WO2005041648A1 - 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物 - Google Patents
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- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Definitions
- the present invention relates to a hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animal, preferably a hyperlipidemia and Z or hyperglycemia which is a transgenic non-human regucalcin-overexpressing non-human animal bred to old age.
- the present invention relates to a method for screening a therapeutic drug for hyperlipidemia and z or hyperalbuminemia using a model animal for hyperalbuminemia, a model for hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia.
- Ca2 + plays a leading role in a mechanism in which a peptide hormone binds to a cell membrane receptor and transmits that information into cells.
- the power of many proteins that bind Ca 2+ in cells Calmodulin plays an important role as a protein that amplifies its effects, and Ca 2+ binds to calmodulin and is involved in regulating cell functions It has been elucidated to activate various enzymes (Science, 202, 19-27, 1984). Further, Ca 2 + are also known to act on protein kinase C or other Ca 2+ binding proteins (enzymes including) (Science, 233, 305-312, 1986).
- Regucaltin is also a Ca 2+ binding protein from which rat liver cytoplasmic strength was also isolated by the present inventors.
- Regucaltin is a Ca 2+ binding protein with a molecular weight of 33388, its Ca 2+ binding constant is 4.19 ⁇ 10 5 M- 1, and it has 6-7 high-affinity Ca 2+ binding sites. It is an acidic protein with an isoelectric point ⁇ 5.20, which is remarkably present in the liver and contains 34% of ⁇ -helical structure. Regulcalcin is a unique protein that does not contain the EF hand structure (region) found in calmodulin and many other Ca 2+ binding proteins.For example, by binding Ca 2+ , calmodulin becomes ⁇ - While the helix content increases and its structure becomes firmer, Regyukartin decreases the ⁇ -helix content.
- regucalcin inhibits enzyme activity induced by calmodulin and also inhibits activation of protein kinase C.
- a great deal of knowledge has been accumulated, such as that regucalcin functions as a regulatory protein for signaling (FEBS Lett, 327, 251-255, 1993).
- the regucalcin gene is present on the X chromosome (Xq 11.1-12) in rats, and is also located on the X chromosome in humans.
- the regucalcin gene is found in higher animals such as monkeys, mice, dogs, puppies, puppies, and chickens, in addition to rats and humans, but is thought to encode a highly differentiated protein comparable to yeast. Te ru.
- Regucaltin cDNA has been cloned, and its entire structure has also been determined (JP-A-7-123985).
- Rat liver regucalcin cDNA has 0.897 kb base pairs encoding all amino acids and translates 299 amino acids.
- the nucleotide sequence of mouse liver-human liver regucalcin cDNA has been determined, and has homology of 94% and about 89%, respectively, as compared to rat liver regucalcin cDNA.
- the expression of regucalcin mRNA is observed in the liver of humans, rats, mice, mice, and mice, and the presence of regucalcin protein has been confirmed in these livers.
- Regucaltin is a multifunctional protein characterized as a regulatory protein for intracellular Ca 2+ signaling, and is known to be an important protein involved in the regulation of cell function (Life Sciences 66, 1769-1780, 2000, Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 1-6, 2000).
- the expression of regucalcin in the liver and kidney in vivo decreases during liver injury (Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994) and kidney injury (Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995) This has been demonstrated in animal experiments, suggesting that regucalcin is associated with pathogenesis.
- a method for distinguishing sera from patients with liver disease by measuring the serum concentration of regucalcin that is specifically present in the liver, unlike existing liver function markers such as GOT, GPT, etc. It is known that regucalcin is significantly increased in serum, while regucalcin is hardly detected in serum of healthy humans, and its measurement is also known to be useful as a means for differentiating sera from patients with liver diseases (Japanese Patent Laid-Open No. 0-26623).
- the regucalcin protein is specifically expressed in the liver, is also expressed at low levels in the kidney, heart, and cerebrum (neural cells), and is responsible for the intracellular Ca 2+ signaling-related cell functions.
- Unique multifunctional protein that is involved in regulation and causes a physiological abnormality when its expression is reduced Its function has been analyzed using protein ⁇ anti-regucalcin monoclonal antibody, which has been isolated from rat liver so far.
- protein ⁇ anti-regucalcin monoclonal antibody which has been isolated from rat liver so far.
- Regulation of intracellular calcium transport enzyme, role of protease as an activator, regulation of calcium transport in cell nucleus, role in nuclear DNA degradation, regulation of cell nucleus function during liver regeneration, renal tubule The present inventors have clarified the functional role of regucalcin in many bioregulations, including its role in calcium reabsorption.
- regucalcin has a specific action different from many other Ca 2+ binding proteins, and calcium was involved. It is thought that the regulation of the functions of various cells that take place is based on a balance between the expression level of regucalcin in vivo and the expression levels of many other Ca 2+ binding proteins, including calmodulin. When the balance between the expression level and the expression levels of many other Ca 2+ -binding proteins was lost, the effect of the transformation on the living body was examined by preparing transgenic rats.
- rat liver cDNA library From the rat liver cDNA library, cloning of regucalcin cDNA was performed, cDNA encoding the full-length regucalcin protein was isolated, ORF was excised from the full-length rat regucalcin cDNA, and introduced into the expression vector (PCXN2).
- the expression vector is injected into the male pronucleus of a rat fertilized oocyte by micro-mouth injection, and the fertilized egg is transplanted into the oviduct of a foster rat, a rat is developed, DNA is extracted from the tissue of the offspring, and the regular carcinoma is obtained by PCR.
- Bone components calcium content, activity of alkaline phosphatase, a marker enzyme of osteoblasts and osteoblasts, DNA content as an index of cell number in bone tissue
- Morphologically and biochemically especially in the femur
- it shows remarkable bone pathology such as weakening of bone tissue due to bone resorption (bone mineral dissolution) due to decrease in bone density, bone morphology change, and coccyx growth retardation. Reported that it is stable for successive generations and can withstand commercial production (JP-A-2003-164238).
- hyperlipidemia refers to a condition in which the concentration of lipids such as cholesterol / triglyceride in serum has increased, and is closely related to the development of circulatory diseases such as arteriosclerosis, hypertension, and stroke.
- Hyperalbuminemia refers to a condition in which the concentration of albumin in the serum synthesized in the liver has increased, and is related to various liver diseases.
- a hyperlipidemia foot K. Yamasaki and Y. Yoshikawa, Laooratory Animal Science A4 (2), 1994
- Non-human mammals presenting diseases caused by abnormalities in vitamin D metabolism such as
- LDL Oow density lipoproteins LDL Oow density lipoproteins
- a disease model animal useful for a hyperlipidemia treatment model obtained using non-human mammalian embryonic stem cells in which the LDL Oow density lipoproteins (LDL Oow density lipoproteins) receptor gene has been inactivated Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-56915. Gazettes), diabetic (NIDDM) rats (ZDFZGmi-faZfa; Nippon-Charles Ribaichi), SDF (Spontaneously Diabetic Torii) rats (Torii Pharmaceutical Co., Ltd.), and W HHL / Egret (Kitayama Labes Z oriental yeast). ing.
- An object of the present invention is to provide hyperlipidemia and Z or hyperalbumin useful for the development and prevention of hyperlipidemia, which is rapidly increasing due to recent changes in lifestyles.
- Model animals, especially hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animals that develop hyperlipidemia or hyperalbuminemia in the old (aged) period (middle-aged or older in humans), and such hyperlipidemia
- the transgenic rat overexpressing regucalcin which has already been developed by the present inventors, causes osteoporosis during the 5-week-old growth period, and its usefulness as a model animal has been evaluated and has already been reported.
- a powerful Regucaltin transgenic rat is aged ( They were bred until the aging stage (in humans, middle-aged and older) and examined for changes in biological functions. When rats were dissected at aging (36 weeks) (9 months old), the serum albumin was increased in addition to the known bone loss and increased serum inorganic phosphorus concentration in growing rats.
- the present invention has been completed based on these findings.
- the present invention relates to (1) a transgenic non-human animal capable of introducing a regucalcin gene and overexpressing regucalcin, a model animal of hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia;
- the hyperlipidemia according to the above (1) which is obtained by breeding a nick non-human animal until the age of aging (aging), which exhibits symptoms of hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia.
- transgenic non-human animals females
- the non-human animal exhibits a bone disease state in the old age (aging).
- hyperlipidemia and (5) a high fat according to any one of (1) to (4) above, wherein (6)
- the present invention provides (7) the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia according to the above (6), wherein the senility (aging) period is 36 weeks to 50 weeks of age.
