JP3949520B2 - レギュカルチン過剰発現モデル動物 - Google Patents
レギュカルチン過剰発現モデル動物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3949520B2 JP3949520B2 JP2002177666A JP2002177666A JP3949520B2 JP 3949520 B2 JP3949520 B2 JP 3949520B2 JP 2002177666 A JP2002177666 A JP 2002177666A JP 2002177666 A JP2002177666 A JP 2002177666A JP 3949520 B2 JP3949520 B2 JP 3949520B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bone
- regucalcin
- measurement evaluation
- animal
- human animal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108050007056 Regucalcin Proteins 0.000 title claims description 117
- 102000017955 Regucalcin Human genes 0.000 title claims description 102
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 57
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title description 14
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 47
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 47
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 35
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 32
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 claims description 29
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 22
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 238000011325 biochemical measurement Methods 0.000 claims description 18
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 17
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 14
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 12
- 230000037182 bone density Effects 0.000 claims description 12
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 claims description 12
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 10
- 208000012766 Growth delay Diseases 0.000 claims description 6
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 claims 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 71
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 56
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 35
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101000582783 Rattus norvegicus Regucalcin Proteins 0.000 description 8
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 238000011824 transgenic rat model Methods 0.000 description 7
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 6
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 5
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 5
- 206010038464 renal hypertension Diseases 0.000 description 5
- 230000010245 tubular reabsorption Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 4
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 3
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000162682 Heterogen Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037147 Hypercalcaemia Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 2
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000148 hypercalcaemia Effects 0.000 description 2
- 208000030915 hypercalcemia disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000000738 kidney tubule Anatomy 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000008689 nuclear function Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010006002 Bone pain Diseases 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010018367 Glomerulonephritis chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000013038 Hypocalcemia Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000027067 Paget disease of bone Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N [P].[Ca] Chemical compound [P].[Ca] ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000883 anti-obesity agent Substances 0.000 description 1
- 229940125710 antiobesity agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004380 ashing Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 1
- 208000016738 bone Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000018678 bone mineralization Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO.OC1=CC=CC=C1 ZYWFEOZQIUMEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010061989 glomerulosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000705 hypocalcaemia Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- -1 isopropylthio β-D-galactoside Chemical compound 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008531 maintenance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 208000005368 osteomalacia Diseases 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000011663 regulation of signaling Effects 0.000 description 1
