定最佳抗体组合，即“10号单抗+多抗-HRP”反应最佳，多抗酶浓度1:500优于1:1000，包被浓度中1μg/ml与0.5μg/ml差异不明显，故考虑采用0.5μg/ml包被为宜。
3.1.2三步法初步提高灵敏性
在“两步法”筛选出的最佳抗体组合基础上，采用“三步法”对反应体系进行优化，证实“三步法”可进一步提高对调钙素蛋白的检测能力。
包被 第二抗体 酶标二抗 正常血清 15μg/ml 5μg/ml 0.5μg/ml 0.05μg/ml 0.005μg/ml
10号单抗 多抗1：2K 抗兔-HRP1:1W 0.089 2.606 2.679 2.25 0.862 0.158
3.1.3封闭液及样品稀释液的配制
在上述三步法基础上，对两种基质稀释液及封闭液分别进行选择，发现5％酪蛋白样品稀释液与10％山羊血清封闭液可以明显降低空白孔与酶的反应，并且在对重组调钙素蛋白的检测OD值亦较高，因此考虑采用5％酪蛋白样品稀释液对蛋白、抗体进行稀释，封闭则选用10％山羊血清封闭液。
3.1.4酶标二抗最佳工作浓度的确定
在采用5％酪蛋白稀释液及10％山羊血清封闭液的三步法基础上，比较不同酶标二抗浓度的影响。结果：羊抗兔辣根过氧化物酶1:5000浓度时，对空白+酶的OD值影响不明显，但对于重组蛋白检测的OD值则明显升高，因此初步确定酶标二抗的浓度为1:5000。
羊抗兔-HRP 正常血清 空白+酶 250ng/ml 100ng/ml 50ng/ml 25ng/ml 5ng/ml 1ng/ml
1：15000 0.054 0.027 1.802 0.937 0.531 0.313 0.09 0.04
1：10000 0.082 0.039 2.314 1.442 0.831 0.493 0.145 0.071
1:5000 0.099 0.048 2.499 1.49 0.897 0.508 0.151 0.068
3.1.5样本反应时间的选择
在上述反应条件基础上，对检测物反应条件进行4℃过夜、37℃60min、37℃90min三种条件的比较。结果：与37℃60min相比，4℃过夜及37℃90min均能提高调钙素蛋白的反应OD值，但37℃90min同时造成空白+酶孔的本底OD值升高，而4℃过夜则不明显，因此考虑加入检测物后4℃过夜为最佳反应时间。
3.1.6二抗及酶标二抗反应时间的选择
当第二抗体反应时间在90min，酶标抗体为30min时，对空白+酶孔影响不大，但对调钙素蛋白的反应OD值则明显升高。
3.1.7市售蛋白与重组蛋白的相关性比较
在上述建立的双抗体夹心ELISA检测方法中，利用市售蛋白建立标准曲线，并与重组蛋白浓度相对应，发现上述反应条件同样满足市售调钙素蛋白的检测，以市售调钙素蛋白作为标准品，建立标准曲线，r2均在0.99以上，具有很好的线性范围。此外，重组蛋白与市售蛋白的调钙素含量具有直线相关性，见图11所示。
表10 市售蛋白标准曲线的建立
综上，调钙素双抗体夹心ELISA检测方法基本建立，反应条件为：
①抗体组合：2号单抗+多抗+羊抗兔HRP酶标二抗
②蛋白及抗体稀释液：5％酪蛋白样品稀释液；封闭液：10％GS封闭液
③包被浓度：0.5μg/ml，包被条件：4℃过夜
④标准品选用不同浓度的市售调钙素蛋白，加样后4℃过夜
⑤多抗浓度：1:1000，反应条件：37℃90min
⑥羊抗兔HRP酶标二抗浓度：1:5000，反应条件：37℃30min
3.2调钙素双抗体夹心ELISA检测方法的评价
3.2.1线性检测范围
对不同浓度市售调钙素蛋白(150ng/ml，75ng/ml，37.5ng/ml，18.75ng/ml，9.375ng/ml，4.6875ng/ml及2.344ng/ml，1.17ng/ml)进行检测，均为复孔，绘制标准曲线，经过多次重复实验，证实该ELISA方法在1.17ng/ml-150ng/ml范围内具有很好的线性关系。见图12
3.2.2最低检测限(即灵敏度)
对“0”点浓度进行重复检测20次，计算均值(AV＝0.039)及标准差(SD＝0.004851)，根据AV+2SD计算最低检测限，为0.7618ngml，即该双抗体夹心ELISA检测方法的灵敏度为0.7618ng/ml。
3.2.3批内差(即可重复性)