- (8) a method of using a transgenic non-human animal into which a regucalcin gene is introduced and overexpressing regucalcin as a model animal for hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia;
- Transgenic non-human animals are bred to old age (age) and used as model animals for hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia;
- the method according to (8) above wherein the non-human animal (female) is bred until it exhibits symptoms of hyperalbuminemia and used as a model animal for hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia, and (11) It has been found that non-human animals exhibit bone pathology during old age (aging).
- (12) a method according to any displacement, (12) (8), which is a homozygote - (11), to a method as claimed or misalignment
- the present invention provides (13) the method according to any one of the above (8) to (12), wherein the non-human animal is a rat; The method according to the above (13), wherein the age is one week to 50 weeks, or (15) the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia described in the above (1) to (7).
- the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animal according to any of (1) to (7) above, wherein the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia
- the test substance is administered by the age of aging, and the lipid and Z or albumin levels in the blood are measured and evaluated after the age of the aging (aging).
- a screening method for a prophylactic Z or hyperalbuminemia is provided.
- FIG. 1 is a graph showing the results of measurement of serum calcium in 36-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- FIG. 2 shows serum minerals of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention. It is a figure which shows the measurement result of phosphorus.
- FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of serum zinc in 36-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- FIG. 4 is a graph showing the results of measurement of serum glucose of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention.
- FIG. 5 is a graph showing the measurement results of serum triglycerides of 36-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- FIG. 6 is a graph showing the measurement results of serum HDL cholesterol in 36-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- FIG. 7 is a graph showing the results of measurement of serum albumin of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention.
- FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the body weight of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention.
- FIG. 9 is a view showing the results of measuring the amount of calcium in the diaphysis and metaphysis of the femur of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention.
- FIG. 10 is a view showing the measurement results of the DNA content (index of cell number) of the diaphysis and metaphysis of the femur of a 36-week-old regucalcin transgenic rat of the present invention. .
- FIG. 11 is a graph showing the results of measurement of serum free fatty acids of regucalcin transgenic rats at the age of 14, 25, 36, and 50 weeks of the present invention.
- FIG. 12 is a graph showing the results of measuring serum triglycerides of regucalcin transgenic rats at the age of 14, 25, 36 and 50 weeks of the present invention.
- FIG. 13 is a graph showing the results of measurement of serum HDL cholesterol in 14, 25, 36, and 50-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- FIG. 14 is a graph showing the results of measurement of serum free cholesterol in regucalcin transgenic rats at the age of 14, 25, 36 and 50 weeks of the present invention.
- FIG. 15 is a graph showing the results of measurement of serum albumin of 14, 25, 36, and 50-week-old regucalcin transgenic rats of the present invention.
- the model animal of the present invention is not particularly limited as long as it is a transgenic non-human animal into which a regucalcin gene is introduced and overexpresses regucalcin, and is a model animal of hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia.
- the method of the present invention uses a transgenic non-human animal into which a regucalcin gene has been introduced and overexpresses regucalcin as a model animal for hyperlipidemia and z or hyperalbuminemia.
- the method is not particularly limited as long as the method is used.
- overexpressing regucalcin refers to expressing a significantly large amount of regucalcin as compared to the expression level of regucalcin in a wild-type non-human animal.
- the non-human animal include a rat, a mouse, a mouse, a pig, a pig, a chicken, a potato, a human, a dog, a rabbit, and the like.
- a rat is preferable.
- Mice which are often used as model animals, have small organs and may have limitations in analyzing the disease state.However, in the case of rats such as blood pressure measurement, this is possible, and animal experiments for disease diagnosis and gene therapy are possible. It will be very useful as a tool.
- transgenic non-human animal for example, a linear DNA sequenced in the order of cytomegalovirus IE enhancer 1, chicken j8-actin promoter, regucalcin gene, and rabbit j8-globin poly A signal is introduced.
- Transgenic non-human animals can be mentioned.
- pCXN2 an expression vector having a marker gene, a cytomegalovirus IE gene sensor, a chicken j8-actin promoter, a cDNA insertion site, and a rabbit j8-globin poly A signal, etc.
- pCXN2 expression vector having a marker gene, a cytomegalovirus IE gene sensor, a chicken j8-actin promoter, a cDNA insertion site, and a rabbit j8-globin poly A signal, etc.
- a transgenic non-human animal can be obtained efficiently.
- transgenic non-human animal a transgenic non-human animal obtained by breeding until the old age (aging), which exhibits symptoms of hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia. And female transgenic non-human animals obtained by breeding until they exhibit symptoms of hyperalbuminemia, and the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- a transgenic non-human animal that is a gene that encodes a protein, in particular, a rat that has a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, in particular, a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
- SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
- SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
- the ability to cite transgenic non-human animals that are regucalcin genes In addition to rats, mice, mice, pigs, There are no particular restrictions on birds, birds, humans, dogs, and egrets.
- a preferable embodiment of the transgenic non-human animal includes a transgenic non-human animal that is a homozygous body.
- a homozygote having a homologous mutant chromosome can be obtained by mating non-human animals such as a rat having a heterozygous chromosome, and since the expression level of regucalcin is higher than that of a heterozygous animal, an experimental model animal can be obtained. It is particularly preferable as such.
- transgenic non-human animal a non-human animal exhibiting a bone disease state in addition to the symptoms of hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia in old age (aging).
- Bone pathology here refers to bone abnormalities such as bone loss, weakening of bone fibrils, changes in bone morphology, bone growth delay, etc. due to abnormalities in calcium bone metabolism such as osteoporosis. It is a state that is not.
- Screening for a therapeutic agent for the prevention and treatment of hyperlipidemia and hyperalbuminemia in non-human model animals that exhibit bone disease in addition to the symptoms of hyperlipidemia and hyperalbuminemia during the aging (aging) period can be used for screening of preventive and therapeutic drugs for osteoporosis in old age (aging).
- the aged (aging) period includes 30 weeks or more, preferably 36 weeks to 50 weeks of age. Can be.
- albumin concentration in serum is high from 25 weeks of age.
- a test substance is added to the above hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animal of the present invention.
- the method is not particularly limited as long as it is a method for measuring and evaluating the amount of lipid and Z or albumin in the blood, and screening for a preventive drug for hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia of the present invention.
- the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animal of the present invention may be treated by the age of aging (age) when hyperlipidemia and z or hyperalbuminemia are exhibited.
- the method is not particularly limited as long as a test substance is administered and the amount of lipid and Z or albumin in blood is measured and evaluated after the aging (aging) period.
- a test compound is orally or parenterally administered to a hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animal of the present invention, and the blood lipid and Z or albumin levels in the model animal are measured.
- Liver was removed from male Wistar rats (3 weeks old), and guanidine isothiocynate solution (4 M gua-di-dithiothionate, 25 mM sodium citrate (pH 7.0), 0.5% sarcosyl) , 0.1M2-mercaptoethanol, 2M sodium acetate). This was extracted with a phenol-chloroform isoamyl alcohol mixture, and centrifuged at 10,000 ° C for 20 minutes at 4 ° C. Isopropanol was added to the aqueous layer and allowed to stand at ⁇ 20 ° C. to precipitate RNA. The recovered precipitate was dissolved in 0.5% sodium dodecyl sulfate treated with getyl pyrocarbonate. This was passed through an oligo (dT) cellulose column to purify poly (A) + RNA.
- guanidine isothiocynate solution 4 M gua-di-dithiothionate, 25 mM sodium citrate
- the phage vector ⁇ ⁇ contains the base sequence of the plasmid vector pBluescript in its sequence, and the cDNA fragment of RC cloned into ⁇ is inserted into this pBluescript.
- both ends of pBluescript have a replication start point and a termination point of helper phage.
- the phage was isolated from the identified plaque, and infected with E. coli SURE together with R408 helper phage.
- PBluescript containing the cDNA fragment of RC was synthesized in E. coli and released outside the E. coli in the form of helper phage.
- This phage solution was further infected with Escherichia coli SURE and replicated in the bacterium as a plasmid having a cDNA fragment of RC.
- This E. coli was inoculated on an LB plate containing 50 gZml ampicillin, and ampicillin-resistant colonies were selected.
- the entire nucleotide sequence of the cDNA insert was determined using the Sequenase system (US Biochemical). That is, the plasmid DNA was digested with EcoRI, and the fragment was subjected to alkali denaturation treatment, and then the primer was annealed with Kagami II. This includes 35S dCTP, 0.1M DTT,
- SEQ ID NO: 1 shows the entire nucleotide sequence of regucalcin cDNA.