- 230000036454 renin-angiotensin system Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007442 rickets Diseases 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
- A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cardiology (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、レギュカルチン遺伝子導入トランスジェニック非ヒト動物、詳しくは、レギュカルチン遺伝子が導入され体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物や、かかるトランスジェニック非ヒト動物を用いるレギュカルチンの製造方法や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法や、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法等に関する。また本発明は、骨粗鬆症に代表される骨病態のモデル動物、より詳しくは、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認され、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨病態を呈する骨病態モデル動物や、該骨病態のモデル動物を用いた骨粗鬆症に代表される骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ペプチドホルモンが細胞膜の受容体に結合し、細胞内にその情報を伝達する仕組みの中で、Ca2+は主役を演じている。細胞内にはCa2+を結合する多くのタンパク質が存在するが、その作用を増幅するタンパク質として、カルモジュリンは重要な役割を果たしており、Ca2+はこのカルモジュリンに結合し、細胞機能の調節に関与する各種の酵素を活性化することが解明されている(Science, 202, 19-27, 1984)。また、Ca2+がプロテインキナーゼCやその他のCa2+結合タンパク質(酵素も含む)に作用することも知られている(Science, 233, 305-312, 1986)。レギュカルチンも、本発明者らによりラット肝細胞質から単離されたCa2+結合蛋白質である。
【0003】
レギュカルチンは、分子量が33388のCa2+結合タンパク質で、そのCa2+結合定数が4.19×105M-1を示し、6〜7個の高親和性Ca2+結合部位を持ち、α−ヘリックス構造を34%含む、肝臓に顕著に存在する等電点pI5.20の酸性蛋白質である。レギュカルチンは、カルモジュリンや他の多くのCa2+結合タンパク質にみられる部位EFハンド構造(領域)を含まない特異なタンパク質で、例えば、Ca2+を結合することにより、カルモジュリンはα−ヘリックス含量が増加し、その構造が堅固になるが、レギュカルチンはα−ヘリックス含量が減少する。また一方、細胞機能調節において、レギュカルチンは、カルモジュリンによる酵素活性化を阻害し、プロティンキナーゼCの活性化をも阻害することが明らかになっている。このように、レギュカルチンは、シグナリングの制御タンパク質として機能するなど多くの知見が蓄積されている(FEBS Lett,
327, 251-255, 1993)。
【0004】
レギュカルチン遺伝子は、ラットにおいてX染色体(Xq 11.1-12)に存在し、ヒトにおいてもX染色体に位置する。レギュカルチン遺伝子は、ラットやヒトの他、サル,マウス,イヌ,ウシ,ウサギ,ニワトリ等の高等動物に見い出されているが酵母にはなく、高度に分化されたタンパク質をコードするものと考えられている。レギュカルチンcDNAはクローニングされており、その全構造も決定されている(特開平7−123985号公報)。ラット肝のレギュカルチンcDNAは、全アミノ酸をコードする塩基対が0.897kbであり、299のアミノ酸を翻訳する。また、マウス肝やヒト肝のレギュカルチンcDNAの塩基配列も決定されており、ラット肝のレギュカルチンcDNAと比較して、それぞれ94%と約89%のホモロジーを有している。レギュカルチンmRNAの発現は、ヒト,ラット,マウス,ウシ,ニワトリ等の肝臓においてみられ、これらの肝臓にはレギュカルチンタンパク質の存在も確認されている。
【0005】
レギュカルチンは、多機能性を有する細胞内Ca2+シグナリングの制御蛋白質として特徴を有する蛋白質であり、細胞機能調節に関与する重要な蛋白質であることが知られている(Life Sciences 66, 1769-1780, 2000、Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 1-6, 2000)。また、生体内における肝臓や腎臓におけるレギュカルチンの発現が肝障害(Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994)や腎障害(Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995)時に低下することが動物実験的に明らかにされており、レギュカルチンと病態成因との関連が示唆されている。そして、GOT、GPT等の既存の肝機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するレギュカルチンの血清中の濃度を測定することにより、肝疾患患者血清を鑑別する方法、すなわち、肝疾患患者の血清ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、その測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用であることも知られている(特開平10−26623号公報)。
【0006】
他方、骨組織は、骨細胞と基質からなり、1/3はコラーゲンを主成分とする有機質、2/3はカルシウム−リンの骨塩である無機質からできており、構造上は緻密質と海綿質と皮質に分けられ、例えば長骨の骨幹は緻密質、骨端は皮質で囲まれた海綿質から構成されている。骨は一旦形成された後は全く変化しない構築物ではなく、骨形成と骨吸収のバランスの上にその構造および量は維持されている。従って、加齢あるいはその他の原因によりそのバランスが崩れると、種々の骨疾患を発症する。骨疾患のうち、カルシウム塩が骨から血液中に溶出してゆく骨吸収の異常亢進によって起きるものとしては、骨髄腫やリンパ腫などが原因で起こる悪性高カルシウム血症、局所性骨吸収によりもたらされる骨ぺージェット病、骨の絶対量が減少しているが骨の質的な変化を伴わない骨粗鬆症等が挙げられる。これらの疾患は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の原因となることが知られており、現在、これらの疾患は高齢人口の増加に伴い社会問題化している。
【0007】
その他、高カルシウム血症、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、骨減少症などの骨疾患、糸球体腎炎、糸球体硬化症、慢性腎炎、腎不全などの腎臓疾患、悪性腫瘍、乾癬症あるいはそれらの合併症などの病態モデル動物として利用することができ、これらの病態機序の解明および疾患の治療方法の検討、ならびに治療薬のスクリーニングを行うことが可能な、外来性25−水酸化ビタミンD324−水酸化酵素遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物が知られている(特開平11−9140号公報)。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
レギュカルチンタンパク質は、肝臓に特異発現される他、腎臓,心臓,大脳(神経細胞)にも低レベルで発現し、細胞内のCa2+シグナリング関連細胞機能の調節に関与し、その発現が低下すると生理的異常を来たす特異な多機能性蛋白質であり、これまでラットの肝臓から単離した蛋白質や抗レギュカルチンモノクローナル抗体を用いて、その機能解析が行われ、上記のカルシウムシグナルの制御因子としての役割の他、細胞内カルシウム輸送酵素の調節や、プロテアーゼの活性化因子としての役割や、細胞核のカルシウム輸送の調節、細胞核DNA分解における役割、肝再生時の細胞核機能における役割等の細胞核機能の調節や、腎尿細管カルシウム再吸収における役割など、多くの生体調節におけるレギュカルチンの機能的役割が本発明者により明らかにされている。
【0009】
本発明者は、レギュカルチンの種々の機能的役割の解明についての研究過程で、レギュカルチンが他の数多くのCa2+結合タンパク質とは異なる特異的作用を有する点に着目し、カルシウムが関与する各種細胞の機能調節は、生体内におけるレギュカルチンの発現量とカルモジュリンをはじめとする他の数多くのCa2+結合タンパク質の発現量とのバランスの上に成立していると考え、レギュカルチンの発現量と他の数多くのCa2+結合タンパク質の発現量とのバランスが崩れた場合に、生体に生じる変化・影響を調べることにした。本発明の課題は、元来高等動物の肝臓等に発現しているレギュカルチンを過剰に発現させ、他の数多くのCa2+結合タンパク質とのバランスを崩した場合に、生体にどのような変化・影響が生じるかを調べるためのツールであるレギュカルチン過剰発現モデル動物を提供することにある。