选择市售调钙素蛋白75ng/ml浓度在同一板内进行重复检测10次，计算其均值(AV)、标准差(SD)及变异度(即CV＝AV/SD)，该检测方法CV＝7％，符合板内CV<10％标准，证明所使用的调钙素包被板各孔之间的检测具有很好的可重复性。
OD值 0.77 0.77 0.72 0.70 0.71 0.79 0.76 0.77 0.80 0.77
浓度(ng/ml) 69.96 69.00 63.06 60.81 61.21 72.59 68.86 69.13 73.71 70.10
3.2.4特异性
在已建立的双抗体夹心ELISA检测方法中，加入不同比例稀释的GST蛋白，明确该检测方法对调钙素检测的特异性，结果显示GST蛋白的检测OD值在0.15以下，并且随着GST蛋白的稀释，其OD值并无明显变化，因此证明该ELISA检测方法对调钙素的检测特异性较高。
GST蛋白稀释比例 1:4 1:16 1:64 1:128 1:1280
OD值 0.183 0.180 0.177 0.156 0.129
中和反应结果显示，7例患者血清经本发明10号抗体中和后，吸光度值均明显降低，抑制率为84.1％-96.6％，而健康人的血清经中和反应后吸光值与对照基本没有差别，说明本发明获得的克隆抗体能特异性结合肝损伤患者血清中的蛋白，但是健康人群OD值较低，且无
明显中和反应，结果如表5所示：
表5 应用本发明获得的单克隆抗体中和肝患者血清及健康血清前后吸光度的检测
3.2.5稳定性
将该检测方法所需的包被板采用37℃加速性破坏保存一周，与4℃保存条件相比较，结果：37℃加速破坏1周与4℃相比较，37℃保存的包被板与4℃保存相比OD值无明显改变(平均比值为102％)，根据《中国生物制品规程2000》，37℃放置1天相当于试剂盒2-8℃放置2个月，因此证明调钙素双抗体夹心ELISA检测方法可至少存放28月以上，具有很好的稳定性。
4结论
4.1调钙素双抗体夹心ELISA检测方法基本建立，反应条件为：
①抗体组合：2号单抗+多抗+羊抗兔HRP酶标二抗
②蛋白及抗体稀释液：5％酪蛋白样品稀释液；封闭液：10％GS封闭液
③包被浓度：0.5μg/ml，包被条件：4℃过夜
④标准品选用不同浓度的市售调钙素蛋白，加样后4℃过夜
⑤多抗浓度：1:1000，反应条件：37℃90min
⑥羊抗兔HRP酶标二抗浓度：1:5000，反应条件：37℃30min
4.2以市售调钙素蛋白作为标准品，建立标准曲线，r2均在0.99以上，达到cFDA的ELISA行业最新标准所要求的0.98以上标准。
4.3该双抗体夹心ELISA检测方法的灵敏度为0.7618ng/ml，所有血清检测水平均高于此最低检测限。
4.4调钙素包被板各孔之间的检测具有很好的可重复性，CV＝7％,达到cFDA的ELISA行业最新标准所要求的10％以内标准。
4.5该双抗体夹心ELISA检测方法与GST蛋白基本无反应，且中和试验抑制率为84.1％-96.6％，特异性较好。
4.6调钙素双抗体夹心ELISA检测方法置于37℃加速破坏保存的包被板与4℃保存相比OD值比值为102％，根据《中国生物制品规程2000》，37℃放置1天相当于试剂盒2-8℃放置2个月，该试剂盒可至少存放28个月以上。
实施例3肝病患者血清调钙素水平的测定及意义
既往研究表明，血清调钙素在肝损伤时可显著升高，在重型肝炎患者升高更加显著，但是由于检测方法的局限、病例数量偏少等原因，血清调钙素对于肝损伤的诊断意义尚未明确。我们通过检测正常人、慢性肝炎及慢加急/亚急性肝衰竭患者的动态血清调钙素水平，对调钙素的临床意义进行了初步研究。
1实验材料
1.1实验试剂
调钙素市售蛋白 美国Abcam公司
辣根过氧化物酶标二抗羊抗兔 美国KPL公司
羊抗兔HRP稀释液 同昕生物(北京)有限公司
样品稀释液 同昕生物(北京)有限公司
1.2实验仪器
恒温水浴箱 广州贵翔仪器有限公司
酶标仪Model 680 美国Thermo公司
96孔板 深圳金灿华实业有限公司
2实验方法
2.1研究对象
2.1.1正常人：
2.1.2慢性肝炎患者：包括慢性乙型病毒性肝炎及慢性丙型病毒性肝炎，诊断标准分别参考中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》《慢性丙型肝炎防治指南(2004年版)》，具体为：
慢性乙型肝炎：既往有乙型肝炎病史或血清HbsAg阳性超过6个月，先HbsAg和/或HBVDNA仍为阳性，ALT持续或反复升高或肝组织学检查有肝炎病变者可诊断为慢性乙型肝炎，其中HbeAg可为阳性或阴性。