- the obtained amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 2.
- the molecular weight of regucalcin from which this force was calculated was 33,388. This value is consistent with the molecular weight of purified regucalcin calculated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. did.
- a DNA fragment containing the entire ORF was excised from the resulting plasmid containing rat full-length cDNA, RC-900 (glycerol stock; RC-F), and vector pBluescript SK (-) using Pstl.
- This excised Pstl fragment was inserted into the Pstl site of pBluescript II KS (+).
- it was excised with EcoRI, and the obtained EcoRI fragment was introduced into the EcoRI site of the expression vector PCXN2 (Clontech) (Gene 108, 193-199, 1991) to prepare a rat regular cartin expression vector RCZpCXN2.
- This RCZpCXN2 was cut with Sail, SfiI and Mlul to obtain a 3.6 kbp linearized fragment.
- the 3.6 kbp DNA fragment solution (5 ng / ⁇ l concentration) was microinjected into the male pronucleus of the fertilized eggs of Wistar rats prepared in this manner.
- the eggs into which the DNA fragments had been injected were cultured in a C02 incubator for 1 mm using m-KRB (m Klepslinger buffer) medium.
- m-KRB m Klepslinger buffer
- transgenic rat (hetero body) lines obtained in Example 1 a line having the highest expression of regucalcin in the tail tissue was crossed to obtain a transgenic rat (homo body).
- a line having the highest expression of regucalcin in the tail tissue was crossed to obtain a transgenic rat (homo body).
- the incorporation of the transgene into the genomic DNA extracted from rat tail kaori is confirmed by PCR, and the amount of incorporation that is at least twice the amount of the heterologous cDNA is detected. This was confirmed by:
- These homozygous transgenic rats (6 males and 6 males) and wild type rats (6 males and 6 females of Sprague-Dawley (SD) strain) were air-conditioned at 25 ° C. They were fed solid feed (Oriental yeast, MF) freely in the breeding room and were bred from birth to 36 weeks of age.
- the rats bred up to the age of 36 weeks were dissected, blood was collected by cardiac puncture, and femoral tissue was removed. The blood was left at room temperature for 2.0 minutes, centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, and serum was collected. Serum was stored at -32 ° C until its components were measured.
- the femur tissue was separated from the muscle tissue in a cold 0.25M sucrose solution, divided into diaphyseal (cortical bone) and metaphyseal (trabecular bone) tissue, and the bone marrow was washed away to obtain bone.
- Serum components were determined using calcium (C calcium test), inorganic phosphorus (P test), zinc (zinc test), glucose (glucose test), triglyceride ( Triglyceride test, HDL cholesterol (HD L-cholesterol test) and albumin (albumin test) were quantified, respectively.
- the amount of calcium (mgZg bone dry weight) in the diaphyseal and metaphyseal tissues of the femoral tissue was measured by drying the diaphyseal (cortical bone) and metaphyseal (cancellous bone) at 100 ° C for 6 hours. Then, the weight was measured, the mixture was decomposed at 120 ° C.
- the amount of DNA in bone tissue was measured by using ice-cooled 6.5 mM parbiter for the diaphysis (cortical bone) and the metaphysis (cancellous bone). Immersion in 3 ml of water buffer (pH 7.4), cut into small pieces, ice-cooled 0.1N sodium hydroxide solution 4. After centrifugation for 5 minutes, the obtained supernatant was used for the measurement of DNA amount, and the DNA amount was measured according to the method of Ceriotti (J. Biol. Chem., 214, 39-77, 1955). Statistical processing for a significant difference test of the obtained experimental results was performed using Student's t-test.
- Figure 17 shows the results of measuring serum calcium, inorganic phosphorus, zinc, glucose, triglyceride, HDL-cholesterol, and albumin concentrations in transgenic rats (homozygotes), wild type, and gender. And Table 1. Each value in Fig. 17 and Table 1 shows the average value of six rats and their standard errors. Also, in FIG. 17 and Table 1, *: P ⁇ 0.05 (compared to the value of the control group), **: P ⁇ 0.025 (compared to the value of the control group), and # : Represents P ⁇ 0.001 (compared to the value of the control group).
- Table 1 shows that the concentrations of inorganic phosphorus (female), triglyceride (male and female), HDL cholesterol (male and female) and albumin (female) were significantly increased, but calcium, zinc and glucose did not fluctuate significantly.
- inorganic phosphorus male
- triglyceride male and female
- HDL cholesterol male and female
- albumin male
- regucalcin transgenic rats in the elderly can be treated with liver disease. It has been shown to cause hyperalbuminemia as well as hyperlipidemia associated with the condition. As shown in FIG. 8 and Table 1, the rat body weight at the age of 36 weeks was not significantly changed in the regucalcin transgenic rats as compared with the normal rats (wild type).
- FIG. 9 shows the measurement results of the calcium content (mgZg bone dry weight) in the diaphyseal and metaphyseal tissues of the femoral tissue. From Fig. 9, the calcium content of the femoral shaft and metaphysis of the 36-week-old Regucaltin transgenic rat was significantly reduced in both males and females compared to the normal rat (wild type). It was clarified that regucalcin transgenic rats exhibited bone loss S even at aging. In FIG. 9, *: represents P ⁇ 0.01 (compared to the value of the control group).
- Figure 2 shows the results of measuring the DNA content (index of cell number) in the diaphyseal and metaphyseal tissues of the femoral tissue. From Fig. 10, it was found that the amount of DNA in bone tissue was significantly reduced in male and female regucalcin transgenic rats, especially at the metaphyseal part, suggesting that bone formation was suppressed. Was done. In FIG. 10, *: represents P ⁇ 0.01 (compared to the value of the control group).
- the expression of hyperlipidemia-hyperalbuminemia was examined using regucalcin-overexpressing rats at 14, 25, 36 and 50 weeks of age.
- Regucalcin transgenic rats female male and female
- normal rats male and female
- serum lipids free fatty acids, tridaliceride, HDL cholesterol, free cholesterol
- serum calcium, inorganic phosphorus, zinc, glucose and urea nitrogen concentrations were measured in the same manner as in Example 2, and the aging of each of these components was examined.
- the free fatty acids and urea nitrogen were measured using a measurement kit “NEFA C Test Co.” and “Urea Nitrogen B Test Co.” manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
- FIGS. Each value in Fig. 11-15 and Table 2 shows the average value of 6 rats and its standard error. Further, in FIG. 11 one 15, *: represents the P rather 0 ⁇ 01 (compared with the value of the normal rats for each week of age a control group) In Table 2, a p ⁇ 0. 05, b p ⁇ 0 .01 (compared to the control group of normal rats of each age).
- HDL-cholesterol, free cholesterol concentration power It was found that female rats showed a high level from the age of 14 weeks, and it was found to be remarkable at 50 weeks of age (1 age).
- hyperlipidemia was extremely characteristic in regucalcin transgenic rats, and hyperalbuminemia in female rats was also a unique phenomenon.
- hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animals of the present invention When the hyperlipidemia and Z or hyperalbuminemia model animals of the present invention are used, basic knowledge of the liver pathology and the mechanism of hyperlipidemia during aging can be obtained. It can be advantageously used for the development of a therapeutic agent for preventing or treating diseases showing clinical examples of hyperlipidemia and hyperalbuminemia.