【0010】
また従来、骨粗鬆症に代表されるカルシウム骨代謝に係り、高齢化や特に女性において多発する骨病態の予防、治療薬剤開発には、卵巣摘出ラットが用いられるが、卵巣摘出動物は外科的摘出手術を要し、さらに骨量減少を起こさせるまでに3ヶ月以上の飼育が必要で、研究経費が高額になるばかりでなく技術的、時間的な制約も多かった。また臨床面において見られる他の骨病態モデル動物として炎症性(リュウマチ)関節炎骨病態モデル動物があるが、これは薬物投与により発症させるため、他の副作用を伴い生理的に問題があった。本発明の課題は、また、上記問題を解決することができる、卵巣摘出等の外科的摘出手術を要することなく、さらに骨量減少を起させるまでの飼育期間が不要であり、副作用を伴うなどの生理的な問題がない、骨粗鬆症に代表される骨病態のモデル動物を提供することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、ラット肝臓cDNAライブラリーからレギュカルチンcDNAをクローニングし、レギュカルチン蛋白質の全長をコードするcDNAを単離し、このラットレギュカルチン全長cDNAよりORFを切り出し、発現ベクター(pCXN2)に導入し、この遺伝子発現ベクターをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを発生させ、その産仔の組織からDNAを抽出し、PCR法によってレギュカルチンcDNAが組み込まれているラットを確認したところ、29匹の産仔からレギュカルチンcDNAを発現するホモ体のラット5匹(雄4匹、雌1匹)が作出され、かかるトランスジェニックラットの体重の増加が有意に抑制されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
また、本発明者は、外見上何ら骨病態を呈していない上記レギュカルチン遺伝子導入によりレギュカルチン過剰発現能を獲得した形質転換ラットについて、偶々、動物研究用pQTC(Peripheral Quantitative Computed Tomography)骨密度測定装置による骨の形態学的(骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ)測定評価、及び骨成分の生化学的(カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるDNA量)測定評価を実施したところ、特に大腿骨において形態学的にも生化学的にも、骨量、骨密度の減少による骨吸収(骨塩溶解)による骨組織の脆弱化、骨形態変化、および尾骨成長遅延などの顕著な骨病態を呈することを見い出し、このレギュカルチン過剰発現病態モデルラットの形質が継代的に安定しており、商業的生産に耐えるものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0013】
すなわち本発明は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物を骨病態モデル動物として使用する方法(請求項1)や、骨病態モデル動物が、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか1以上の骨病態を呈することを特徴とする請求項1記載の方法(請求項2)や、骨病態モデル動物が、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び/又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認されたことを特徴とする請求項1又は2記載の方法(請求項3)に関する。
【0014】
また本発明は、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項3記載の方法(請求項4)や、骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量のいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項3記載の方法(請求項5)や、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ホモ体であることを特徴とする1〜5のいずれか記載の方法(請求項6)に関する。
【0015】
さらに本発明は、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の方法(請求項7)や、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ラットであることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の方法(請求項8)に関する。
【0016】
そしてまた本発明は、請求項1〜8のいずれか記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び/又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項9)や、骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項9記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項10)に関する。
【0017】
本発明はまた、骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量のいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項9記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項11)や、骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項9〜11のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項12)に関する。
【0018】
【発明の実施の形態】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ここで、レギュカルチンを過剰発現するとは、野生型の非ヒト動物のレギュカルチン発現量に比べて有意に多量のレギュカルチンを発現することをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット,マウス,ウシ,ブタ,ニワトリ,カエル,ヒト,イヌ,ウサギ等を挙げることができるが、中でもラットが好ましい。モデル動物としてよく用いられているマウスでは臓器が小さく病態の解析には限界があることもあるが、例えば血圧測定などラットにおいてはこれが可能になり、病態解明や遺伝子治療のための動物実験的手段としてきわめて有用となる。
【0019】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、サイトメガロウイルス−IEエンハンサー,チキンβ−アクチンプロモーター,レギュカルチン遺伝子,ラビットβ−グロビンポリAシグナルの順に配列された直鎖DNAが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。例えば、マーカー遺伝子,サイトメガロウイルス−IEエンハンサー,チキンβ−アクチンプロモーター,cDNA挿入サイト,ラビットβ−グロビンポリAシグナル等を有する発現ベクター(pCXN2)にレギュカルチン全長cDNAを導入したものを用いると、効率よくトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【0020】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、レギュカルチン遺伝子が、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物、特に、配列表の配列番号2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が、配列表の配列番号1記載のDNA配列からなるラットレギュカルチン遺伝子であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができるが、レギュカルチン遺伝子の由来としては、ラットの他、マウス,ウシ,ブタ,ニワトリ,カエル,ヒト,イヌ,ウサギ等特に制限されるものではない。
【0021】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことから、実験モデル動物として特に好ましい。また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物として、体重の増加が野生型の非ヒト動物に比べて有意に抑制された、すなわち体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物を好適に挙げることができる。レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物が、かかる体重増加抑制能を有することは全く予想できなかったことであり、この新たな知見はレギュカルチンが肥満防止剤としての有用性をもつ可能性があることを示唆している。かかる新たな知見からして、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現することを特徴とする体重増加抑制能を有するトランスジェニック非ヒト動物ということもできる。