慢性丙型肝炎：HCV感染超过6个月，或发病日期不明、无肝炎史，但肝脏组织病理学表现为慢性肝炎，或依据症状、体征、实验室及影像学结果综合分析，亦可诊断。
2.1.3慢加急/亚急性肝衰竭患者：为在慢性肝病基础上，短期内发生急性肝功能是代偿的主要临床表现，诊断标准参考中华医学会《肝衰竭诊疗指南(2006年)》，具体为：黄疸进行性加深(血清总胆红素≥171μmol/L或每日上升≥17.1μmol/L)，且凝血酶原活动度(PTA)≤40％。入选标准：
年龄18～60岁；性别不限；符合上述疾病的诊断标准；经患者签署知情同意。
排除标准：
确诊的肝癌患者以及影像学有肝脏占位者；
临床诊断不明确的肝功能异常患者；
其他严重身心疾病，包括心脏、肾脏、肺脏、糖尿病、高血压等。
临床标本收集：
选取2010年6月至2013年3月在我院确诊的肝病患者138例(男性103例，女性35例)。其中，慢性病毒性肝炎47例(男性35例，女性12例)；重型肝炎91例(男性68例，女性23例)，均为晨起空腹采血。另有33例健康体检者作为阴性对照组，取晨起空腹单采血清，2500rpm离心10min，取上清液即得到血清标本，-80℃保存，待统一检测。
2.3血清中调钙素的ELISA定量检测
按照实施例2建立的调钙素双抗体夹心ELISA检测方法，以市售调钙素蛋白为标准品建立标准曲线，对入选患者及正常人血清进行统一检测，通过酶标仪测450/630nm双波长下的OD值，计算患者及正常人血清调钙素水平。
2.4统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，数据经Shapiro-Wilk(W检验)呈正态分布者采用均数±标准差(X±S)，非正态分布者则采用中位数(最小值～最大值)表示，多组之间的比较采用方差分析(方差齐)或多独立样本的秩和检验(方差不齐)，相关性采用Spearman相关分析(数据呈非正态分布)，p<0.05有统计学意义。
3实验结果
3.1收集临床血清标本
收集标本，均为晨起空腹采血，另外正常人血清为晨起空腹单采血清。2500rpm离心10min，取上清液即得到血清标本，-80℃保存。总体标本如下：
患者 例数(男：女)
正常人 33(13:20)
慢性病毒性肝炎 47(35:12)
慢加急/亚急性肝衰竭 91(68:23)
总数 171(116:55)
表17 临床标本各指标统计值
正常人 慢性病毒性肝炎 慢加急/亚急性肝衰竭
N 33 47 91
年龄(岁) 38(20～58) 35(18～73) 45.5(16～77)
性别(男：女) 13:20 35:12 68:23
ALT(U/L) 21.0±7.1 53.3(8.7～1095.3) 73.6(12～1188)
AST(U/L) 21.0(18.0～28.0) 49.8(16.6～432.9) 90.65(8～1192)
TBIL(μmol/L) 11.1±3.2 19.1(8.0～753.9) 355.25(13～965)
ALB(g/L) -- 38.2±4.4 32.8(19～47)
PALB(mg/L) -- 117.4±51.6 65.7(26～212)
CHE(U/L) -- 5845.0(1539～13100) 3996.5(975～8930)
TBA(umol/L) -- 15.55(1～276.30) 161.70±68.15
CREA(umol/L) 62.0(47.0～93.0) 68.1(1.32～95.7) 65.15(23～263)
BUN(mmol/L) 4.84(3.26～46.80) 3.94(2.03～40.40) 5.11(1～39)
PTA(％) 95.5(94～99.8) 91.4(9.27～116.2) 51.49±17.37
INR -- 0.99(0.84～1.34) 1.60(1～4)
MELD -- 4.98(-5.49～35.30) 19.13±6.862
Regucalcin(ng/ml) 2.02(1.26～3.74) 3.73(1.47～9.03) 5.36(1.40～17.00)
病因 乙肝/丙肝:36/11 好转：50
轻度：5/7 恶化或死亡：41
中度：9/3
重度：22/1
3.2绘制标准曲线