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Abstract
高脂血症や高アルブミン血症の予防・治療薬の開発に有用な、特に老齢（加齢）期（ヒトにおいては中高年）に高脂血症や高アルブミン血症を発症する、高脂血症及び／又は高アルブミン血症モデル動物を提供するものである。レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェニックラット（ホモ体）を、高脂血症及び／又は高アルブミン血症の症状を呈する老齢（加齢）期、例えば３６週齢まで飼育することにより、高脂血症及び／又は高アルブミン血症モデル動物を得る。このモデル動物は、血清アルブミン、ＨＤＬ−コレステロール及びトリグリセリド濃度が有意にかつ著しく上昇する上に、骨病態をも呈する。
Description
明 細 書
高脂血症 ·高アルブミン血症モデル動物
技術分野
[0001] 本発明は、高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物、好ましくは老齢 (加 齢)期まで飼育したレギュカルチン過剰発現トランスジエニック非ヒト動物である高脂 血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物、力かる高脂血症及び Z又は高アル ブミン血症モデル動物を用いる高脂血症及び z又は高アルブミン血症の予防 '治療 薬のスクリ一-ング方法等に関する。 背景技術
[0002] ペプチドホルモンが細胞膜の受容体に結合し、細胞内にその情報を伝達する仕組 みの中で、 Ca2+は主役を演じている。細胞内には Ca2+を結合する多くのタンパク質 が存在する力 その作用を増幅するタンパク質として、カルモジュリンは重要な役割 を果たしており、 Ca2+はこのカルモジュリンに結合し、細胞機能の調節に関与する各 種の酵素を活性化することが解明されている（Science, 202, 19-27, 1984)。また、 Ca 2+がプロテインキナーゼ Cやその他の Ca2+結合タンパク質 (酵素も含む）に作用する ことも知られている（Science, 233, 305-312, 1986)。レギュカルチンも、本発明者らに よりラット肝細胞質力も単離された Ca2+結合蛋白質である。
[0003] レギュカルチンは、分子量が 33388の Ca2+結合タンパク質で、その Ca2+結合定数 が 4. 19 X 105M— 1を示し、 6— 7個の高親和性 Ca2+結合部位を持ち、 α—ヘリックス 構造を 34%含む、肝臓に顕著に存在する等電点 ρΙ5. 20の酸性蛋白質である。レギ ュカルチンは、カルモジュリンや他の多くの Ca2+結合タンパク質にみられる部位 EF ハンド構造 (領域)を含まない特異なタンパク質で、例えば、 Ca2+を結合することによ り、カルモジュリンは α—へリックス含量が増加し、その構造が堅固になるが、レギユカ ルチンは α—へリックス含量が減少する。また一方、細胞機能調節において、レギュ カルチンは、カルモジュリンによる酵素活性ィ匕を阻害し、プロテインキナーゼ Cの活性 化をも阻害することが明らかになつている。このように、レギュカルチンは、シグナリン グの制御タンパク質として機能するなど多くの知見が蓄積されている（FEBS Lett,
327, 251-255, 1993)。
[0004] レギュカルチン遺伝子は、ラットにおいて X染色体（Xq 11.1-12)に存在し、ヒトにお いても X染色体に位置する。レギュカルチン遺伝子は、ラットやヒトの他、サル，マウス ,ィヌ，ゥシ，ゥサギ，ニヮトリ等の高等動物に見い出されているが酵母にはなぐ高度 に分化されたタンパク質をコードするものと考えられて 、る。レギュカルチン cDNAは クロー-ングされており、その全構造も決定されている（特開平 7— 123985号公報)。 ラット肝のレギュカルチン cDNAは、全アミノ酸をコードする塩基対が 0. 897kbであり 、 299のアミノ酸を翻訳する。また、マウス肝ゃヒト肝のレギュカルチン cDNAの塩基 配列も決定されており、ラット肝のレギュカルチン cDNAと比較して、それぞれ 94%と 約 89%のホモロジ一を有している。レギュカルチン mRNAの発現は、ヒト，ラット，マ ウス，ゥシ， -ヮトリ等の肝臓においてみられ、これらの肝臓にはレギュカルチンタンパ ク質の存在も確認されて 、る。
[0005] レギュカルチンは、多機能性を有する細胞内 Ca2+シグナリングの制御蛋白質として 特徴を有する蛋白質であり、細胞機能調節に関与する重要な蛋白質であることが知 られている（Life Sciences 66, 1769-1780, 2000、 Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 1-6, 2000)。また、生体内における肝臓や腎臓にお けるレギュカルチンの発現が肝障害（Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994)ゃ腎障害（Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995)時 に低下することが動物実験的に明らかにされており、レギュカルチンと病態成因との 関連が示唆されている。そして、 GOT, GPT等の既存の肝機能マーカーと異なって 肝臓に特異的に存在するレギュカルチンの血清中の濃度を測定することにより、肝疾 患患者血清を鑑別する方法、すなわち、肝疾患患者の血清ではレギュカルチンが有 意に上昇している一方、健常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、そ の測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用であることも知られている (特開平 1 0—26623号公報）。
[0006] 上記のように、レギュカルチンタンパク質は、肝臓に特異発現される他、腎臓，心臓 ,大脳 (神経細胞）にも低レベルで発現し、細胞内の Ca2+シグナリング関連細胞機能 の調節に関与し、その発現が低下すると生理的異常を来たす特異な多機能性蛋白
質であり、これまでラットの肝臓から単離した蛋白質ゃ抗レギュカルチンモノクローナ ル抗体を用いて、その機能解析が行われ、上記のカルシウムシグナルの制御因子と しての役割の他、細胞内カルシウム輸送酵素の調節や、プロテアーゼの活性化因子 としての役割や、細胞核のカルシウム輸送の調節、細胞核 DNA分解における役割、 肝再生時の細胞核機能における役割等の細胞核機能の調節や、腎尿細管カルシゥ ム再吸収における役割など、多くの生体調節におけるレギュカルチンの機能的役割 が本発明者により明らかにされている。
本発明者は、レギュカルチンの種々の機能的役割の解明につ 、ての研究過程で、 レギュカルチンが他の数多くの Ca2+結合タンパク質とは異なる特異的作用を有する 点に着目し、カルシウムが関与する各種細胞の機能調節は、生体内におけるレギュ カルチンの発現量とカルモジュリンをはじめとする他の数多くの Ca2+結合タンパク質 の発現量とのバランスの上に成立して 、ると考え、レギュカルチンの発現量と他の数 多くの Ca2+結合タンパク質の発現量とのバランスが崩れた場合に、生体に生じる変 ィ匕 '影響を、トランスジエニックラットを作製して調べた。ラット肝臓 cDNAライブラリー からレギュカルチン cDNAをクローユングし、レギュカルチン蛋白質の全長をコードす る cDNAを単離し、このラットレギュカルチン全長 cDNAより ORFを切り出し、発現べ クタ一 (PCXN2)に導入し、この遺伝子発現ベクターをラット受精卵雄性前核にマイク 口インジェクションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを発生させ、そ の産仔の組織から DNAを抽出し、 PCR法によってレギュカルチン cDNAが組み込 まれて!/、るラットを確認したところ、 29匹の産仔からレギュカルチン cDNAを発現する ホモ体のラット 5匹 (雄 4匹、雌 1匹）が作出され、力かるトランスジヱ-ックラットの体重 の増加が有意に抑制されることや、外見上何ら骨病態を呈していない上記レギユカ ルチン遺伝子導入によりレギュカルチン過剰発現能を獲得した形質転換ラットについ て、偶々、動物研究用 pQTC (peripheral Quantitative Computed Tomography)骨密 度測定装置による骨の形態学的 (骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲 長さ）測定評価、及び骨成分の生化学的 (カルシウム量、骨芽細胞'造骨細胞のマー カー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標である DNA量 )測定評価を実施したところ、特に大腿骨において形態学的にも生化学的にも、骨量
、骨密度の減少による骨吸収 (骨塩溶解）による骨組織の脆弱化、骨形態変化、およ び尾骨成長遅延などの顕著な骨病態を呈することや、このレギュカルチン過剰発現 病態モデルラットの形質が継代的に安定しており、商業的生産に耐えるものであるこ とを報告して ヽる（特開 2003— 164238号公報)。
[0008] 他方、高脂血症は、血清中のコレステロールゃトリグリセライド等の脂質濃度が高く なった病態をいい、動脈硬化、高血圧、脳卒中など循環器系の疾患の発症と密接な 関係がある。また、高アルブミン血症は、肝臓で合成される血清中のアルブミン濃度 が高くなつた病態をいい、種々の肝臓の疾患に関係する。上記高脂血症のモデル動 物に関する技術として、ヒト巣状糸球体硬化症の動物モデルとして有用である高脂血 症フット (K. Yamasaki and Y. Yoshikawa奢 Laooratory Animal Science A4 (2)、 1994, 125-130)や、外来性 25—水酸化ビタミン D 24—水酸化酵素遺伝子を組み込んだ D