【0022】
また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、大脳機能障害発症性,インスリン非依存性糖尿病発症性,腎性高血圧発症性,尿細管再吸収障害発症性等のレギュカルチン過剰発現に起因する症状や疾病のうち少なくとも1以上の症状や疾病を発現するトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。大脳機能障害は、大脳の記憶維持メカニズム上必要とされるCa−カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素の活性化を、過剰発現したレギュカルチンが抑制して、神経細胞内の神経伝達を制御することにより発症するものと考えられ、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、記憶などの大脳機能の障害(アルツハイマー等の痴呆症)の実験モデル動物として有用である。また、レギュカルチンは、肝臓や腎臓において発現し、ホルモンの細胞内情報伝達の制御を行っており、レギュカルチンの過剰発現により、肝臓と腎臓の機能を調節するホルモンの作用発現が障害され、肝臓においては、インスリンの働きを抑制することからインスリン非依存性糖尿病を誘発し、腎臓においては、レニン−アンジオテンシン系に関係した腎性高血圧、さらに電解質代謝に関連した尿細管再吸収障害を誘発するものと考えられ、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン非依存性糖尿病,腎性高血圧,尿細管再吸収障害等の実験モデル動物として有用である。
【0023】
本発明の体重増加抑制能を有するモデルラット等のモデル動物の樹立方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製方法(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384,1980)を用いた方法を挙げることができる。例えば、レギュカルチン(RC)トランスジェニックラットを創製する方法としては、ラット肝臓cDNAライブラリーからレギュカルチンのcDNAをクローニングし、レギュカルチンタンパク質の全長をコードするcDNAを単離後、オープンリーディングフレーム(ORF)を切り出し、発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺伝子を含む直鎖DNAフラグメントをラット受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるいは2細胞期胚を仮親ラットの卵管に移植し、仔ラットを発生させ、その産仔の組織から抽出したDNAを用いてPCR法等により、レギュカルチンcDNAが組み込まれていることを確認する方法等を挙げることができる。
【0024】
本発明のレギュカルチンの製造方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物、好ましくはホモ体のトランスジェニック非ヒト動物を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、ホモ体のレギュカルチントランスジェニックラットから肝臓を取り出し、そのホモジネートから文献(Chem. Pharm. Bull. 26, 1915-1918, 1978)記載の方法に準じて、レギュカルチンを単離・精製することができる。また、レギュカルチンの増収を目的として、トランスジェニック非ヒト動物にカルシウム、カルチトニン、インスリン、エストロゲン等を投与することもできる。
【0025】
本発明のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物又は該トランスジェニック非ヒト動物由来の組織,器官もしくは細胞と被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、上記レギュカルチン過剰発現に起因する疾病としては、大脳機能障害,インスリン非依存性糖尿病,腎性高血圧,尿細管再吸収障害等を例示することができる。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における体重増加の程度や、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる組織,器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織、器官又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織,器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織,器官又は細胞のレギュカルチンの発現抑制量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
【0026】
上記組織や器官としては、肝臓,腎臓尿細管,心臓,大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を構成する肝細胞,神経細胞等を具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。このように、上記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチン過剰発現に起因する疾病、例えば大脳機能障害,インスリン非依存性糖尿病,腎性高血圧,尿細管再吸収障害等の予防・治療薬をスクリーニングすることができ、かかるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬も本発明の範疇に含まれる。
【0027】
本発明のレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質のスクリーニング方法としては、本発明のトランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック非ヒト動物由来の組織,器官もしくは細胞と被検物質とを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、レギュカルチン発現低下に起因する疾病としては、動脈硬化,心筋梗塞等を例示することができる。上記トランスジェニック非ヒト動物と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を直接投与し、該トランスジェニック非ヒト動物における体重減少の程度や、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の程度を測定・評価する方法や、被検物質投与後のトランスジェニック非ヒト動物から得られる組織,器官又は細胞におけるレギュカルチンの発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織,器官又は細胞と被検物質とを用いる方法としては、トランスジェニック非ヒト動物由来の組織,器官又は細胞を被検物質の存在下で培養し、該組織,器官又は細胞のレギュカルチンの発現増加量の程度を測定・評価する方法や、組織や器官における形態変化をモノクローナル抗体による免疫染色法や電子顕微鏡により評価する方法などを挙げることができる。
【0028】
上記組織や器官としては、肝臓,腎臓尿細管,心臓,大脳等を、細胞としてはこれら組織や器官を構成する肝細胞,神経細胞等を具体的に挙げることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。このように、上記本発明のスクリーニング方法によると、レギュカルチン発現低下に起因する疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞等の原因物質をスクリーニングすることができ、かかるスクリーニング方法により得られるレギュカルチン発現低下に起因する疾病の原因物質は、レギュカルチンの生体内における作用・役割をより一層明らかにする上で有用であり、また、これら原因物質に結合する物質等その作用を阻害する物質をスクリーニングすることにより、レギュカルチン発現低下に起因する疾病の予防・治療薬を開発することができる可能性があることからしても有用であり、かかる原因物質も本発明の範疇に含まれる。
【0029】
次に、本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物であって、骨病態を呈するモデル動物であれば特に制限されるものではなく、かかる骨病態モデル動物として、レギュカルチン遺伝子が導入された上述の本発明のトランスジェニック非ヒト動物を好適に例示することができる。したがって、以下本発明の骨病態モデル動物や骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法について説明するが、より詳細には、上述の本発明のトランスジェニック非ヒト動物に関する記載や、本発明のレギュカルチン過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法等に関する記載を参照することができる。なお、本発明において、骨病態とは、骨粗鬆症に代表されるカルシウム骨代謝異常等により、骨量の減少、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延等の骨やその成長が正常でない状態をいう。
【0030】