在检测临床样本时，共计使用3块酶标本，分别建立标准曲线，根据患者血清或者正常人血清的OD值计算其血清调钙素含量。经直线双对数描绘的3条标准曲线拟合良好，R2均大于0.99以上，以其中一条标准曲线为例，标准曲线方程为y＝-1.23668+0.74006*x，r2＝0.99414，OD值与调钙素水平有明显对应关系，可据此计算血清调钙素水平。
3.3慢性肝炎及肝衰竭患者血清和正常人血清调钙素蛋白水平
3.3.1不同肝脏疾病患者调钙素水平的检测
利用调钙素双抗体夹心ELISA检测方法，总共检测正常人血清(33例)，慢性肝炎血清(47例)，慢加急/亚急性肝衰竭患者(91例，其中好转50例，恶化或死亡41例)。
经标准曲线计算调钙素水平，结果显示正常人血清调钙素水平为2.02(1.26～3.74)ng/ml，慢性肝炎患者血清调钙素水平为3.73(1.47～9.03)ng/ml，而慢加急/亚急性肝衰竭患者血清调钙素水平则为5.36(1.40～17.00)ng/ml，由于三类人群血清调钙素水平方差不齐，故采用秩和检验，结果显示三者具有明显统计学差异(p均≤0.001)，见图11。
3.3.2血清调钙素水平对肝损伤诊断的意义
血清调钙素水平诊断慢性病毒性肝炎肝损伤时，ROC曲线下面积(AUC)为0.866(95％CI：0.786～0.946,p＝0.000)，其cutoff值为2.42ng/ml，敏感度为85.7％，特异性为78.8％；
在鉴别慢性病毒性肝炎和慢性急性肝衰竭ACLF时，调钙素的AUC为0.721(95％CI：0.633～0.809,p＝0.000)，cutoff值为4.26ng/ml，敏感度为77.0％，特异性为61.2％，见图13
表18 血清调钙素水平对不同肝脏疾病的诊断意义
表18 (续)
3.4血清中调钙素浓度与各肝损伤血清学指标之间的相关性研究
每组患者血清检测指标包括肝功能、MELD评分等均不服从正态分布，故采用Spearman相关分析来研究血清中调钙素浓度与各检测指标的关系。
结果显示，调钙素与AST，TBIL，ALB，CHE，PT，PTA，INR，MELD之间有一定相关性，而与ALT，BUN，CREA，MELD则无明显相关性

Claims (9)

1.小鼠杂交瘤细胞系GB118，保藏号为CGMCC No.6909。
2.权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞系GB118产生的抗血清。
3.一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的杂交瘤细胞系GB118制备而得。
4.一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于：所述酶标板微孔内包被有含权利要求3所述的单克隆抗体的包被液。
5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，所述包被液中的单克隆抗体的浓度为0.5μg/ml。
6.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒还包括抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫新西兰大耳白兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
7.用于非诊断目的检测调钙素水平的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，酶联免疫反应中的第一抗体为权利要求3所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的双抗夹心ELISA方法，还包括采用抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗；
所述抗调钙素蛋白多抗的工作稀释倍数为1000，所述酶标二抗的工作稀释倍数为5000。
9.根据权利要求8所述的双抗夹心ELISA方法，所述ELISA方法中，在加多抗后反应条件为：37℃90分钟，加入酶标二抗后反应条件为37℃30分钟。
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