3
NAを有する、腎疾患、骨疾患、関節疾患、肺疾患、高脂血症、動脈硬化症、心疾患 、糖尿病、肥満症、消化器疾患、感染症、アレルギー疾患、内分泌疾患、痴呆症、癌 等のビタミン D代謝異常に起因する疾患を呈する非ヒト哺乳動物 (特開平 11 9140
3
号公報）や、 LDL Oow density lipoproteins)レセプター遺伝子が不活性化された非ヒ ト哺乳動物胚幹細胞を用いて得られる高脂血症治療モデルに有用な病体モデル動 物（特開平 10— 56915号公報）や、糖尿病（NIDDM)ラット（ZDFZGmi - f aZf a； 日本チヤ—ルス ·リバ一）、 SDF (Spontaneously Diabetic Torii)ラット（鳥居薬品）、 W HHLゥサギ（北山ラベス Zオリエンタル酵母）が知られている。
[0009] 本発明の課題は、最近の生活様式の変化に伴い急増しつつある高脂血症ゃ高ァ ルブミン血症の予防 ·治療薬の開発に有用な高脂血症及び Z又は高アルブミン血症 モデル動物、特に老齢 (加齢)期（ヒトにおいては中高年）に高脂血症や高アルブミン 血症を発症する高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物や、かかる高脂 血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物を用いる高脂血症及び Z又は高アル ブミン血症の予防'治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
[0010] 本発明者が既に開発したレギュカルチンを過剰発現したトランスジヱ-ックラットは 5 週齢の成長期において骨粗鬆症を引き起こし、そのモデル動物としての有用性が評 価され、すでに上巿されている。力かるレギュカルチントランスジヱ-ックラットを老齢（
加齢)期（ヒトにおいては中高年)まで飼育し、生体機能の変容について調べてみた。 加齢 (36週齢）（9か月齢）においてラットを解剖したところ、成長期ラットにおいてこれ までに知られて!/ヽた骨量減少と血清無機リン濃度上昇に加えて、新たに血清アルブ ミン、 HDL—コレステロール及びトリグリセリド濃度が有意にかつ著しく上昇しているこ とを見い出し、レギュカルチントランスジェ-ックラットは加齢期において高アルブミン 血症及び高脂血症をもたらすことが明らかとなった。血清アルブミン、 HDL—コレステ ロール並びにトリグリセリドは肝臓力 産生放出されることから、加齢期レギュカルチン トランスジェ-ックラットにおいては、肝臓の病態をもたらしていることが考えられた。実 際に、ラットの解剖時には、正常のラットの肝臓と比較して、レギュカルチントランスジ ヱ-ックラットの肝臓にぉ ヽては、脂肪肝様状態を示すことが観察された。
[0011] その後、週齢 14、 25、 36、 50のトランスジエニックラットを用いて、高脂血症'高ァ ルブミン血症の発現における加齢による変動について調べた。その結果、血清中脂 質 (遊離脂肪酸、トリダリセライド、 HDL—コレステロール、遊離コレステロール)濃度が 、雌ラットの 14週齢力も高値を示すことが見出され、 50週齢（1年齢)では顕著である ことが明らかになった。また一方、血清中アルブミン濃度は雌ラットにおいて 25週齢 のものから高値を示すことが明らかとなつた。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
発明の開示
[0012] すなわち本発明は、（1)レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰 発現するトランスジエニック非ヒト動物力 なる高脂血症及び Z又は高アルブミン血症 モデル動物や、 (2)トランスジエニック非ヒト動物を、高脂血症及び Z又は高アルブミ ン血症の症状を呈する老齢 (加齢)期まで飼育することにより得られることを特徴とす る上記（1)記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物や、 (3)トランス ジヱニック非ヒト動物 (雌)を、高アルブミン血症の症状を呈するまで飼育することによ り得られることを特徴とする上記（1)記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モ デル動物や、（4)非ヒト動物が、老齢 (加齢)期において骨病態を呈することを特徴と する上記（1)一（3)のいずれか記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデ ル動物や、 (5)ホモ体であることを特徴とする上記（1)一（4)の 、ずれか記載の高脂
血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物や、 (6)非ヒト動物がラットであることを 特徴とする上記（1)一（5)のいずれか記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症 モデル動物に関する。
[0013] また、本発明は、（7)老齢 (加齢)期力 36週齢一 50週齢であることを特徴とする上 記（6)記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物や、 (8)レギュカル チン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジエニック非ヒト動物 を、高脂血症及び Z又は高アルブミン血症のモデル動物として使用する方法や、 (9 )トランスジ ニック非ヒト動物を、老齢 (加齢)期まで飼育して、高脂血症及び Z又は 高アルブミン血症のモデル動物として使用する上記（8)記載の方法や、 (10)トランス ジェニック非ヒト動物 (雌)を、高アルブミン血症の症状を呈するまで飼育して、高脂血 症及び Z又は高アルブミン血症のモデル動物として使用する上記（8)記載の方法や 、（11)非ヒト動物が、老齢 (加齢)期において骨病態を呈することを特徴とする上記（ 8)—（10)の 、ずれか記載の方法や、（12)ホモ体であることを特徴とする上記（8)— (11)の 、ずれか記載の方法に関する。
[0014] さらに本発明は、（13)非ヒト動物がラットであることを特徴とする上記 (8)—（12)の いずれか記載の方法や、（14)老齢 (加齢)期力 36週齢一 50週齢であることを特徴 とする上記（13)記載の方法や、（15)上記（1)一（7)の 、ずれか記載の高脂血症及 び Z又は高アルブミン血症モデル動物に、被検物質を投与し、血中の脂質及び Z 又はアルブミン量を測定'評価することを特徴とする高脂血症及び Z又は高アルブミ ン血症の治療薬のスクリーニング方法や、（16)上記（1)一 (7)のいずれか記載の高 脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物が、高脂血症及び Z又は高アルブ ミン血症の症状を呈する老齢 (加齢)期までに、被検物質を投与し、老齢 (加齢)期以 後に、血中の脂質及び Z又はアルブミン量を測定'評価することを特徴とする高脂血 症及び Z又は高アルブミン血症の予防薬のスクリーニング方法に関する。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]第 1図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清カル シゥムの測定結果を示す図である。
[図 2]第 2図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清無機
リンの測定結果を示す図である。
[図 3]第 3図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清亜鉛 の測定結果を示す図である。
[図 4]第 4図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清グル コースの測定結果を示す図である。
[図 5]第 5図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清トリ グリセリドの測定結果を示す図である。
[図 6]第 6図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清 HD L コレステロールの測定結果を示す図である。
[図 7]第 7図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの血清アル ブミンの測定結果を示す図である。
[図 8]第 8図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの体重の測 定結果を示す図である。
[図 9]第 9図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの大腿骨の 骨幹部と骨幹端部のカルシウム量の測定結果を示す図である。
[図 10]第 10図は、本発明の 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの大腿 骨の骨幹部と骨幹端部の DNA量 (細胞数の指標）の測定結果を示す図である。
[図 11]第 11図は、本発明の 14、 25、 36及び 50週齢のレギュカルチントランスジェ- ックラットの血清遊離脂肪酸の測定結果を示す図である。
[図 12]第 12図は、本発明の 14、 25、 36及び 50週齢のレギュカルチントランスジェ- ックラットの血清トリグリセリドの測定結果を示す図である。
[図 13]第 13図は、本発明の 14、 25、 36及び 50週齢のレギュカルチントランスジェ- ックラットの血清 HDL コレステロールの測定結果を示す図である。