上記本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか1以上の測定評価、及び/又は、骨成分の生化学的測定評価、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量のいずれか1以上の測定評価により選抜・確認された、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか1以上の骨病態を呈する骨病態モデル動物が好ましく、上記骨の形態学的測定評価には、動物研究用pQTC(Peripheral Quantitative Computed Tomography)骨密度測定装置(Bone Vol.29, No.2, August 2001; 101-104)を特に有利に用いることができる。また、骨成分の生化学的測定評価は、後述する実施例に記載されているような、この分野における常法により実施することができる。なお、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価には、大腿骨等の骨自体が必要な、供試動物をそのまま骨病態モデル動物として使用できないことから、上記選抜・確認された骨病態モデル動物とは、骨の形態学的測定評価や骨成分の生化学的測定評価に供した動物と同腹の動物又はその子孫をいう。
【0031】
本発明の骨病態モデル動物は、例えば前記のように、本発明者が作製したラットレギュカルチン発現ベクターから切り出され、リニアライズされたDNAフラグメントを別途調整した受精卵卵胞細胞にマイクロインジェクション法で注入し、卵細胞を培養後、発生が進み異常が認められない胚を仮親の卵管内に移植し、生まれた産仔について、特に動物研究用pQTC骨密度測定装置による骨の形態学的測定評価、及び骨成分の生化学的測定評価の結果を行うことにより、選抜・確認することができ、これらの中でも、骨病態の表現形質が継代的に安定し、商業的生産に適したものが好ましい。また、本発明の骨病態モデル動物としては、ホモ体であるレギュカルチントランスジェニック骨病態モデル動物を好ましく例示することができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するラット等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、レギュカルチン発現量がヘテロ体よりも多いことから、骨変化等の骨病態の表現形質がより強く現れることから好ましい。さらに、本発明の骨病態モデル動物としては、レギュカルチン遺伝子がX染色体上にあり、雄よりも雌において骨変化等の骨病態の表現形質がより顕著に現れることから、雌ラット等の雌の骨病態モデル動物を好ましく例示することができる。
【0032】
本発明の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法としては、上記本発明の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び/又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とするスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、被検物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、蛋白質などの他に、例えば哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清などや、各種植物の抽出成分等が用いられる。例えば、被検化合物を本発明の骨病態モデル動物に経口的又は非経口的に投与し、該骨病態モデル動物における、例えば骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ等の骨の形態学的測定評価や、例えばカルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量等の骨成分の生化学的測定評価を実施することにより、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治療薬をスクリーニングすることができる。また、これらのスクリーニングに際して、野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物における場合と比較・評価することが、個体レベルで正確な比較実験をすることができることから好ましい。
【0033】
また、本発明の骨病態の予防・治療薬としては、上記本発明のスクリーニング方法により得られる骨病態の予防・治療薬であれば特に制限されるものではなく、これら予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる、骨粗鬆症等の骨病態の予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【0034】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例1[ラットRCcDNA調製]
(RNAの調製)
ウイスター系雄性ラット(3週齢)から肝臓を摘出し、グアニジン−イソチオシアネート液(4Mグアニジニウムチオシアネート,25mMクエン酸ナトリウム(pH7.0),0.5%サルコシル,0.1M2−メルカプトエタノール,2M酢酸ナトリウム)でホモジナイズした。これをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール混液で抽出し、4℃、10,000×gで20分遠心した。水層にイソプロパノールを加え、−20℃で放置し、RNAを沈澱させた。回収した沈澱はジエチルピロカーボネート処理した0.5%ドデシル硫酸ナトリウムに溶解した。これをオリゴ(dT)セルロースカラムに通し、ポリ(A)+RNAを精製した。
【0035】
(cDNAライブラリーの作製)
精製したポリ(A)+RNA(5μg)に50unitのMoloney-Murine Leukemiaウイルス逆転写酵素とオリゴ(dT)18プライマーリンカーを添加し、1本鎖cDNAを合成した。さらに合成した1本鎖cDNAに大腸菌リボヌクレアーゼHとDNAポリメラーゼIを添加し、2本鎖cDNAを合成した。これにEcoRIアダプターを付加し、XhoI,EcoRIで消化したファージ発現ベクター(λZAPII)と連結した。さらにパッケージングエキストラクトを用いてファージにパッケージングしcDNAライブラリーのファージを作製した。
【0036】
(RCcDNAクローンの選抜)
ラット肝のcDNAライブラリーのファージ約1×106個を大腸菌と混合し20個の寒天プレートに植菌した。42℃で3時間半インキュベートした後、プレートに10mMイソプロピルチオβ−D−ガラクトシドで処理したニトロセルロース膜をのせ、37℃で3時間半インキュベートした。ニトロセルロース膜はブロッキングした後、抗RCウサギ血清(×200)と室温で2時間インキュベートした。膜は洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギIgG抗体を加えインキュベートした。これを発色液(0.35mMニトロブルーテトラゾリウム,0.4mM5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート)に浸し発色させ、RCcDNA陽性プラークを同定した。
【0037】
(プラスミドベクターへのサブクローニング)
ファージベクターλZAPIIは、その配列中にプラスミドベクターであるpBluescriptの塩基配列を含み、λZAPIIにクローニングされたRCのcDNA断片はこのpBluescriptに挿入されている。また、pBluescriptの両端にはヘルパーファージの複製開始点と終結点が存在している。そこで同定したプラークよりファージを単離し、R408ヘルパーファージとともに大腸菌SUREに感染させ、RCのcDNA断片を含むpBluescriptを大腸菌内で合成させ、ヘルパーファージの形で大腸菌体外に放出させた。このファージ液をさらに大腸菌SUREに感染させ、RCのcDNA断片を有するプラスミドとして菌内で複製させた。この大腸菌を50μg/mlアンピシリン含有のLBプレートに植菌し、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
【0038】
(cDNAインサートの塩基配列の決定)
Sequenaseシステム(US Biochemical社製)を用いてcDNAインサートの全塩基配列を決定した。すなわちプラスミドDNAをEcoRIで切断し、断片はアルカリ変性処理した後、プライマーを加えアニーリングした。これに35S dCTP、0.1M DTT、Sequense用酵素液を添加した後4等分し、各々にddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTPを加え、37℃5分間インキュベートした。これらはアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーを行ない、塩基配列を読み取った。配列番号1にレギュカルチンcDNAの全塩基配列を示す。また、得られたアミノ酸配列も配列番号2に示す。これから計算されるレギュカルチンの分子量は33,388であった。この値は精製したレギュカルチンをSDSポリアクリルアミド電気泳動法により算出した分子量と一致した。
【0039】
実施例2[トランスジェニックラットの創製]
(導入遺伝子の構築)