[図 14]第 14図は、本発明の 14、 25、 36及び 50週齢のレギュカルチントランスジェ- ックラットの血清遊離コレステロールの測定結果を示す図である。
[図 15]第 15図は、本発明の 14、 25、 36及び 50週齢のレギュカルチントランスジェ- ックラットの血清アルブミンの測定結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明のモデル動物としては、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチン を過剰発現するトランスジエニック非ヒト動物力 なる高脂血症及び Z又は高アルブミ ン血症モデル動物であれば特に制限されるものではなぐまた、本発明の方法として は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェ- ック非ヒト動物を、高脂血症及び z又は高アルブミン血症のモデル動物として使用す る方法であれば特に制限されるものではなぐここで、レギュカルチンを過剰発現する とは、野生型の非ヒト動物のレギュカルチン発現量に比べて有意に多量のレギュカル チンを発現することをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マウス，ゥシ，ブタ， -ヮトリ，力エル，ヒト，ィヌ，ゥサギ等を挙げることができるが、中でもラットが好ましい 。モデル動物としてよく用いられているマウスでは臓器が小さく病態の解析には限界 があることもあるが、例えば血圧測定などラットにおいてはこれが可能になり、病態解 明や遺伝子治療のための動物実験的手段としてきわめて有用となる。
[0017] 上記トランスジエニック非ヒト動物としては、例えば、サイトメガロウィルス IEェンハ ンサ一，チキン j8—ァクチンプロモーター，レギュカルチン遺伝子，ラビット j8—グロビ ンポリ Aシグナルの順に配列された直鎖 DNAが導入されたトランスジエニック非ヒト動 物を挙げることができる。例えば、マーカー遺伝子，サイトメガロウィルス IEェンノヽン サー，チキン j8—ァクチンプロモーター， cDNA挿入サイト，ラビット j8—グロビンポリ A シグナル等を有する発現ベクター (pCXN2)にレギュカルチン全長 cDNAを導入した ものを用いると、効率よくトランスジエニック非ヒト動物を得ることができる。
[0018] また、上記トランスジエニック非ヒト動物の好ましい態様として、高脂血症及び Z又は 高アルブミン血症の症状を呈する老齢 (加齢)期まで飼育することにより得られるトラ ンスジエニック非ヒト動物や、高アルブミン血症の症状を呈するまで飼育することにより 得られる雌のトランスジエニック非ヒト動物を挙げることができ、また、レギュカルチン遺 伝子力 配列表の配列番号 2記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする遺 伝子であるトランスジエニック非ヒト動物、特に、配列表の配列番号 2記載のアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードする遺伝子力 配列表の配列番号 1記載の DNA配 列からなるラットレギュカルチン遺伝子であるトランスジエニック非ヒト動物を挙げること ができる力 レギュカルチン遺伝子の由来としては、ラットの他、マウス，ゥシ，ブタ，二
ヮトリ，力エル，ヒト，ィヌ，ゥサギ等特に制限されるものではない。
[0019] また、上記トランスジエニック非ヒト動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランス ジェニック非ヒト動物を挙げることができる。力かる変異染色体をホモに有するホモ体 は、染色体をへテロに有するラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることが でき、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことから、実験モデル動物として特 に好ましい。
[0020] また、上記トランスジエニック非ヒト動物として、老齢 (加齢)期にお 、て、高脂血症及 び Z又は高アルブミン血症の症状に加え、骨病態を呈する非ヒト動物が好ましぐこ こで骨病態とは、骨粗鬆症に代表されるカルシウム骨代謝異常等により、骨量の減少 、骨糸且織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨やその成長が正常でない状態 をいう。老齢 (加齢)期において、高脂血症や高アルブミン血症の症状に加え、骨病 態を呈する非ヒトモデル動物の場合、高脂血症や高アルブミン血症の予防'治療薬 のスクリーニングに用いることができるほか、老齢 (加齢)期における骨粗鬆症の予防 •治療薬のスクリーニングにも用いることができる。
[0021] 非ヒト動物がラットである場合、すなわちレギュカルチンを過剰発現するトランスジェ -ックラットの場合、老齢 (加齢)期として、 30週齢以上、好ましくは 36週齢一 50週齢 を挙げることができる。また、雌のトランスジェ-ックラットの場合、 25週齢のものから 血清中のアルブミン濃度が高値を示す。
[0022] 本発明の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症の治療薬のスクリーニング方法と しては、上記本発明の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物に、被検 物質を投与し、血中の脂質及び Z又はアルブミン量を測定'評価する方法であれば 特に制限されるものではなぐまた、本発明の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症 の予防薬のスクリーニング方法としては、上記本発明の高脂血症及び Z又は高アル ブミン血症モデル動物が、高脂血症及び z又は高アルブミン血症の症状を呈する老 齢 (加齢)期までに、被検物質を投与し、老齢 (加齢)期以後に、血中の脂質及び Z 又はアルブミン量を測定 ·評価する方法であれば特に制限されるものではなく、被検 物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質などの他に、例えば哺乳動物 の組織抽出物、細胞培養上清などや、各種植物の抽出成分等が用いられる。例え
ば、被検化合物を本発明の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物に経 口的又は非経口的に投与し、該モデル動物における、血中の脂質及び Z又はアル ブミン量を測定'評価や、肝臓の病態の観察'評価を実施することにより、高脂血症 及び Z又は高アルブミン血症の予防'治療薬をスクリーニングすることができる。また
、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物 における場合と比較'評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることがで きることから好ましい。
[0023] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0024] [トランスジエニックラットの作製]
(RNAの調製）
ウィスター系雄性ラット（3週齢)から肝臓を摘出し、グァ-ジン イソチオシァネート 液（4Mグァ -ジ-ゥムチオシァネート， 25mMクェン酸ナトリウム（pH7. 0) , 0. 5% サルコシル， 0. 1M2—メルカプトエタノール， 2M酢酸ナトリウム）でホモジナイズした 。これをフエノールークロロホルム イソアミルアルコール混液で抽出し、 4°C、 10, 00 O X gで 20分遠心した。水層にイソプロパノールをカ卩え、— 20°Cで放置し、 RNAを沈 澱させた。回収した沈澱はジェチルピロカーボネート処理した 0. 5%ドデシル硫酸ナ トリウムに溶解した。これをオリゴ (dT)セルロースカラムに通し、ポリ（A) +RNAを精 製した。
[0025] (cDNAライブラリーの作製）
精製したポリ（A) +RNA(5 μ g)に 50unitの Moloney- Murine Leukemiaウィルス逆 転写酵素とオリゴ (dT) 18プライマーリンカーを添加し、 1本鎖 cDNAを合成した。さ らに合成した 1本鎖 cDNAに大腸菌リボヌクレアーゼ Hと DNAポリメラーゼ Iを添加し 、 2本鎖 cDNAを合成した。これに EcoRIアダプターを付カ卩し、 Xhol, EcoRIで消化 したファージ発現ベクター（え ΖΑΡΠ)と連結した。さらにパッケージングエキストラタト を用いてファージにパッケージングし cDNAライブラリーのファージを作製した。
[0026] (RCcDNAクローンの選抜）
ラット肝の cDNAライブラリーのファージ約 1 X 106個を大腸菌と混合し 20個の寒天 プレートに植菌した。 42°Cで 3時間半インキュベートした後、プレートに 10mMイソプ ロピルチオ 13 D ガラクトシドで処理した-トロセルロース膜をのせ、 37°Cで 3時間 半インキュベートした。ニトロセルロース膜はブロッキングした後、抗 RCゥサギ血清（ X 200)と室温で 2時間インキュベートした。膜は洗浄した後、アルカリホスファターゼ 結合抗ゥサギ IgG抗体をカ卩ぇインキュベートした。これを発色液（0. 35mM-トロブ ルーテトラゾリゥム， 0. 4mM5—ブロモー 4 クロ口— 3 インドリルホスフェート）に浸し 発色させ、 RCcDNA陽性プラークを同定した。
[0027] (プラスミドベクターへのサブクローニング）