実施例1で得られたラットレギュカルチン全長cDNAを含むプラスミド、RC−900(glycerol stock;RC−F)、ベクターpBluescript SK(−)より、ORF全てを含むDNA断片をPstIを用いて切り出した(図1A)。この切り出したPstIフラグメントをpBluescript II KS(+)のPstIサイトに組み込んだ(図1B)。次にEcoRIで切り出し、得られたEcoRIフラグメント(図2A)を、発現ベクターpCXN2(クロンテック社)(Gene 108, 193-199, 1991)のEcoRIサイトに導入し(図2B)、ラットレギュカルチン発現ベクターRC/ pCXN2を調製した。このRC/pCXN2をSalIとSfiIとMluIで切断し、リニアライズされた3.6kbpのフラグメントを得た(図3)。
【0040】
(トランスジェニックラットの作製)
ラットの前核期受精卵への上記リニアライズされた3.6kbpのDNAフラグメント溶液のマイクロインジェクションは下記の要領で実施した。4週齢のスプラーグ−ドーリー(SD, Sprague-Dawley)系雌ラットを明暗サイクル12時間(明時間 4:00〜16:00)、温度約23℃、湿度約55%で飼育し、膣スメア法により雌の性周期を観察してホルモン処理日を選択した。雌ラットに150IU/kgの妊馬血清性性腺刺激ホルモン(日本全薬社製「PMSゼンヤク」)を腹腔内投与して過剰排卵処理を行い、その48時間後に150IU/kgのヒト胎盤性性腺刺激ホルモン(三共エール薬品(株)社製「プべローゲン」)を腹腔内投与した後、雄との同居により交配を行わせ、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン投与32時間後に卵管灌流により前核期受精卵を採取した。
【0041】
この様にして調製したウイスターラットの受精卵の雄性前核に、前記3.6kbpのDNAフラグメント溶液(5ng/μl濃度)を顕微注入した。DNAフラグメントが注入された卵を、CO2インキュベーター内でm−KRB(m−クレブスリンガー緩衝液)培地を用いて1晩培養した。翌日2細胞へと発生が進み、異常の認められない2細胞期胚を9匹の仮親(精管結紮雄と交配させた偽妊娠雌ラット)の卵管内に1匹あたり20〜30個程度を移植し、29匹の産仔を得た。4週齢まで生存した27匹の産仔の尾よりDNAを採取し、採取したDNAをプライマーhuRC-1;GGAGGCTATGTTGCCACCATTGGA(配列番号3)、プライマーhuRC-2;CCCTCCAAAGCAGCATGAAGTTG(配列番号4)を用いてPCR法により検定した(図4)。その結果、合計5匹(雄4匹、雌1匹)のラットに導入遺伝子の存在を確認した。そのうち5匹が次世代に導入遺伝子を伝えた。
【0042】
実施例3[体重増加抑制能]
実施例2で得られたトランスジェニックラット(ヘテロ体)の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジェニックラット(ホモ体)を得た。また、ホモ体であることは、ラット尾組織より抽出したゲノムDNAへの導入遺伝子の組み込みをPCR法にて確認し、ヘテロ体のcDNA量の2倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。かかるホモ体のトランスジェニックラットを用いて体重増加抑制能について調べた。3〜4週齢の野生型SDラットとトランスジェニックラット(ホモ体)それぞれ8匹ずつの体重の平均値を表1に示す。Student's t test, P<0.01、平均値±標準誤差で表し有意差が認められ、レギュカルチン遺伝子の過剰発現により、体重増加が抑制されることを確認することができた。
【0043】
【表1】
【0044】
実施例4[骨病態モデル動物]
(SD系ホモタイプ骨病態モデルラット)
実施例2で得られたトランスジェニックラット(ヘテロ体)の系統の内、尾組織におけるレギュカルチン発現量が最も多い系統同士を交配することにより、トランスジェニックラット(ホモ体)を得た。また、ホモ体であることは、ラット尾組織より抽出したゲノムDNAへの導入遺伝子の組み込みをPCR法にて確認し、ヘテロ体のcDNA量の2倍以上の組み込み量を検出することにより確認した。外見上骨病態を呈していない上記ホモ体のトランスジェニックラットの中から、継体的に安定して生存している雌雄のラットを、試験区のSD系骨病態モデルラット(ホモ体)として用い、骨の形態学的測定評価(骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さ)と骨成分の生化学的測定評価(カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるDNA量)を行った。また、対照区として雌雄のSD系野生型正常ラットを用いた。なお、各測定評価において、試験区・対照区とも、ラットは各群5匹を使用し、各測定値は平均値±標準誤差で示し、統計的有意差検出は、Student's t-testを用いて行い、P<0.01(1%)以下を有意差ありとした。
【0045】
(骨の形態学的測定評価)
5〜6週齢の雌雄のSD系骨病態モデルラット(試験区)及びSD系野生型正常ラット(対照区)をエーテル麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に供するまで70%エタノール溶液中に完全に浸して保存したものを標本とした。この標本を動物研究用pQTC骨密度測定装置(XCT Reserch SA+:Stratec Medizintecnik GmbH Pforzhein Germany)を用いて、骨幹端部においては遠位骨端(成長軟骨板)から2.0mmの部位よりスライス幅0.5mmずつで5箇所のスキャンを行った。また、骨長の約1/2の部位を骨幹部とし、1ヶ所スキャンを行った。スキャンの結果を図5(試験区;上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部)と図6(対照区;上段及び中段が骨幹端部、下段左が骨幹部)に示す。スキャン後、各群骨幹部と骨幹端部の骨密度、骨強度、骨幹部組織の皮質骨厚、及び骨幹部組織の皮質骨外膜周囲長が自動的に算出・表示された。結果をそれぞれ表2〜表5に示す。なお、表6に、上記pQTC測定における測定パラメーターと解析パラメーターを示す。
【0046】
pQTC測定の結果、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは骨密度が減少し、特に雌において顕著であった(表2)。骨強度においては、雄の正常ラットと比較して雄の骨病態モデルラットでは骨強度が減少していたが、雌においては骨幹部、骨幹端部ともに骨病態モデルラットで骨強度が正常ラットの約40〜45%にまで減少することが明らかになった(表3)。骨幹部(皮質骨)組織の皮質は、雄雌共に、正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質骨厚が有意に減少していた(表4)。骨幹部(皮質骨)組織の皮質外膜周囲長は、雄においては2群間で有意な差は認められなかったが、雌においては、正常ラットと比較して骨病態モデルラットで皮質外膜周囲長が有意に減少した(表5)。
【0047】
【表2】
【0048】
【表3】
【0049】
【表4】
【0050】
【表5】
【0051】
【表6】
【0052】
(骨成分の生化学的測定評価)
5〜6週齢の雌雄のSD系ホモタイプ骨病態モデルラット(試験区)及びSD系野生型正常ラット(対照区)をエーテル麻酔下で解剖して大腿骨組織を摘出後、筋肉組織を除去し、所定の測定に供するまで70%エタノール溶液中に完全に浸して保存したものを標本とした。この標本から、骨幹部(皮質骨)と骨幹端部(海綿骨)に分けて、カルシウム量、骨芽細胞・造骨細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ活性、骨組織中の細胞数指標であるDNA量の測定を行った。
【0053】
骨組織中のカルシウム量(mg/g骨乾燥重量)の測定は、骨幹部(皮質骨)と骨幹端部(海綿骨)を、それぞれ640℃で24時間灰化し、重量を測り、その後6N塩酸に溶解して骨カルシウム量を原子吸光度にて測定した。骨組織中のカルシウム量をmg/g骨乾燥重量で表した結果を表7に示す。表7からもわかるように、雄雌とも正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは骨カルシウム量が有意に減少していたが、特に雌において骨カルシウム量の減少が顕著であった。
【0054】
【表7】
【0055】
骨組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は、骨幹部(皮質骨)と骨幹端部(海綿骨)を、それぞれ氷冷した6.5mMパルビタール緩衝液(pH7.4)3mlに浸し、小片にカットし、テフロン乳棒のついたPotter-Elvehjemホモジナイザーにて均質とし、超音波装置にて60秒間かけて破壊した。600rpmにて5分間遠心分離し、得られた上清を酵素活性の測定に使用した。アルカリ性ホスファターゼ活性はWalterとSchuttの方法(Bergmeyer HU (ed) Methods of enzymatic analysis, Vol.1-2,Academic Press, New York, PP856-860, 1965)に準じて測定した。また、タンパク質の濃度はLowryらの方法(J. Biol. Chem., 193, 265-273, 1951)に準じて測定した。骨組織中のアルカリ性ホスファターゼ活性を遊離したp−ニトロフェノールのμmol/min/mg蛋白質として表した結果を表8に示す。表8から、正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部(皮質骨)においては雄でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇しており、また骨幹端部(海綿骨)においては雌でアルカリ性ホスファターゼ活性が有意に上昇していた。