ファージベクターえ ΖΑΡΠは、その配列中にプラスミドベクターである pBluescriptの 塩基配列を含み、 λ ΖΑΡΠにクロー-ングされた RCの cDNA断片はこの pBluescript に挿入されている。また、 pBluescriptの両端にはヘルパーファージの複製開始点と 終結点が存在している。そこで同定したプラークよりファージを単離し、 R408ヘルパ 一ファージとともに大腸菌 SUREに感染させ、 RCの cDNA断片を含む pBluescriptを 大腸菌内で合成させ、ヘルパーファージの形で大腸菌体外に放出させた。このファ 一ジ液をさらに大腸菌 SUREに感染させ、 RCの cDNA断片を有するプラスミドとして 菌内で複製させた。この大腸菌を 50 gZmlアンピシリン含有の LBプレートに植菌 し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
[0028] (cDNAインサートの塩基配列の決定）
Sequenaseシステム（US Biochemical社製）を用いて cDNAインサートの全塩基配列 を決定した。すなわちプラスミド DNAを EcoRIで切断し、断片はアルカリ変性処理し た後、プライマーをカ卩ぇアニーリングした。これに 35S dCTP、 0. 1M DTT、
Sequenase用酵素液を添加した後 4等分し、各々〖こ ddATP、 ddGTP、 ddTTP、 ddC TPをカ卩え、 37°C5分間インキュベートした。これらはアクリルアミドゲル電気泳動で分 離し、オートラジオグラフィーを行ない、塩基配列を読み取った。配列番号 1にレギュ カルチン cDNAの全塩基配列を示す。また、得られたアミノ酸配列も配列番号 2に示 す。これ力も計算されるレギュカルチンの分子量は 33, 388であった。この値は精製 したレギュカルチンを SDSポリアクリルアミド電気泳動法により算出した分子量と一致
した。
[0029] (導入遺伝子の構築）
得られたラットレギュカルチン全長 cDNAを含むプラスミド、 RC-900 (glycerol stock ;RC— F)、ベクター pBluescript SK (—）より、 ORF全てを含む DNA断片を Pstl を用いて切り出した。この切り出した Pstlフラグメントを pBluescript II KS (+)の Pstlサイ トに組み込んだ。次に EcoRIで切り出し、得られた EcoRIフラグメントを、発現ベクター PCXN2 (クロンテック社）（Gene 108, 193-199, 1991)の EcoRIサイトに導入し、ラットレ ギュカルチン発現ベクター RCZpCXN2を調製した。この RCZpCXN2を Sailと Sfi Iと Mlulで切断し、リニアライズされた 3. 6kbpのフラグメントを得た。
[0030] (トランスジエニックラットの作製）
ラットの前核期受精卵への上記リニアライズされた 3. 6kbpの DNAフラグメント溶液 のマイクロインジェクションは下記の要領で実施した。 4週齢のスプラーグ ドーリー (
SD； Sprague-Dawley)系雌ラットを明喑サイクル 12時間（明時間 4： 00— 16 : 00)、 温度約 23°C、湿度約 55%で飼育し、膣スメァ法により雌の性周期を観察してホルモ ン処理日を選択した。雌ラットに 150IUZkgの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（日本 全薬社製「PMSゼンャク」 )を腹腔内投与して過剰排卵処理を行!ヽ、その 48時間後 に 150IUZkgのヒト胎盤性性腺刺激ホルモン (三共エール薬品 (株)社製「プベロー ゲン」）を腹腔内投与した後、雄との同居により交配を行わせ、ヒト胎盤性性腺刺激ホ ルモン投与 32時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
[0031] この様にして調製したウィスターラットの受精卵の雄性前核に、前記 3. 6kbpの DN Aフラグメント溶液 (5ng/ μ 1濃度）を顕微注入した。 DNAフラグメントが注入された 卵を、 C02インキュベーター内で m— KRB (m クレプスリンガー緩衝液）培地を用い て 1晚培養した。翌日 2細胞へと発生が進み、異常の認められない 2細胞期胚を 9匹 の仮親 (精管結紮雄と交配させた偽妊娠雌ラット）の卵管内に 1匹あたり 20— 30個程 度を移植し、 29匹の産仔を得た。 4週齢まで生存した 27匹の産仔の尾より DNAを採 取し、採取した DNAをプライマー huRC— 1 ;GGAGGCTATGTTGCCACCATTGGA (配列番号 3)、プライマー huRC—2； CCCTCCAAAGCAGCATGAAGTTG (配列番 号 4)を用いて PCR法により検定した（図 4)。その結果、合計 5匹 (雄 4匹、雌 1匹)の
ラットに導入遺伝子の存在を確認した。そのうち 5匹が次世代に導入遺伝子を伝えた 実施例 2
[0032] [加齢飼育と成分の測定]
(加齢飼育）
実施例 1で得られたトランスジエニックラット（ヘテロ体)の系統の内、尾組織におけ るレギュカルチン発現量が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジェニック ラット（ホモ体)を得た。また、ホモ体であることは、ラット尾糸且織より抽出したゲノム DN Aへの導入遺伝子の組み込みを PCR法にて確認し、ヘテロ体の cDNA量の 2倍以 上の組み込み量を検出することにより確認した。かかるホモ体の雌雄 6匹ずつのトラ ンスジエニックラットと、スプラーグ ドーリー（SD;Sprague- Dawley)系の雌雄 6匹ずつ の野生型ラット（6匹）を、 25°Cの空調設備の整った飼育室で、固形飼料 (オリエンタ ル酵母、 MF)を自由に摂取させ、出産から 36週齢まで飼育した。
[0033] (解剖と測定項目）
エーテル麻酔下で、上記 36週齢まで飼育したラットを解剖し、心臓せん刺により採 血するとともに、大腿骨組織を摘出した。血液は室温で 2. 0分間放置し、 3000回転 で 5分間遠心分離して、血清を採取した。血清は、その成分を測定するまで - 32°Cで 保存した。大腿骨組織は、冷 0. 25Mショ糖溶液中で筋肉組織をはがし、骨幹部 (皮 質骨)と骨幹端部 (海綿骨)組織に分け、骨髄を洗浄除去して骨質を得た。血清成分 は、和光純薬工業社製の測定用キットを用いて、カルシウム (カルシウム C テストヮ コー）、無機リン（P テストヮコ一）、亜鉛（亜鉛テストヮコ一）、グルコース（グルコース テストヮコ一）、トリグリセリド（トリグリセリドテストヮコ一）、 HDL コレステロール (HD L—コレステロールテストヮコ一）及びアルブミン（アルブミンテストヮコ一）をそれぞれ 定量した。大腿骨組織の骨幹部と骨幹端部組織中のカルシウム量 (mgZg骨乾燥重 量)の測定は、骨幹部 (皮質骨）と骨幹端部 (海綿骨)を、 100°Cで 6時間乾燥し、重 量を測り、 120°Cで 24時間分解し、液量を測定後、その後 6N塩酸に溶解して骨力 ルシゥム量を原子吸光度にて測定した。骨組織中の DNA量 (細胞数の指標）の測定 は、骨幹部 (皮質骨）と骨幹端部 (海綿骨）を、それぞれ氷冷した 6. 5mMパルビター
ル緩衝液 (pH7. 4) 3mlに浸し、小片にカットした後、氷冷した 0. 1N水酸ィ匕ナトリウ ム溶液 4. Omlにて 24時間振り混ぜてアルカリ抽出した後、 10, OOOrpmで 5分間遠 心分離し、得られた上清を DNA量の測定に使用し、 DNA量は Ceriottiの方法 (J. Biol. Chem., 214, 39-77,1955)に準じて測定した。得られた実験結果の有意差検定 のための統計的処理は Student's t-検定を用いて行った。
[0034] (血清成分の測定結果）
トランスジェ-ックラット（ホモ体）と野生型の別、かつ雌雄別で、血清中のカルシウム 、無機リン、亜鉛、グルコース、トリグリセリド、 HDL—コレステロール、アルブミンの各 濃度を測定した結果を図 1一 7及び表 1に示す。図 1一 7及び表 1の各値は 6匹のラッ トの平均値とその標準誤差を示す。また、図 1一 7及び表 1中、 * : P< 0. 05 (対照群 の値と比較して）、 * * : P< 0. 025 (対照群の値と比較して）、及び # : P< 0. 001 ( 対照群の値と比較して)を表す。表 1から、無機リン (雌)、トリグリセリド (雌雄)、 HDL コレステロール (雌雄)及びアルブミン (雌)濃度が有意に上昇するが、カルシウム、 亜鉛及びグルコースは有意に変動しな ヽことがわかる。レギュカルチントランスジェ- ックラットにおいて、血清無機リンの上昇は 5週齢ラットにおいても見い出された力 血 清トリグリセリド、 HDL コレステロール及びアルブミンの増加については知られてい なかった。
[0035] [表 1]
： P< 0. 0 5 , 対照群の値と比較して
P<0. 0 2 5 , 対照群の値と比較して
P< 0. 0 0 1， 対照群の値と比較して
[0036] 以上の知見から、高齢期におけるレギュカルチントランスジエニックラットは、肝臓病
態に関係した高アルブミン血症並びに高脂血症をもたらすことが明らかになった。な お、図 8及び表 1に示すように、 36週齢におけるラット体重は、レギュカルチントランス ジェ-ックラットにおいて、正常ラット（野生型）と比較して有意に変動していな力つた
[0037] (骨組織中のカルシウム量の測定結果）
大腿骨組織の骨幹部と骨幹端部組織中のカルシウム量 (mgZg骨乾燥重量)の測 定結果を図 9に示す。図 9から、 36週齢のレギュカルチントランスジエニックラットの大 腿骨の骨幹部と骨幹端部のカルシウム量は、雄及び雌いずれにおいても、正常ラット (野生型）と比べて有意に減少していることを認め、レギュカルチントランスジエニック ラットにおいては加齢時においても骨量減少力 Sもたらされていることが明らかになった 。図 9中、 * : P< 0. 01 (対照群の値と比較して）を表す。
[0038] (骨組織中の DNA量の測定結果）
大腿骨組織の骨幹部と骨幹端部組織中の DNA量 (細胞数の指標）の測定結果を 図 2に示す。図 10から、骨組織中の DNA量は、特に、骨幹端部において雄及び雌 のレギュカルチントランスジェ-ックラットにおいて有意に減少していることが見い出さ れ、骨形成が抑制されるものと考えられた。図 10中、 * : P< 0. 01 (対照群の値と比 較して)を表す。
実施例 3
[0039] [週齢 14、 25、 36、 50のトランスジエニックラットにおける成分の測定]
週齢 14、 25、 36、 50におけるレギュカルチン過剰発現ラットを用いて、高脂血症- 高アルブミン血症の発現にっ 、て調べた。レギュカルチントランスジエニックラット（ホ モ体の雌雄）と正常ラット (雌雄）は、各週齢 14、 25、 36及び 50週齢において解剖し て採血し、血清中の脂質 (遊離脂肪酸、トリダリセライド、 HDL コレステロール、遊離 コレステロール）、並びに血清中のカルシウム、無機リン、亜鉛、グルコース及び尿素 窒素濃度を実施例 2と同様にして測定し、これら各成分の加齢による変動を調べた。 なお、遊離脂肪酸と尿素窒素の測定には、和光純薬工業製の測定用キット「NEFA C テストヮコ一」及び「尿素窒素 B テストヮコ一」を用いた。結果を図 11一 15及び表 2に示す。図 11一 15及び表 2の各値は 6匹のラットの平均値とその標準誤差を示す。
また、図 11一 15中、 *: Pく 0· 01 (対照群である各週齢の正常ラットの値と比較して） を表し、表 2中、 a p< 0. 05， b p< 0. 01 (対照群である各週齢の正常ラットの場合 と比較して）を表す。
[0040] その結果、図 11一 14に示すように、血清中脂質 (遊離脂肪酸、トリダリセライド、
HDL—コレステロール、遊離コレステロール)濃度力 雌ラットの 14週齢から高値を示 すことが見出され、 50週齢（1年齢)では顕著であることが明らかになった。
[0041] また一方、図 15に示すように、血清中アルブミン濃度は雌ラットにおいて 25週齢の もの力 高値を示すことが明ら力となった。
このような、雌ラットにおいて高脂血症及び高アルブミン血症が著しいことは、レギュ カルチン遺伝子が X染色体に位置していることと関連しているものと推察される。
[0042] [表 2] レギュカルチントランスジ ニックラットにおける血清成分の加齡による変動 週齢 血清 S度 (ms dl)
カルシウム _ 無機リン― 亜鉛 グルコース 尿素窒素
1 4週
Male Normal 9.38±0·17 5.72±0.19 0.154±0.009 120.1 ±4.8 23.8±0.25
TG 8.66±0.14 5.28 ±0.21 0.162±0.011 124.9 + 5.3 23.7±0.19
Female Normal 8.19±0.04 4.86±0.19 0.147±0.004 125.0±5.4 23.5±0.96
TG 8.80±0.09 5.60±0.18B 0.145±0.009 129.1 ± 1.2 22.9±0.35
25週
Male Normal 9.94±0.11 4.16±0.19 0.167±0,008 154.5±5,4 17.7±0.28
TG 10.22±0.20 4.54±0.13 0.172±0.005 149.8±5.2 16.4±0.30
Female Normal 9.89±0.16 3.23 ±0.09 0.166±0.005 138.6±3.7 19.5±0.81
TG 10.10±0.18 3.96±0.21a 0.150±0.010 138.5±6.8 18.6±0.45
36週
Male Normal 9.66 ±0.13 4.86±0.32 0.161 ±0.009 117.8±6.6 17.5±1.01
TG 9.98±0.26 4.55±0.35 0.170±0.010 118.2+2.5 16.7±0.40
Female Normal 10.46 ±0.56 3.33±0.15 0.195±0.018 129.4±4.4 20.1 ±0.53
TG 10.76 ±0.58 4.00±0.32a 0.212±0.009 123.7± 1.9 21.2±0.49
50週
Male Normal 10.50±0.15 4.25+0.38 0.165±0.008 153.5±5.1 17.2±0.78
TG 11.50±0.43b 4.25±0.20 0.165±0.008 156.7土 6.1 20.1 ±1.15
Female Normal 10 76±0.52 3.21 ±0.19 0.164±0,013 130.8±8,6 20.3±1.25
TG 12.04±0.19b 2.98 ±0.18 0.177±0.010 147.9±3.2 22.3± 1.26
レギュカルチントランスジエニックラットと正常ラットは各週齢 1 4、 25、 36及び 50週齢に おいて解剖し、採血した。各値は 6匹の動物の平均値土標準誤差として表示
a pく 0.05. b pく 0.01 (正常ラツトの場合と比較して）
[0043] さらに、表 2に示すように、血清カルシウム濃度がレギュカルチントランスジヱニックラ ット (雄、雌)の 50週齢で有意に上昇することが見い出され、また、血清無機リン濃度 は 14、 25、 36週齢の雌レギュカルチントランスジエニックラットにおいて有意に上昇し
た。
[0044] なお、血清中、亜鉛、グルコース及び尿素窒素濃度はレギュカルチントランスジェ- ックラット (雄、雌)の 14、 25、 36及び 50週齢において、正常ラットと比較して、有意 に変動しな力つた。
[0045] このように、レギュカルチントランスジエニックラットにおいては、高脂血症が極めて 特徴的であり、とくに雌ラットにおける高アルブミン血症も特異な現象であった。
[0046] レギュカルチントランスジヱ-ックラットが高脂血症 ·高アルブミン血症モデル動物と して有用であることがさらに支持する知見が得られた。
産業上の利用可能性
[0047] 本発明の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物を用いると、加齢期に おける肝臓病態及び高脂血症発症メカニズムの基礎的知見が得られるばカゝりでなく 、高脂血症や高アルブミン血症の臨床例を示す疾患の予防'治療剤の開発に有利 に利用することができる。
Claims
請求の範囲
[I] レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェ-ッ ク非ヒト動物力 なる高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物。
[2] トランスジエニック非ヒト動物を、高脂血症及び Z又は高アルブミン血症の症状を呈 する老齢 (加齢)期まで飼育することにより得られることを特徴とする請求項 1記載の 高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物。
[3] トランスジ ニック非ヒト動物 (雌)を、高アルブミン血症の症状を呈するまで飼育す ることにより得られることを特徴とする請求項 1記載の高脂血症及び Z又は高アルブミ ン血症モデル動物。
[4] 非ヒト動物が、老齢 (加齢)期にお 、て骨病態を呈することを特徴とする請求項 1一
3のいずれか記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物。
[5] ホモ体であることを特徴とする請求項 1一 4の 、ずれか記載の高脂血症及び Z又は 高アルブミン血症モデル動物。
[6] 非ヒト動物がラットであることを特徴とする請求項 1一 5のいずれか記載の高脂血症 及び Z又は高アルブミン血症モデル動物。
[7] 老齢 (加齢)期が、 36週齢一 50週齢であることを特徴とする請求項 6記載の高脂血 症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物。
[8] レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェ-ッ ク非ヒト動物を、高脂血症及び Z又は高アルブミン血症のモデル動物として使用する 方法。
[9] トランスジエニック非ヒト動物を、老齢 (加齢)期まで飼育して、高脂血症及び Z又は 高アルブミン血症のモデル動物として使用する請求項 8記載の方法。
[10] トランスジヱニック非ヒト動物 (雌)を、高アルブミン血症の症状を呈するまで飼育して 、高脂血症及び Z又は高アルブミン血症のモデル動物として使用する請求項 8記載 の方法。
[I I] 非ヒト動物が、老齢 (加齢)期にお 、て骨病態を呈することを特徴とする請求項 8— 10の!、ずれか記載の方法。
[12] ホモ体であることを特徴とする請求項 8— 11のいずれか記載の方法。
[13] 非ヒト動物がラットであることを特徴とする請求項 8— 12のいずれか記載の方法。
[14] 老齢 (加齢)期が、 36週齢一 50週齢であることを特徴とする請求項 13記載の方法
[15] 請求項 1一 7のいずれか記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物 に、被検物質を投与し、血中の脂質及び Z又はアルブミン量を測定'評価することを 特徴とする高脂血症及び Z又は高アルブミン血症の治療薬のスクリーニング方法。
[16] 請求項 1一 7のいずれか記載の高脂血症及び Z又は高アルブミン血症モデル動物 力 高脂血症及び Z又は高アルブミン血症の症状を呈する老齢 (加齢)期までに、被 検物質を投与し、老齢 (加齢)期以後に、血中の脂質及び Z又はアルブミン量を測 定 '評価することを特徴とする高脂血症及び Z又は高アルブミン血症の予防薬のスク リーニング方法。
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