【0056】
【表8】
【0057】
骨組織中のDNA量の測定は、骨幹部(皮質骨)と骨幹端部(海綿骨)を、それぞれ氷冷した6.5mMパルビタール緩衝液(pH7.4)3mlに浸し、小片にカットした後、氷冷した0.1N水酸化ナトリウム溶液4.0mlにて24時間振り混ぜた。アルカリ抽出後、10,000rpmで5分間遠心分離し、得られた上清をDNA量の測定に使用した。DNA量はCeriottiの方法(J. Biol. Chem., 214,39-77,1955)に準じて測定した。骨組織中のDNA量をmg/g骨組織湿重量として表した結果を表9に示す。表9から、正常ラットと比較して骨病態モデルラットでは、骨幹部(皮質骨)においては雌でDNA量が有意に減少しており、また骨幹端部(海綿骨)においては雌雄ともにDNA量が有意に減少していた。
【0058】
【表9】
【0059】
以上のように、本発明の骨病態モデル動物においては、大腿骨組織の明らかな骨変化が見い出され、この骨変化は、大腿骨の骨幹部(皮質骨)と骨幹端部(海綿骨)の両部において、形態学的並びに生化学的(骨成分)に認められ、骨組織が骨吸収(骨塩溶解)を引き起こし、骨形成も障害されていることに基づくことが明らかになった。特に、雄(male)よりも雌(female)において、その骨変化は顕著であった。また、本発明の骨病態モデル動物においては、骨病態の発現形質が継体的に安定していることも確認されている。
【0060】
【発明の効果】
本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト動物、特にレギュカルチントランスジェニックラットは、肝障害、腎障害、糖尿病、心筋梗塞、高血圧、アルツハイマーなどCa2+シグナリングが関与する成人病、生活習慣病、老人病など病態評価用実験モデル動物として有用である。また、レギュカルチンは細胞内Ca2+シグナリングに関連した細胞機能を調節しており、本発明のレギュカルチントランスジェニック非ヒト動物はかかるレギュカルチンを過剰発現することから、臓器特異的な病態(肝癌、心筋梗塞、大脳痴呆症)の修復・改善のための遺伝子治療薬開発のためのモデル動物として有用な手段になりうる。また、本発明の骨病態モデル動物は、骨粗鬆症等の骨疾患治療のための病態モデル動物として、骨病態機構の解明や新薬の開発を目的とした前臨床試験等に有利に用いることができる。
【0061】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のトランスジェニックラット作製用発現ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長cDNAよりORF部分を切り出す過程を示す図である。
【図2】本発明のトランスジェニックラット作製用発現ベクター構築における、ラットレギュカルチン全長cDNAのORF部分を発現ベクターpCXN2に導入する過程を示す図である。
【図3】本発明のトランスジェニックラット作製用のリニアライズされた導入遺伝子断片調製の過程を示す図である。
【図4】本発明のトランスジェニックラット中のレギュカルチン遺伝子のPCRによる確認におけるプライマーの位置を示す図である。
【図5】動物研究用pQTC骨密度測定装置を用いた、本発明の骨病態モデルラットの大腿骨組織(骨幹端部及び骨幹部)のスキャンの結果を示す図である。
【図6】動物研究用pQTC骨密度測定装置を用いた、対照のSD系野生型正常ラットの大腿骨組織(骨幹端部及び骨幹部)のスキャンの結果を示す図である。
Claims (12)
- レギュカルチン遺伝子が導入され、レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物を骨病態モデル動物として使用する方法。
- 骨病態モデル動物が、骨組織の脆弱化、骨形態変化、骨成長遅延のいずれか1以上の骨病態を呈することを特徴とする請求項1記載の方法。
- 骨病態モデル動物が、レギュカルチンを過剰発現する非ヒト動物から、骨の形態学的測定評価及び/又は骨成分の生化学的測定評価により選抜・確認されたことを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項3記載の方法。
- 骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量のいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項3記載の方法。
- レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ホモ体であることを特徴とする1〜5のいずれか記載の方法。
- レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、雌の非ヒト動物であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の方法。
- レギュカルチンを過剰発現し骨病態を呈する非ヒト動物が、ラットであることを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか記載の骨病態モデル動物に被検物質を投与し、該骨病態モデル動物における骨の形態学的測定評価及び/又は骨成分の生化学的測定評価を行うことを特徴とする骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 骨の形態学的測定評価が、骨密度、骨強度、骨幹部皮質骨厚さ、皮質骨周囲長さのいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項9記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 骨成分の生化学的測定評価が、カルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、骨組織中のDNA量のいずれか1以上の測定評価であることを特徴とする請求項9記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 骨病態が骨粗鬆症であることを特徴とする請求項9〜11のいずれか記載の骨病態の予防・治療薬のスクリーニング方法。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002177666A JP3949520B2 (ja) | 2001-09-20 | 2002-06-18 | レギュカルチン過剰発現モデル動物 |
PCT/JP2002/009611 WO2003026408A1 (fr) | 2001-09-20 | 2002-09-19 | Modèle animal présentant une surexpression de régucalcine |
KR1020047004105A KR100611804B1 (ko) | 2001-09-20 | 2002-09-19 | 레규칼신 과잉발현 모델동물 |
DE60238850T DE60238850D1 (de) | 2001-09-20 | 2002-09-19 | Rattenmodell mit regucalcin-überexpression |
EP02799483A EP1437043B1 (en) | 2001-09-20 | 2002-09-19 | Rat model with overexpression of regucalcin |
US10/804,515 US7355093B2 (en) | 2001-09-20 | 2004-03-19 | Model animal with overexpression of regucalcin |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001-287698 | 2001-09-20 | ||
JP2001287698 | 2001-09-20 | ||
JP2002177666A JP3949520B2 (ja) | 2001-09-20 | 2002-06-18 | レギュカルチン過剰発現モデル動物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003164238A JP2003164238A (ja) | 2003-06-10 |
JP3949520B2 true JP3949520B2 (ja) | 2007-07-25 |
Family
ID=26622632
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002177666A Expired - Fee Related JP3949520B2 (ja) | 2001-09-20 | 2002-06-18 | レギュカルチン過剰発現モデル動物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7355093B2 (ja) |
EP (1) | EP1437043B1 (ja) |
JP (1) | JP3949520B2 (ja) |
KR (1) | KR100611804B1 (ja) |
DE (1) | DE60238850D1 (ja) |
WO (1) | WO2003026408A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20070117002A (ko) * | 2003-11-04 | 2007-12-11 | 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 | 고지혈증·고알부민혈증 모델 동물 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0797399A (ja) * | 1993-09-29 | 1995-04-11 | Fujirebio Inc | 新規ポリペプチド及びヒト老化マーカータンパクsmp30測定用試薬 |
JPH07123985A (ja) * | 1993-11-09 | 1995-05-16 | Masayoshi Yamaguchi | レギュカルチンをコードするdna断片 |
JPH1026623A (ja) * | 1996-07-10 | 1998-01-27 | Masayoshi Yamaguchi | 肝疾患患者血清の鑑別方法 |
JPH119140A (ja) * | 1997-04-30 | 1999-01-19 | Takeda Chem Ind Ltd | 25−水酸化ビタミンd3 24−水酸化酵素遺伝子導入動物 |
AUPO856097A0 (en) * | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
JPH11155420A (ja) * | 1997-12-02 | 1999-06-15 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | トランスジェニック動物 |
JP2004267002A (ja) * | 2000-10-23 | 2004-09-30 | Naoki Maruyama | セネッセンスマーカープロテイン30欠損動物、抗体およびその作製方法 |
-
2002
- 2002-06-18 JP JP2002177666A patent/JP3949520B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-19 KR KR1020047004105A patent/KR100611804B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-09-19 EP EP02799483A patent/EP1437043B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-19 WO PCT/JP2002/009611 patent/WO2003026408A1/ja active Application Filing
- 2002-09-19 DE DE60238850T patent/DE60238850D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-03-19 US US10/804,515 patent/US7355093B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2003164238A (ja) | 2003-06-10 |
EP1437043A4 (en) | 2007-01-17 |
WO2003026408A1 (fr) | 2003-04-03 |
KR20040090947A (ko) | 2004-10-27 |
US20040250306A1 (en) | 2004-12-09 |
EP1437043A1 (en) | 2004-07-14 |
US7355093B2 (en) | 2008-04-08 |
DE60238850D1 (de) | 2011-02-17 |
KR100611804B1 (ko) | 2006-08-11 |
EP1437043B1 (en) | 2011-01-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tardiff et al. | A truncated cardiac troponin T molecule in transgenic mice suggests multiple cellular mechanisms for familial hypertrophic cardiomyopathy. | |
JP2002507898A (ja) | アポリポ蛋白質eトランスジェニック動物および解析方法 | |
JP2000513929A (ja) | 進行性神経疾患を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
JP2001517065A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
JPH11510496A (ja) | 試料中のプリオンの検出、ならびにその目的で使用されるプリオン調製物およびトランスジェニック動物 | |
JP2001514528A (ja) | 天然プレセニリン1ヌルバックグラウンド上で非天然野生型および家族性アルツハイマー病突然変異プレセニリン1タンパク質を発現するトランスジェニック動物 | |
JPH11507821A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
JP3949520B2 (ja) | レギュカルチン過剰発現モデル動物 | |
US6734336B1 (en) | Gene-targeted non-human mammal with human fad presenilin mutation and generational offspring | |
JPWO2005041648A1 (ja) | 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物 | |
JP4174212B2 (ja) | パーキンソン病モデルトランスジェニックマウス | |
AU780532B2 (en) | Animal model for mesangial proliferative nephritis | |
US8993833B2 (en) | Model of Alzheimer's Disease | |
JPH119140A (ja) | 25−水酸化ビタミンd3 24−水酸化酵素遺伝子導入動物 | |
US6316689B1 (en) | 25-hydroxyvitamin D3 24-hydroylase transgenic rats | |
JP2002543767A (ja) | 生殖細胞と体細胞が4e−bp1をコードするdnaにノックアウト突然変異を含有する非ヒトトランスジェニック動物 | |
JP4512813B2 (ja) | 誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物 | |
JP6587091B2 (ja) | 寿命短縮化モデル非ヒト哺乳動物 | |
JP3817638B2 (ja) | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
JP4696316B2 (ja) | Cd9/cd81二重欠損非ヒト動物 | |
JP2006042777A (ja) | 拡張型心筋症モデル動物およびその用途 | |
JP2004313192A (ja) | 小胞体ストレスモデル動物 | |
WO2001084919A1 (en) | Model systems for neurodegenerative and cardiovascular disorders | |
JP2004313191A (ja) | メグシントランスジェニックラット | |
JP2006149330A (ja) | 抑制性ニューロン特異的にレポーター遺伝子を発現する非ヒト哺乳動物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20031210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050328 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050523 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051004 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061204 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070201 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070329 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070418 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110427 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110427 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120427 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120427 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130427 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140427 Year of fee payment: 7 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |