KR20040090947A

KR20040090947A - 레규칼신 과잉발현 모델동물

Info

Publication number: KR20040090947A
Application number: KR10-2004-7004105A
Authority: KR
Inventors: 야마구치마사요시
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Priority date: 2001-09-20
Filing date: 2002-09-19
Publication date: 2004-10-27
Also published as: KR100611804B1; JP3949520B2; WO2003026408A1; EP1437043A1; EP1437043B1; JP2003164238A; EP1437043A4; DE60238850D1; US20040250306A1; US7355093B2

Abstract

원래 고등동물의 간장 등에 발현하고 있는 레규칼신을 과잉으로 발현하는, 골다공증으로 대표되는 뼈병태 등의 레규칼신 과잉발현모델동물을 제공한다. 쥐의 간장cDNA라이브러리로부터 레규칼신cDNA를 클로닝하고, 레규칼신 단백질의 전장을 코드하는 cDNA를 단리하고, 이 쥐 레규칼신 전장cDNA로부터 ORF를 잘라내어, 발현백타(pCXN2)에 도입하고, 이 유전자발현백타를 쥐의 수정난웅성전핵에 현미주사하고, 이 수정난을 어미쥐의 난관에 이식하고, 새끼쥐를 발생시켜, 그 산생새끼쥐로부터 호모체의 쥐를 작제한다. 이와 같은 트랜스제닉 쥐는 형태학적으로도 생화학적으로도 현저한 뼈병태를 나타내며, 또, 체중의 증가가 의미있게 제어된다.

Description

레규칼신 과잉발현 모델동물{Model Animal with Overexpression of Regucalcin}

펩티드호르몬이 세포막의 수용체에 결합하고, 세포내에 그 정보를 전달하는 메커니즘 중에서, Ca²⁺는 주된 역활을 담당하고 있다. 세포내에는 Ca²⁺를 결합하는 많은 단백질이 존재하는 바, 그 작용을 증폭시키는 단백질로서, 칼모듈린은 중요한역할을 수행하고 있으며, Ca²⁺는 이 칼모듈린에 결합하여, 세포기능의 조절에 관여하는 각종 효소를 활성화하는 것이 해명되어 있다(Science, 202, 19-27, 1984). 또, Ca²⁺가 프로테인키나제C나 그 밖의 Ca²⁺결합단백질(효소를 포함한다)에 작용한다는 것도 알려져 있다(Scinence, 233, 305-312, 1986). 레규칼신도, 본 발명자들에 의해 쥐(rat)간세포질로부터 단리된 Ca²⁺결합단백질인 것이다.

레규칼신은 분자량이 33388의 Ca²⁺결합단백질로서, 그 Ca²⁺결합정수가 4.19 x 10⁵M^-1을 나타내고, 6∼7개의 고친화성 Ca²⁺결합부위를 가지며, α-헤릭스구조를 34%포함하는, 간장에 현저하게 존재하는 등전점(等電点) pI5.20의 산성단백질이다. 레규칼신은 칼모듈린이나 다른 많은 Ca²⁺결합단백질에서 보이는 부위 EF핸드구조(영역)를 포함하지 않는 특이한 단백질로서, 예를 들면, Ca²⁺를 결합하는 것에 의해, 칼모듈린은 α-헤릭스함량이 증가하고, 그 구조가 견고하게 되는데, 레규칼신은 α-헤릭스함량이 감소한다. 또, 한편, 세포기능조절에 있어서, 레규칼신은 칼모듈린에 의한 효소활성화를 저해하고, 프로테인키나제C의 활성화도 저해한다는 것이 명백하게 되어 있다. 이와 같이, 레규칼신은 시그널링의 억제단백질로서 기능하는 등 많은 지견이 축적되어 있다(FEBS Lett, 327, 251-255, 1993).

레규칼신유전자는, 쥐에 있어서 X염색체(Xp 11.1-12)에 존재하고, 인간에 있어서도 X염색체에 위치한다. 레규칼신유전자는, 쥐나 인간 외에, 원숭이, 마우스,개, 소, 토끼, 닭 등의 고등동물에서 발견되고 있으나 효모에는 없고, 고도로 분화된 단백질을 코드하는 것이라고 생각되고 있다. 레규칼신cDNA는 클로닝되어 있으며, 그 전체 구조도 결정되어 있다(일본국 특개평 7-123985호 공보). 쥐 간의 레규칼신cDNA는 전체 아미노산을 코드하는 염기쌍이 0.897kb이며, 299의 아미노산을 번역한다. 또, 마우스의 간이나 인간 간의 레규칼신cDNA의 염기서열도 결정되어 있으며, 쥐 간의 레규칼신cDNA와 비교하여, 각각 94%와 약 89%의 호몰로지를 가지고 있다. 레규칼신mRNA의 발현은, 인간, 쥐(rat), 마우스, 소, 닭 등의 간장에서 보이며, 이들 간장에는 레규칼신단백질의 존재도 확인되고 있다.

레규칼신은 다기능성을 갖는 세포내 Ca²⁺시그널링의 제어단백질로서의 특징을 갖는 단백질이며, 세포기능조절에 관여하는 중요한 단백질인 것이 알려지고 있다(Life Sciences 66, 1769-1780, 2000, Biochemical and Biophysical Reserch Communications 276, 1-6, 2000). 또, 생체내에 있어서의 간장이나 신장에 있어서의 레규칼신의 발현이 간장해(Molecular and Cellular Biochemisty 131, 173-179, 1994)나 신장해(Molecular and Cellular Biochemisty 151, 55-60, 1995)시에 저하하는 것이 동물실험적으로 밝혀지고 있으며, 레규칼신과 병태형성 원인과의 관련을 시사하고 있다. 그리고, GOT, GPT 등의 기존의 간기능마커와 달리 간장에 특이적으로 존재하는 레규칼신의 혈청중의 농도를 측정하는 것에 의해, 간질환 환자의 혈청을 감별하는 방법, 즉, 간질환 환자의 혈청에서는 레규칼신이 의미있게 상승하고 있는 반면, 건강한 사람의 혈청에서는 레규칼신은 거의 검출되지 않아서, 그 측정이 간질환환자혈청의 감별수단으로서 유용하다는 것도 알려져 있다(일본국 특개평 10-26623호 공보).

다른 한편, 뼈조직은 뼈세포와 기질로 이루어지며, 1/3은 콜라겐을 주성분으로 하는 유기질, 2/3는 칼슘-인의 골염인 무기질로 되어 있으며, 구조상으로는 치밀질과 해면질과 피질로 나뉘며, 예를 들면, 장골(長骨)의 골간(骨幹)은 치밀질, 골단(骨端)은 피질로 둘러쌓인 해면질로 구성되어 있다. 뼈는 일단 형성된 후에는 전혀 변화하지 않는 구축물이 아니라, 뼈형성과 뼈흡수의 균형상에 그 구조와 양은 유지되고 있다. 따라서, 나이가 많아지고 혹은 다른 원인에 의해 그 밸런스가 무너지면, 각종의 뼈질환이 발증한다. 뼈질환 가운데, 칼슘염이 뼈로부터 혈액중에 용출해 가는 골흡수의 이상항진에 의해 일어나는 것으로서는, 골수종이나 임파종 등이 원인으로 되어 일어나는 악성고칼슘혈증,국소성골흡수에 의해 초래되는 골 페이제트병(paget's disease), 뼈의 절대량이 감소하고 있으나 뼈의 질적인 변화를 수반하지 않는 골다공증등을 들 수가 있다. 이들의 질환은 뼈의 동통을 발생시키고, 뼈의 취약화에 의한 골절의 원인이 된다는 것이 알려져 있다. 현재, 이들 질환은 고령인구의 증가에 따라서 사회문제화되고 있다.

그 밖에, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 부갑상선기능항진증, 구루병, 골연화증, 골다공증, 골감소증 등의 뼈질환, 사구체신염, 사구체경화증, 만성신염, 신부전 등의 신장질환, 악성종양, 건선증 또는 이들의 합병증 등의 병태모델동물로서 이용할 수가 있으며, 이들의 병태기서(病態機序)의 해명과 질환의 치료방법에 대한 검토, 및 치료약의 스크리닝을 실시하는 것이 가능한, 외래성 25-수산화비타민D324-수산화효소유전자 또는 그 변이유전자를 조합한 DNA를 갖는 비인간포유동물이 알려져 있다(일본국 특개평 11-9140호 공보).

레규칼신단백질은, 간장에 특이적으로 발현되는 외에, 신장, 심장, 대뇌(신경세포)에도 낮은 레벨로 발현하고, 세포내의 Ca²⁺시그널링관련세포기능의 조절에 관여하고, 그 발현이 저하하면 생리적 이상을 초래하는 특이한 다기능성 단백질이며, 이제까지 쥐의간장으로부터 단리한 단백질이나 항 레규칼신모노클로날항체를 사용하여, 그 기능해석이 실시되고, 상기의 칼슘시그널의 제어인자로서의 역할 외에, 세포내 칼슘수송효소의 조절이나, 프로테아제의 활성화인자로서의 역할이나, 세포핵의 칼슘수송의 조절, 세포핵 DNA분해에 있어서의 역할, 간의 재생시의 세포핵기능에 있어서의 역할 등 세포핵기능의 조절이나 신뇨세관 칼슘재흡수에 있어서의 역할 등, 많은 생체조절에 있어서의 레규칼신의 기능적역할이 본 발명자들에 의해 밝혀지고 있다.

본 발명자들은, 레규칼신의 다양한 기능적 역할의 해명에 대한 연구과정에서, 레규칼신이 다른 수많은 Ca²⁺결합단백질과는 다른 특이적인 작용을 갖는다는 점에 착안하고, 칼슘이 관여하는 각종 세포의 기능조절은, 생체내에 있어서의 레규칼신의 발현량과 칼모듈린을 비롯한 다른 수많은 Ca²⁺결합단백질의 발현량과의 밸런스위에 성립하고 있다고 생각하고, 레규칼신의 발현량과 다른 수많은 Ca²⁺결합단백질의 발현량과의 밸런스가 무너졌을 때에, 생체에 발생하는 변화와 영향을 조사하기로 하였다. 본 발명의 과제는, 원래 고등동물의 간장 등에 발현하고 있는 레규칼신을 과잉으로 발현시켜, 다른 수많은 Ca²⁺결합단백질과의 밸런스가 무너졌을때에, 생체에 어떠한 변화와 영향이 발생하는가를 조사하기 위한 툴(tool)인 레규칼신 과잉발현모델동물을 제공하는 것에 있다.

또, 종래, 골다공증으로 대표되는 칼슘골대사에 있어서, 고령화나 특히 여성에 있어서 다발하는 뼈병태의 예방과, 치료약제의 개발에는 난소적출 쥐가 사용되었으나, 난소적출동물은 외과적 적출수술을 필요로 하며, 또한 골량감소를 일으키게 할 때까지 3개월이상의 사육기간이 필요하고, 연구비용이 많아질 뿐 아니라 기술적, 시간적인 제약도 많았다. 또 임상면에 있어서 보이는 다른 뼈병태 모델동물로서 염증성(류마티스)관절염 뼈병태 모델동물이 있으나, 이것은 약물투여에 의해 발증시키기 때문에, 다른 부작용을 수반하여 생리적으로 문제가 있었다. 또한, 본 발명의 과제는, 상기한 문제를 해결할 수가 있는, 난소적출 등의 외과적 적출수술을 필요로 하지 않고, 또한, 골량감소를 일으킬때까지의 사육기간이 불필요하며, 부작용을 수반하는 등의 생리적인 문제가 없는, 골다공증으로 대표되는 뼈병태의 모델동물을 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기 문제를 해결하기 위해, 쥐간장cDNA라이브러리로부터 레규칼신cDNA를 클로닝하고, 레규칼신단백질의 전장(全長)을 코드하는 cDNA를 단리하고, 이 쥐레규칼신 전장cDNA로부터 ORF를 잘라내서, 발현벡터(pCXN2)에 도입하고, 이 유전자 발현벡터를 쥐의 수정난웅성전핵에 현미주사(microinjection)하고, 이수정난을 가친(假親)어미쥐의 난관에 이식하여, 새끼쥐를 발생시키고, 이 산생 새끼쥐의 조직으로부터 DNA를 추출하여, PCR법에 의해 레규칼신cDNA가 조합되어 있는 쥐를 확인한 결과, 29마리의 새끼쥐에서 레규칼신cDNA를 발현하는 호모체의 쥐 5마리(수컷 4마리, 암컷 1마리)를 작출하고, 이와 같은 트랜스제닉 쥐의 체중의 증가가 의미 있게 억제되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

또, 본 발명자는 외관상 아무런 뼈병태도 나타내고 있지 않는 상기 레규칼신유전자 도입에 의해 레규칼신 과잉발현능을 획득한 형질전환 쥐에 대하여, 우연히 동물연구용 pQTC(peripheral Quantitative Computed Tomography)골밀도측정장치에 의한 뼈의 형태학적(골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위길이)측정평가, 및 뼈성분의 생화학적(칼슘량, 골아세포·조골세포의 마커효소인)알칼리포스파타제활성, 골조직중의 세포수 지표인 DNA량)측정평가를 실시한 결과, 특히 대퇴골에 있어서 형태학적으로도 생화학적으로도 골량, 골밀도의 감소에 의한 골흡수(골염용해)에 의한 골조직의 취약화, 뼈형태변화, 및 미골(尾骨)성장지연 등의 현저한 뼈병태를 나타내는 것을 발견하고, 이 레규칼신 과잉발현모델쥐의 형질이 계대적(繼代的)으로 안정되어 있으며, 상업적인 생산이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하는데 이르렀다.

본 발명은, 레규칼신 유전자도입 트랜스제닉(transgenic)비인간동물, 상세하게는, 레규칼신유전자가 도입되어 체중증가억제능을 갖는 트랜스제닉 비인간동물과, 이와 같은 트랜스제닉 비인간동물을 사용하는 레규칼신의 제조방법과, 레규칼신 과잉발현으로 기인하는 질병의 예방·치료약의 스크리닝방법, 레규칼신 발현저하로 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법 등에 관한 것이다. 또, 본 발명은 골다공증으로 대표되는 뼈병태의 모델동물, 보다 상세하게는, 레규칼신을 과잉으로 발현하는 비인간동물로부터, 뼈의 형태학적 측정평가나 골성분의 생화학적 측정평가에 의해 선발·확인되며, 골조직의 취약화, 골형태의 변화, 골성장지연 등의 뼈병태를 나타내는 뼈병태 모델동물과, 상기 뼈병태의 모델동물을 사용한 골다공증으로 대표되는 뼈병태의 예방·치료약의 스크리닝방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 트랜스제닉 쥐 작제용 발현벡터구축에 있어서의 쥐레규칼신 전장cDNA로부터 ORF부분을 잘라내는 과정을 나타내는 도면.

도 2는 본 발명의 트랜스제닉 쥐 작제용 발현벡터구축에 있어서의 쥐레규칼신 전장cDNA의 ORF부분을 발현벡터pCXN2에 도입하는 과정을 나타내는 도면.

도 3은 본 발명의 트랜스제닉 쥐 작제용의 선형화된 도입유전자 단편조제의 과정을 나타내는 도면.

도 4는 본 발명의 트랜스제닉 쥐 중의 레규칼신유전자의 PCR에 의한 확인에 있어서의 프라이머의 위치를 나타내는 도면.

도 5는 동물연구용 pQTC골밀도 측정장치를 사용한, 본 발명의 뼈병태모델 쥐의 대퇴골조직(골간단부 및 골간부)에 대한 스캔의 결과를 나타내는 도면.

도 6은 동물연구용 pQTC골밀도 측정장치를 사용한, 대조물인 SD계 야생형 정상 쥐의 대퇴골조직(골간단부 및 골간부)에 대한 스캔의 결과를 나타내는 도면.

본 발명은 레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물(청구항 1)과, 사이토메가로바이러스-ⅠE인핸서, 치킨β-액틴프로모터, 레규칼신유전자, 토끼β-글로빈폴리A시그널의 순서로 서열된직쇄 DNA가 도입된 것을 특징으로 하는 청구항 1에 기재한 트랜스제닉 비인간동물(청구항 2)과, 레규칼신유전자가, 서열표의 서열번호2기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 청구항 1 또는 2기재의 트랜스제닉 비인간동물(청구항 3)과, 서열표의 서열번호2기재의 아미노산서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자가, 서열표의 서열번호1기재의 DNA서열로 이루어지는 쥐 레규칼신유전자인 것을 특징으로 하는 청구항 3기재의 트랜스제닉 비인간동물(청구항 4)과, 호모체인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼4항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 5)과, 체중증가억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 청구항 1∼5항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 6)과, 대뇌기능장해 발증성인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼6중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 7)과, 인슐린 비의존성 당뇨병발증성인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼7항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 8)과, 신성(腎性)고혈압 발증성인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼8항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 9)과, 요세관 재흡수장해발증성인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼9항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 10)과, 비인간동물이 쥐인 것을 특징으로 하는 청구항 1∼10항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물(청구항 11)에 관한 것이다.

또, 본 발명은 청구항 1∼11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신의 제조방법(청구항 12)과, 청구항 1∼11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물 또는 상기 트랜스제닉 비인간동물유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 13)과, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중증가의 정도를 측정·평가하는 것을 특징으로 하는 청구항 13기재의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 14)과, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병이, 대뇌기능장해인 것을 특징으로 하는 청구항 13 또는 14기재의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 15)과, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병이, 인슐린 비이존성 당뇨병인 것을 특징으로 하는 청구항 13 또는 14기재의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 16)과, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병이, 신성고혈압인 것을 특징으로 하는 청구항 13 또는 14기재의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 17)과, 레귤칸신 과잉발현에 기인하는 질병이, 요세관재흡수장해인 것을 특징으로 하는 청구항 13 또는 14기재의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 18)과, 청구항 13∼18항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약(청구항 19)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 청구항 1∼11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물 또는 상기 트랜스제닉 비인간동물유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법(청구항 20)과, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중감소의 정도를 측정 ·평가하는 것을 특징으로 하는 청구항 20기재의 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법(청구항 21)과, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병이, 동맥경화심근경색인 것을 특징으로 하는 청구항 20기재의 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법(청구항 22)과, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병이, 심근경색인 것을 특징으로 하는 청구항 20 또는 21기재의 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법(청구항 23)과, 청구항 22∼23 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질(청구항 24)에 관한 것이다.

그리고 또, 본 발명은 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물에 있어서, 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물(청구항 25)과, 골조직의 취약화, 골형태의 변화, 골성장지연 중 어느 하나 이상의 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 청구항 25기재의 뼈병태 모델동물(청구항 26)과, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물로부터, 뼈의 형태학적 측정평가 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가에 의해 선발 ·확인된 것을 특징으로 하는 청구항 25 또는 26기재의 뼈병태 모델동물(청구항 27)과, 뼈의 형태학적 측정평가가, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 중 어느 하나 이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 청구항 27기재의 뼈병태 모델동물(청구항 28)과, 골성분의 생화학적 측정평가가 칼슘량, 알칼리포스파타아제활성, 골조직 중의 DNA량 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을특징으로 하는 청구항 27기재의 뼈병태 모델동물(청구항 29)과, 뼈병태의 표현형질이 계대적으로 안정되어 있는 것을 특징으로 하는 청구항 25∼29항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물(청구항 30)과, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 레규칼신유전자가 도입된 트랜스제닉 비인간동물인 것을 특징으로 하는 청구항25∼30항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물(청구항 31)과, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이 호모체인 것을 특징으로 하는 청구항 26∼31항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물(청구항 32)과, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 암컷의 비인간동물인 것을 특징으로 하는 청구항 25∼32항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물(청구항 33)과, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 쥐인것을 특징으로 하는 청구항 25∼33항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물(청구항 34)에 관한 것이다.

본 발명은 또, 청구항 25∼34항중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물에 피검물질을 투여하고, 상기 뼈병태 모델동물에 있어서의 뼈의 형태학적 측정평가 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가를 실시하는 것을 특징으로 하는 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 35)과, 뼈의 형태학적 측정평가가, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 중 어느 하나이상의 측정평강인 것을 특징으로 하는 청구항 35기재의 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 36)과, 골성분의 생화학적 측정평가가 칼슘량, 알칼리포스포타제활성, 골조직중의 DNA량 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 청구항 35기재의 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 37)과, 뼈병태가 골다공증인 것을 특징으로 하는 청구항 35∼37항 중 어느 한 항에 기재된 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법(청구항 38)과, 청구항 35∼38중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 뼈병태의 예방 ·치료약(청구항 39)에 관한 것이다.

본 발명의 트랜스제닉 비인간동물로서는, 레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이라면 특별히 제한되지 않으며, 여기서 레규칼신을 과잉발현한다는 것은 야생형의 비인간동물의 레규칼신발현량과 비교하여 의미있게 다량의 레규칼신을 발현하는 것을 말한다. 또, 상기 비인간동물로서는, 쥐, 마우스, 소, 돼지, 닭, 개구리, 사람, 개, 토끼 등을 들 수가 있으나, 이 가운데에서도 쥐가 적당하다. 모델동물로서 잘 사용되고 있는 마우스의 경우는 장기가 작아 서 병태의 해석에는 한계가 있기도 하지만, 예를 들면, 혈압측정 등 쥐에 있어서는 이것이 가능하게 되며, 병태해명과 유전자치료를 위한 동물실험적 수단으로서는 쥐가 매우 유용하다.

본 발명의 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 사이토메가로바이러스-ⅠE엔핸서, 치킨β-액틴프로모터, 레규칼신유전자, 토끼β-글로빈폴리A시그널의 순서로 서열된 직쇄 DNA가 도입된 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있다. 예를 들면, 마커유전자, 사이토메가로바이러스-ⅠE엔핸서, 치킨β-액틴프로모터, cDNA삽입사이토, 토끼β-글로빈폴리A시그널 등을 갖는 발현벡터(pCXN2)에 레규칼신 전장cDNA를 도입한 것을 사용하면, 효율적으로 트랜스제닉 비인간동물을 얻을 수가 있다.

또, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 레규칼신유전자가, 서열표의 서열번호 2기재의 아미노산서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자인 트랜스제닉 비인간동물, 특히, 서열표의 서열번호2기재의 아미노산서열로이루어지는 단백질을 코드하는 유전자가, 서열표의 서열번호 1기재의 DNA서열로 이루어지는 쥐 레규칼신유전자인 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있으나, 레규칼신유전자의 유래로서는, 쥐 외에, 마우스, 소, 돼지, 닭, 개구리, 인간, 개, 토끼 등 특별히 제한되는 것은 아니다.

또, 본 바명의 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 호모체인 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있다. 이와 같은 변이염색체를 호모에 갖는 호모체는, 염색체를 헤테로에 갖는 쥐 등의 비인간동물끼리를 교배하는 것에 의해 얻을 수가 있고, 레규칼신발현량이 헤테로체 보다도 많기 때문에, 실험모델동물로서 특히 적당하다. 또, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물로서, 체중의 증가가 야생형의 비인간동물과 비교하여 의미 있게 억제된, 즉, 체중증가억제능을 갖는 트랜스제닉 비인간동물을 바람직하게 들 수가 있다. 레규칼신유전자가 도입되고, 레규칼신을 과잉발현하는 트랜스제닉 비인간동물이, 이와 같은 체중증가 억제능을 갖는다는 것은 전혀 예상할 수 없었던 것이며, 이 새로운 지견은 레규칼신이 비만방지제로서의 유용성을 갖는 가능성이 있다는 것을 시사하고 있다. 이와 같은 새로운 지견에 의해서, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물은 레규칼신유전자가 도입되고, 레규칼신을 과잉발현하는 것을 특징으로 하는 체중증가 억제능을 갖는 트랜스제닉 비인간동물이라고 할 수도 있다.

또, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물의 바람직한 양태로서, 대뇌기능장해발증성, 인슐린비의존성 당뇨병발증성, 신장성고혈압발증성, 요세관재흡수 장해발증성 등의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 증상이나 질병 중 적어도 하나이상의 증상이나 질병을 발현하는 트랜스제닉 비인간동물을 들 수가 있다. 대뇌기능장해는, 대뇌의 기억유지메카니즘상 필요로 하는 Ca-칼모듈린 의존성 단백질 인산화효소의 활성화를, 과잉발현한 레규칼신이 억제하여, 신경세포내의 신경전달을 제어하는 것에 의해 발증하는 것이라고 생각되며, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물은 기억 등의대뇌기능의 장해(알츠하미머 등의 치매증)의 실험모델 동물으로서 유용하다. 또, 레규칼신은 간장이나 신장에 있어서 발현하고, 호르몬의 세포내 정보전달의 제어를 행하고 있으며, 레규칼신의 과잉발현에 의해, 간장과 신장의 기능을 조절하는 호르몬의 작용발현이 장해가 되어, 간장에 있어서는 인슐린의 작용을 억제하는 것이기 때문에 인슐린 비의존성 당뇨병을 유발하고, 신장에 있어서는 레닌-안디오텐신계에 관련된 신장성고혈압, 또한 전해질대사에 관련된 요세관재흡수장해를 유발하는 것으로 생각되며, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물은, 인슐린 비의존성당뇨병, 신장성고혈압, 요세관재흡수장해 등의 실험모델동물로서 유용하다.

본 발명의 체중증가억제능을 갖는 모델 쥐 등의 모델동물의 수립방법으로서는, 공지의 트랜스제닉동물의 작제방법(예를 들면, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77 :7380-7384, 1980)을 사용한 방법을 들 수가 있다. 예를 들면, 레규칼신(RC)트랜스제닉을 창제하는 방법으로서는, 쥐 간장cDNA라이브러리로부터 레규칼신의 cDNA를 클로닝하고, 레규칼신단백질의 전장을 코드하는 cDNA를 단리한 후, 오픈리딩프레임(Open Reading Frame; 이하, ORF로 한다)을 잘라내고, 발현백터에 도입하여, 이 유전자발현백타를 선형화한 도입유전자를 포함하는 직쇄DNA 단편(fragment)을 쥐 수정난웅성전핵에 현미주사하고, 이 수정난 혹은 2세포기배를 가친 어미쥐의 난관에 이식하여, 새끼쥐를 산생시키고, 그 산생새끼의 조직으로부터 추출한 DNA를 사용하여 PCR법 등에 의해, 레규칼신cDNA가 조입되어 있는 것을 확인하는 방법 등을 들 수가 있다.

본 발명의 레규칼신의 제조방법으로서는, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물,바람직하게는 호모체의 트랜스제닉 비인간동물을 사용하는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 호모체의 레규칼신 트랜스제닉 쥐로부터 간장을 떼어내서, 그 호모디네이트로부터 문헌(Chem. Pharm. Bull. 26, 1915-1918, 1978)기재의 방법에 준하여, 레규칼신을 단리·정제할 수가 있다. 또, 레규칼신의 증수(增收)를 목적으로 하여, 트랜스제닉 비인간동물에 칼슘, 칼시토닌, 인슐린, 에스트로겐 등을 투여할 수도 있다.

본 발명의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법으로서는, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물 또는 상기 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 혹은 세포와 피검물질을 사용하는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 상기 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병으로서는, 대뇌기능장해, 인슐린 비의존성당뇨병, 신장성고혈압, 요세관재흡수장해 등을 예시할 수가 있다. 상기 트랜스제닉 비인간동물과 피검물질을 사용하는 방법으로서는, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 직접 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중증가의 정도나, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 정도를 측정·평가하는 방법과, 피검물질투여후의 트랜스제닉 비인간동물로부터 얻어지는 조직, 기관 또는 세포에 있어서의 레규칼신의 발현제어량의 정도를 측정 ·평가하는 방법과, 조직이나 기관에 있어서의 형태변화를 모노크로날항체에 의한 면역염색법이나 전자현미경에 의해 평가하는 방법 등을 들 수가 있다. 또, 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 방법으로서는, 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 또는 세포를 피검물질의 존재하에서 배양하고, 그 조직, 기관 또는세포의 레큐칼신의 발현억제량의 정도를 측정·평가하는 방법과, 조직이나 기관에 있어서의 형태변화를 모노크로날항체에 의한 면역염색법이나 전자현미경에 의해 평가하는 방법 등을 들 수가 있다.

상기한 바 조직과 기관으로서는 간장, 신장요세관, 심장, 대뇌 등을, 세포로서는 이들 조직과 기관을 구성하는 간세포, 신경세포 등을 구체적으로 들 수가 있다. 또, 이들을 스크리닝할 때에 있어서, 야생형 비인간동물, 특히 한 배(同腹)의 야생형 비인간동물에 있어서의 경우와 비교 ·평가하는 것이, 개체레벨에서 정확한 비교실험을 할 수가 있기 때문에 바람직하다. 이와 같이, 상기 본 발명의 스크리닝방법에 의하면, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병, 예를 들면 대뇌기능장해, 인슐린 비의존성 당뇨병, 신장성고혈압, 요세관재흡수장해 등의 예방 ·치료약을 스크리닝할 수가 있으며, 이와 같은 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 레규칼신 발현저하에 기인한는 질병의 원인물질의 스크리닝방법으로서는, 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물 또는 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 방법이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병으로서는, 동맥경화, 심근경색 등을 예시할 수가 있다. 상기 트랜스제닉 비인간동물과 피검질물질을 사용하는 방법으로서는, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 직접 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중감소의 정도와, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 정도를 측정·평가하는 방법과, 피검물질 투여후의 트랜스제닉 비인간물질로부터 얻어지는조직, 기관 또는 세포에 있어서의 레규칼신의 발현증가량의 정도를 측정·평가하는 방법과, 조직과 기관에 있어서의 형태변화를 모노크로날항체에 의한 면역염색법과 전자현미경에 의해 평가하는 방법 등을 들 수가 있다. 또, 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 방법으로서는, 트랜스제닉 비인간동물 유래의 조직, 기관 또는 세포를 피검물질의 존재하에 배양하고, 그 조직, 기관 또는 세포의 레규칼신의 발현증가량의 정도를 측정 ·평가하는 방법과, 조직과 기관에 있어서의 형태변화를 모노크로날항체에 의한 면역염색법과 전자현미경에 의해 평가하는 방법 등을 들 수가 있다.

상기 조직과 기관으로서는, 간장, 신장요세관, 심장, 대뇌 등을, 세포로서는 이들의 조직과 기관을 구성하는 간세포, 신경세포 등을 구체적으로 들 수가 있다. 또, 이들의 스크리닝시에 있어서, 야생형 비인간동물, 특히 한 배의 야생형 비인간동물에 있어서의 경우와 비교·평가하는 것이, 개체레벨에서 정확한 비교실험을 할 수가 있기 때문에 바람직하다. 이와 같이, 상기 본 발명의 스크리닝방법에 의하면, 레규칼신 과잉저하에 기인하는 질병, 예를 들면 동맥경화, 심근경색 등의원인물질을 스크리닝할 수가 있으며, 이와 같은 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질은, 레규칼신의 생체내에 있어서의 작용·역할을 보다 더 명확하게 하는데 유용하고, 또, 이들의 원인물질에 결합하는 물질 등 그 작용을 저해하는 물질을 스크리닝함으로써, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 예방 ·치료약을 개발할 수가 있는 가능성이 있기 때문에 유용하며, 이와 같은 원인물질도 본 발명의 범주에 포함된다.

다음으로, 본 발명의 뼈병태 모델동물로서는, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물에 있어서, 뼈병태를 나타내는 모델동물이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 이와 같은 뼈병태 모델동물으로서, 레규칼신유전자가 도입된 상술한 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물을 바람직하게 예시할 수가 있다. 따라서, 이하 본 발명의 뼈병태 모델동물과 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법에 대하여 설명하는 바, 보다 상세하게는, 상술한 본 발명의 트랜스제닉 비인간동물에 관한 기재와, 본 발명의 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법 등에 관한 기재를 참조할 수가 있다. 또한 본 발명에 있어서, 뼈병태란, 골다공증으로 대표되는 칼슘 뼈대사이상 등에의해, 골량의 감소, 뼈조직의 취약화, 뼈형태변화, 뼈성장지연 등 뼈와 그 성장이 정상이 아닌 상태를 말한다.

상기 본 발명의 뼈병태 모델동물로서는, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물로부터, 뼈의 형태학적 측정평가, 예를 들면, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 중 어느 하나이상의 측정평가, 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가, 예를 들면, 칼슘량, 알칼리포스파타제활성, 골조직중의 DNA량 중 어느 하나이상의 측정평가에 의해 선발 ·확인된, 골조직의 취약화, 골형태의 변화, 골성장지연 중 어느 하나이상의 뼈병태를 나타내는 뼈병태 모델동물이 바람직하고, 상기 뼈의 형태학적 측정평가에는 동물연구용 pQTC(peripheral Quantitative Computed Tomography)골밀도측정장치(Bone Vol. 29, No. 2, August 2001 ; 101-104)를 특히 유용하게 사용할 수가 있다. 또, 골성분의 생화학적 측정평가는 후술하는 실시예에 기재되어 있는 바와 같은, 이 분야에 있어서의 통상적인 방법에 의해 실시할 수가 있다. 또한, 뼈의 형태학적 측정평가나 골성분의 생화학적 측정평가에는, 대퇴골 등의 뼈자체가 필요한, 시험용동물을 그 대로 뼈병태 모델동물로서 사용할 수 없기 때문에, 상기 선발 ·확인된 뼈병태 모델동물과는 뼈의 형태학적 측정평가나 골성분의 생화학적 측정평가에 제공된 동물과 한 배의 동물 또는 그 자손을 말한다.

본 발명의 뼈병태 모델동물은, 예를 들면, 상기와 같이, 본 발명자가 작제한 쥐 레규칸신 발현백터로부터 잘라내고, 선형화된 DNA단편을 별도로 조정한 수정난 난포세포에 현미주사법으로 주입하고, 난세포를 배양한 후, 발생이 진행되어 이상이 인정되지 않는 배(胚)를 가친의 난관내에 이식하고, 태어난 새끼에 대하여, 특히 동물연구용 pQTC골밀도측정장치에 의한 뼈의 형태학적 측정평가, 및 골성분의 생화학적 측정평가를 실시하는 것에 의해, 선발 ·확인할 수가 있으며, 이들 가운데에서도, 뼈병태의 표현형질이 계대적으로 안정적이며, 상업적 생산에 적합한 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 뼈병태 모델동물로서는, 호모체인 레규칼신 트랜스제닉 뼈병태 모델동물을 바람직하게 예시할 수가 있다. 이와 같은 변이염색체를 호모에 갖는 호모체는 염색체를 헤테로에 갖는 쥐 등의 비인간동물끼리를 교배하는 것에 의해 얻을 수가 있으며, 레규칼신 발현량이 헤테로체보다도 많은 것 때문에, 골변화 등의 뼈병태의 표현형질이 보다 강하게 나타나는 것 때문에 바람직하다. 또한, 본 발명의 뼈병태 모델동물로서는, 레규칼신 유전자가 X염색체상에 있고, 수컷보다도 암컷에 있어서 골변화 등의 뼈병태의 표현형질이 보다 현저하게 나타나기 때문에, 암컷 쥐 등의 암컷의 뼈병태 모델동물을 바람직하게 예시할 수가 있다.

본 발명의 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법으로서는, 상기 본 발명의 뼈병태 모델동물에 피검물질을 투여하고, 상기 뼈병태 모델동물에 있어서의 뼈의 형태학적 측정평가 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가를 실시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝방법이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 피검물질로서는, 공지의 합성화합물, 펩티드, 단백질 등외에 예를 들면, 포유동물의 조직추출물, 세포배양상청 등의 각종 식물의 추출성분 등이 사용된다. 예를 들면, 피검화합물을 본 발명의 뼈병태 모델동물에 경구적 또는 비 경구적으로 투여하고, 상기 뼈병태 모델동물에 있어서의, 예를 들면, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 등의 뼈의 형태학적 측정평가와, 예를 들면, 칼슘량, 알칼리포스타제활성, 골조직중의 DNA량 등의 골성분의 생화학적 측정평가를 실시하는 것에 의해, 골다공증의 뼈병태의 예방 ·치료약을 스크리닝할 수가 있다. 또, 이들의 스크리닝시에 있어서, 야생형 비인간동물, 특히 동복의 야생형 비인간동물에 있어서의 경우와 비교 ·평가하는 것이 고체레벨에서 정확한 비교실험을 할 수가 있기 때문에 바람직하다.

또, 본 발명의 뼈병태의 예방 ·치료약으로서는 상기 본 발명의 스크리닝방법에 의해 얻어지는 뼈병태의 예방 ·치료약이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 이들 예방·치료약을 의약품으로서 사용하는 경우는, 약학적으로 허용되는 통상적인 담체, 결합제, 안정화제, 부형제, 희석제, pH완충제, 붕괴제, 가용화제, 용해보조제, 등장제 등 각종 조제용 배합성분을 첨가할 수가 있다. 이들 예방 ·치료약을 사용하는, 골다공증 등의 뼈병태의 예방 ·치료방법에 있어서는, 환자의 성별 ·체중·증상에 맞는 적절한 투여량의 상기 예방 ·치료약을 경구적 또는 비경구적으로투여할 수가 있다. 즉, 통상적으로 사용되는 투영형태, 예를 들면, 분말, 과립, 캅셀제, 시럽제, 현탁액 등의 제형으로 경구적으로 투여할 수가 있으며, 혹은, 예를 들면, 용액, 유제, 현탁액 등의 제형으로 한 것을 주사형태로 비경구적으로 투여할 수 있는 것 외에, 스프레이제의 형태로 비공내에 투여할 수도 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하는 바, 본 발명의 기술적 범위는 이들의 예시로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> [쥐 RC cDNA조제]

(RNA의 조제)

위스터계 수컷 쥐(생후3주)로부터 간장을 적출하고, 구아니딘-이소티오시아네이트액(4M구아니늄 티오시아네이트, 25mM 구연산나트륨(pH 7.0), 0.5%사르코실, 0.1M 2-메르캅토에탄올, 2M아세트산나트륨)으로 균질화하였다. 이것을 페놀클로로포름-이소아밀알코올혼압액으로 추출하여, 4℃, 10,000 x g에서 20분긴 원심하였다. 물층에 이소프로판올을 가하고, -20℃에서 방치하여, RNA를 침전시켰다. 회수한 침전은 디에틸피로카보네이트처리한 0.5% 드데실황산나트륨에 용해하였다. 이를 올리고(dT)셀로오스칼럼에 통과시켜 폴리(A) + RNA를 정제하였다.

(cDNA 라이브러리 제작)

정제한 폴리(A) + RNA(50㎍)에 50unit의 Moloney-Murine Leukemia 바이러스 역전사효소와 올리고(dT)18 프라이머 링커를 첨가하고, 1개사슬cDNA를 합성하였다. 또한 합성한 1개 사슬cDNA에 대장균 리보뉴클레아제H와 DNA폴리메라아제Ⅰ를 첨가하고, 2개사슬cDNA를 합성하였다. 이것에 EcoRI 어댑터를 부가하고, XhoI, EcoRI로소화한 파지발현백터(λZAPⅡ)와 연결하였다. 다시 팩키징 엑스트랙트(Packaging Extract)를 사용하여 파지에 패키징하여 cDNA라이브러리의 파지를 제작하였다.

(RC cDNA클론의 선발)

쥐 간의 cDNA라이브러리의 파지 약 1 x 10⁶개를 대장균과 혼합하여 20개의 한천평판에 식균하였다. 42℃에서 3시간 반 동안 인큐베이팅한 후, 평판에 10mM이소프로필티오β-D-갈락토시드로 처리한 니트로셀루로오스막을 얹고, 37℃에서 3시간 반동안 인큐베이팅하였다. 니트로셀루로오스막은 브로킹한 후, 항 RC토끼혈청(X200)과 실온에서 2시간 인큐베이팅하였다. 막은 세정한 후, 알칼리포스파타제결합 항 토끼 IgG항체를 가하여 인큐베이팅하였다. 이것을 발색액(0.35mM니트로블루 테트라솔륨, 0.4mM5-브로모-4-클로로-3-인도릴포스페이트)에 침지하여 발색시키고, RC cDNA양성 플라크를 동정(同定)하였다.

(플라스미드백타에로의 서브클로닝)

파지백타λZAPⅡ는, 그 서열중에 플라스미드백타인 pBluescript의 염기서열을 포함하며, λZAPⅡ에 클로닝된 RC의 cDNA단편은 pBluescript에 삽입되어 있다. 또, pBluescript의 양단에는 헬퍼파지의 복제개시점과 종결점이 존재하고 있다. 여기서 상기 동정한 플라크로부터 파지를 단리하고, R408헬퍼파지와 함께 대장균SURE에 감엽시키고, RC의 cDNA단편을 포함하는 pBluescript를 대장균내에서 합성시키고, 헬퍼파지의 형태로 대장균체외로 방출시켰다. 이 파지액을 다시 대장균SURE에 감염시키고, RC의 cDNA단편을 갖는 플라스미드로서 균내에서 복제하였다. 이 대장균을 50㎍/㎖앰피실린함유의 LB평판에 식균하고, 앰피실린내성 콜로니를 선택하였다.

(cDNA인서트의 염기서열의 결정)

Sequenase시스템(US Biochemical 사 제조)을 사용하여 cDNA인서트의 전염기서열을 결정하였다. 즉, 플라스미드DNA를 EcoRⅠ로 절단하고, 단편은 알칼리변성처리한 후, 프라이머를 가하여 어닐링하였다. 이것에 35S dCTP, 0.1M DTT, Sequenase용 효소액을 첨가한 후, 4등분하고, 각각에 ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP를 가하여, 37℃에서 5분간 인큐베이팅하였다. 이들은 아크릴아미드겔 전기영동법으로 분리하고, 오토라디오그래피를 실시하고, 염기서열을 판독하였다. 서열번호1에 레규칼신cDNA의 전염기서열을 나타낸다. 또, 얻어진 아미노산서열도 서열번호2에 나타낸다. 이들로부터 계산되는 레규칼신의 분자량은 33, 388이었다. 이 값은 정제한 레규칼신을 SDS폴리아크릴아미드 전기영동법에 의해 산출한 분자량과 일치하였다.

<실시예 2> [트랜스제닉 쥐의 창제]

(도입유전자의 구축)

실시예1에서 얻어진 쥐 레규칼신전장cDNA를 포함하는 플라스미드, RC-900(glycerol stock ; RC-F), 백터-pBluescript SK(-)로부터, ORF전부를 포함하는 DNA단편을 PstⅠ를 사용하여 잘라내었다(도 1A). 이 잘라낸 PstⅠ플래그멘트를 pBluescriptⅡKS(+)의 PstⅠ사이트에 조입하였다(도 1B). 이어서 EcoRⅠ로 잘라내고, 얻어진 EcoRⅠ플래그멘트(도 2A)를 , 발현백타 pCXN2(클론텍 사 제조)(Gene108, 193-199, 1991)의 EcoRⅠ사이트에 도입하고(도 2B), 쥐 레규칼신발현백타 RC/pCXN2를 조제하였다. 이 RC/pCXN2을 SalⅠ와 SfiⅠ와 MluⅠ로 절단하고, 선형화된 3.6kbp의 플래그멘트를 얻었다(도 3).

(트랜스제닉 쥐의 제작)

쥐의 전핵기수정난(Prenuclear fertilized egg)으로의 상기 선형화된 3.6kbp의 DNA플래그멘트용액의 현미주사는 하기의 요령으로 실시하였다. 생후 4주의 스프래그-도리(SD, Sprague-Dawley)계 암컷 쥐를 명암사이클12시간(명시간 4 : 00∼16: 00), 온도 약 23℃, 습도약 55%로 사육하고, 질스메아법에 의해 암컷의 성주기를 관찰하여 호르몬처리일을 선택하였다. 암컷 쥐에 150IU/kg의 임마(임신말)혈청성 성선자극호르몬(니혼젠야쿠샤 제조 「PMS젠야쿠」)을 복강내에 투여하여 과잉배란처리를 실시하고, 48시간후에 150IU/kg의 인간 태반성 성선자극 호르몬(산쿄엘야쿠힌(주) 제조 「프베로겐」)을 복강내투여한 후, 수컷과의 동거에 의해 교배시키고, 인간태반성 성선자극호르몬 투여 32시간 후에 난관관류에 의해 전핵기 수정난을 채취하였다.

이와 같이 하여 조제한 위스터 쥐의 수정란의 웅성전핵(雄性前核)에, 상기 3.6kbp의 DNA플래그멘트용액(5ng/㎕농도)을 현미주사하였다. DNA 플래그멘트가 주입된 난을, C0₂인큐베이터내에서 m-KRB(m-클레브스링거완충액)배지를 사용하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 2세포에로 발생이 진행하고, 이상이 보이지 않는 2세포기배를 9마리의 가친 어미(정관결찰수컷과 교배시킨 가짜임신암컷 쥐)의 난관내에 1마리당 20∼30개 정도를 이식하고, 29마리의 새끼를 얻었다. 산후 4주까지 생존한 27마리의 새끼쥐의 꼬리로부터 DNA를 채취하고, 채취한 DNA를 프라이머-huRC-1 ; GGAGGCTATGTTGCCACCATTGGA(서열번호 3), 프라이머-huRC-2 ; CCCTCCAAAGCAGCATGAAGTTG(서열번호 4)를 사용하여 PCR법에 의해 검정하였다(도 4). 그 결과, 합계 5마리(수컷 4마리, 암컷 1마리)의 쥐에 도입유전자의 존재를 확인하였다. 그 중 5마리가 차세대에 도입유전자를 전달하였다.

<실시예 3> [체중증가억제능]

실시예 2에서 얻어진 트랜스제닉 쥐(헤테로체)의 계통 가운데, 꼬리조직에 있어서의 레규칼신발현량이 가장 많은 계통끼리를 교배시키는 것에 의해, 트랜스제닉 쥐(호모체)를 얻었다. 또, 호모체인 것은, 쥐 꼬리조직으로부터 추출한 게놈DNA에로의 도입유전자의 조입을 PCR법으로 확인하고, 헤테로체의 cDNA량의 2배이상의 조입량을 검출하는 것에 의해 확인하였다. 이와 같은 호모체의 트랜스제닉 쥐를 사용하여 체중증가억제능에 대하여 조사하였다. 3∼4주나이의 야생형 SD쥐와 트랜스제닉 쥐(호모체) 각각 8마리씩의 체중의 평균치를 표 1에 나타낸다. Student's t test, P<0.01, 평균치 ±표준오차로 나타내여 의미있는 차이가 확인되고, 레규칼신유전자의 과잉발현에 의해, 체중증가가 억제되는 것을 확인할 수가 있었다.

	체 중(g)
야 생 형	88.5 ±3.8
트랜스제닉	69.5 ±2.4*

<실시예 4> [뼈병태 모델동물]

(SD계 호모타입 뼈병태모델 쥐)

실시예 2에서 얻어진 트랜스제닉 쥐(헤테로체)의 계통 가운데, 꼬리조직에 있어서의 레규칼신발현량이 가장 많은 계통끼리를 교배시키는 것에 의해, 트랜스제닉 쥐(호모체)를 얻었다. 또, 호모체인 것은, 쥐 꼬리조직으로부터 추출한 게놈DNA에로의 도입유전자의 조입을 PCR법으로 확인하고, 헤테로체의 cDNA량의 2배이상의 조입량을 검출하는 것에 의해 확인하였다. 외관상 뼈병태를 나타내고 있지 않는 상기 호모체의 트랜스제닉 쥐 가운데에서, 대를 이어 안정적으로 생존하고 있는 암 ·수의 쥐를, 시험구의 SD계 뼈병태모델 쥐(호모체)로서 사용하고, 뼈의 형태학적 측정평가(골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위길이)와 골성분의 생화학적 측정평가(칼슘량, 골아세포·조골세포의 마커효소인 알칼리포스파타제활성, 골조직중의 세포수지표인 DNA량)를 실시하였다. 또, 대조구로서 암 ·수의 SD계 야생형 정상쥐를 사용하였다. 또한, 각 측정평가에 있어서, 시험구나·대조구모두, 쥐는 각 군에 5마리를 사용하고, 각 측정치는 평균치 ±표준오차로 나타내며, 통계적 유의차 검출은 Student's t-test를 사용하여 실시하여, P<0.01(1%)이하를 의미있는 차이 있음으로 하였다.

(뼈의 형태학적 측정평가)

5∼6주나이의 암 ·수의 SD계 뼈병태모델 쥐(시험구) 및 SD계 야생형 정상 쥐(대조구)를 에테르마취하에서 해부하여 대퇴골 조직을 적출한 후, 근육조직을 제거하고, 소정의 측정에 제공할 때까지 70%에탄올용 액중에 완전히 침지하여 보존한것을 표본으로 하였다. 이 표본을 동물연구용 pQTC골밀도측정장치(XCT Reserch SA+ : Stratec Medizintecnik GmbH Pforzhein Germany)를 사용하고, 골간단부에 있어서는 원위골단(성장연골판)으로부터 2.0mm의 부위에서부터 슬라이스폭 0.5mm씩으로 5개소의 스캔을 실시하였다. 또, 뼈길이의 약 1/2위 부위를 골간부로 하고, 1개소의 스캔을 실시하였다. 스캔의 결과를 도 5(시험구 ; 상단 및 중단이 골간단부, 하단좌가 골간부)와 도 6(대조구: 상단 및 중단이 골간단부, 하단좌가 골간부)에 나타낸다. 스캔 후, 각 군의 골간부와 골간단부의 골밀도, 골강도, 골간부조직의 피질뼈두께, 및 골간부조직의 피질골외막의 주위길이가 자동적으로 산출·표시되었다. 결과를 각각 표 2∼5에 나타낸다. 또한, 표 6에 상기 pQTC측정에 있어서의 측정 파라미터와 해석파라미터를 나타낸다.

pQTC측정의 결과, 암 ·수 모두 정상 쥐와 비교하여 뼈병태모델 쥐에서는 골밀도가 감소하고, 특히 암컷에 있어서 현저하였다(표 2). 골강도에 있어서는 수컷의 정상 쥐와 비교하여 암컷의 뼈병태모델 쥐에서는 골강도 감소하고 있었으나, 암컷에 있어서는 골간부, 골간단부 모두 뼈병태모델쥐에서 골강도가 정상 쥐의 약 40∼45%까지 감소하는 것이 명확하게 되었다(표 3). 골간부(피질골)조직의 피질은 암 ·수 모두, 정상 쥐와 비교하여 뼈병태모델 쥐에서 피질골두께가 유의하게 감소하고 있었다(표 4). 골간부(피질골)조직의 피질외막주위 길이는 수컷에 있어서는 2군간에서 유의한 차이는 보이지 않았으나, 암컷에 있어서는 정상쥐와 비교하여 뼈병태모델쥐에서 피질외막주위길이가 유의하게 감소하였다(표 5).

골조직의 골밀도(㎎/㎤)

	골간부(㎎/㎤)	골간단부(㎎/㎤)
수컷	야생형	494.3 ± 12.94	345.8 ± 12.25
수컷	트랜스제닉	425.0 ± 31.28*	304.4 ± 19.69*
암컷	야생형	465.8 ± 15.05	388.0 ± 18.77
암컷	트랜스제닉	215.0 ± 5.38*	274.6 ± 7.82*

골조직의 골강도(㎣)

	골간부(㎣)	골간단부(㎣)
수컷	야생형	2.794 ± 0.127	2.794 ± 0.077
수컷	트랜스제닉	2.368 ± 0.308	2.368 ± 0.394
암컷	야생형	2.446 ± 0.063	2.446 ± 0.102
암컷	트랜스제닉	1.163 ± 0.029*	1.163 ± 0.108*

골간부(피질골)조직의 피질골 두께(㎜)

	골간부(㎣)
수컷	야생형	0.309 ±0.012
수컷	트랜스제닉	0.112 ±0.016*
암컷	야생형	0.337 ±0.012
암컷	트랜스제닉	0.257 ±0.040*

골간부(피질골)조직의 피질골외막 주위길이(㎜)

	골간부(㎣)
수컷	야생형	9.365 ±0.183
수컷	트랜스제닉	9.540 ±0.175
암컷	야생형	9.004 ±0.096
암컷	트랜스제닉	8.761 ±0.234*

측정파라미터 및 측정부위

슬라이스두께	500㎛	레퍼런스위치	SV화상으로부터 대퇴골원단부를 지정
보크셀사이즈	80㎛	측정부위 :골간단부(해면골)	원위골단으로부터 2.0mm에서 0.5mm마다계 5슬라이스
보크셀사이즈	80㎛	측정부위 : 골간부(피질부)	뼈길이의 약 1/2의 부위
측정시간	1검체당 약 7분	(SV스캔 포함)

해석파라미터

CALCBD	CORTBD(SSI)
카운터 모드 :2	필 모드 : 2	코티칼모드: 1
스레시홀드:	---	트라베큘라에리어	---	스레시홀드	690(&464)㎎/㎤
		스레시홀드:	395mg/㎤	인너스레서홀드:

(골성분의 생화학적 측정평가)

5∼6주나이의 암 ·수의 SD계 호모타입뼈병태모델 쥐(시험구) 및 SD계 야생형 정상 쥐(대조구)를 에테르마취하에서 해부하여 대퇴골조직을 적출한 후, 근육조직을 제거하고, 소정의 측정에 제공할 때까지 70%의 에탄올용액중에 완전히 침지하여 보존한 것을 표본으로 하였다. 이 표본으로부터 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)로 나누어, 칼슘량, 골아세포·조골세포의 마커효소인 알칼리포스파타제활성, 골조직중의 세포수 지표인 DNA량을 측정하였다.

골조직중의 칼슘량(㎎/g 골건조중량)의 측정은 골간부(피질골)과 골간단부(해면골)를 각각 640℃에서 24시간 회화(灰化)하여, 중량을 측정하고, 그 후 6N염산에 용해하여 골칼슘량을 원자흡광도로 측정하였다. 골조직중의 칼슘량을 ㎎/g골건조중량으로 나타낸 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7로부터 알 수 있듯이, 암 ·수함께 정상 쥐와 비교하여 뼈병태모델 쥐에서는 골칼슘량이 유의하게 감소하고 있었으나, 특히 암컷에 있어서는 골칼슘량의 감소가 현저하였다.

골조직중의 칼슘량(㎎/g 골건조중량)

	골 간 부(㎎/㎤)	골 간 단 부(㎎/㎤)
수컷	야생형	217.6 ± 4.47	169.1 ± 3.99
수컷	트랜스제닉	192.0 ± 7.89*	142.5 ± 2.46*
암컷	야생형	219.4 ± 3.51	185.4 ± 8.55
암컷	트랜스제닉	174.4 ± 4.69*	137.3 ± 8.54*

골조직중의 알칼리성 포스파타제활성의 측정은, 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)를, 각각 빙냉한 6.5mM팔비탈완충액(pH 7.4)3㎖에 침지시키고, 작은 조각으로 절단하고, 테프론 유봉을 붙힌 Potter-Elvehjem호모게나이저로 균질하게 하고, 초음파장치로 60초간에 걸쳐 파괴하였다. 600rpm에서 5분간 원심분리하고, 얻어진 상청(上淸)을 효소활성의 측정에 사용하였다. 알칼리성 포스파타제활성은 Walter와 Schutt의 방법(Bergmeyer HU(ed) Methods of enzymatic analysis, Vol.1-2, Academic Press, New York, PP. 856-860, 1965)에 준하여 측정하였다. 또, 단백질의 농도는 Lowry등의 방법(J. Biol. Chem., 193, 265-273, 1951)에 준하여 측정하였다. 골조직중의 알칼리성 포스파타제활성을 유리시킨 p-니트로페놀의 μmol/min/mg단백질로서 나타낸 결과를 표 8에 나타낸다. 표 8로부터, 정상 쥐와 비교하여 뼈병태모델쥐에서는 골간부(피질막)에 있어서는 숫컷에서 알칼리성 포스파타제활성이 유의하게 상승하고 있으며, 또 골간단부(해면골)에 있어서는 암컷에서 알칼리성 포스포타제활성이 유의하게 상승하고 있었다.

골조직중 알칼리성 포스파타제활성(μmol/분/㎎단백질)

	골 간 부	골 간 단 부
수컷	야생형	1.467 ± 0.072	1.246 ± 0.038
수컷	트랜스제닉	1.104 ± 0.093*	1.204 ± 0.038
암컷	야생형	1.192 ± 0.076	1.355 ± 0.029
암컷	트랜스제닉	1.067 ± 0.095	1.107 ± 0.011*

골조직중의 DNA량의 측정은, 골간부(피질골)와 골간단부(해면골)를 각각 빙냉한 6.5mM팔비탈완충액(pH7.4)3㎖에 침지시키고, 작은 조각으로 절단한 후, 빙냉한 0.1N수산화나트륨 용액 4.0㎖에서 24시간 진동/혼합시켰다. 알칼리추출후, 10,000rpm에서 5분간 원심분리하고, 얻어진 상청을 DNA량의 측정에 사용하였다. DNA량은 Ceriotti의 방법(J. Biol. Chem., 214, 39-77, 1955)에 준하여 측정하였다. 골조직중의 DNA량을 mg/g 골조직습중량으로서 나타낸 결과를 표 9에 나타낸다. 표 9로부터, 정상 쥐와 비교하여 뼈병태모델쥐에서는 골간부(피질골)에 있어서는 암컷에서 DNA량이 유의하게 감소하고 있으며, 또 골간단부(해면골)에 있어서는 암 ·수 함께 DNA량이 유의하게 감소하고 있었다.

골조직중의 DNA량(㎎/g골조직습중량)

	골간부(㎎/㎤)	골간단부(㎎/㎤)
수컷	야생형	2.55 ± 0.13	4.64 ± 0.29
수컷	트랜스제닉	2.99 ± 0.24	3.19 ± 0.22*
암컷	야생형	2.40 ± 0.31	4.39 ± 0.40
암컷	트랜스제닉	1.26 ± 20.18*	2.37 ± 0.38*

이상과 같이 본 발명의 뼈병태 모델동물에 있어서는, 대퇴골조직의 명백한골변화가 발견되며, 이 골변화는, 대퇴골의 골간부(피질골)과 골간단부(해면골)의 양부분에 있어서, 형태학적 및 생화학적(골성분)으로 인정되며, 골조직이 골흡수(골염용해)를 일으켜서, 뼈형성도 장해가 되고 있는 것에 의거하는 것이 명백하게 되었다. 특히, 수컷(male)보다도 암컷(female)에 있어서, 그 골변화는 현저하였다. 또, 본 발명의 뼈병태 모델동물에 있어서는 뼈병태의 발현형질이 대를 이어 안정적이라는 것도 확인되고 있다.

본 발명의 레규칼신 트랜스제닉 비인간동물, 특히 레규칼신 트랜스제닉 쥐는, 간장해, 신장해, 당뇨병, 심근경색, 고혈압, 알츠하이머 등의 Ca²⁺시그널링이 관여하는 성인병, 생활습관병, 노인병 등의 병태평가용 실험모델 동물로서 유용하다. 또, 레규칼신은 세포내 Ca²⁺시그널링에 관련한 세포기능을 조절하고 있으며, 본 발명의 레규칼신 트랜스제닉 비인간동물은 이와 같은 레규칼신을 과잉발현하기 때문에, 장기의 특이적인 병태(간암, 심근경색, 대뇌치매증)의 수복·개선을 위한 유전자치료약 개발을 위한 모델동물로서 유용한 수단이 될 수 있다. 또 본 발명의 뼈병태 모델동물은, 골다공증 등의 골질환치료를 위한 병태모델동물로서, 뼈병태 메커니즘의 해명과 신약의 개발을 목적으로 한 전(前)임상시험 등에 유리하게 사용할 수가 있다.

<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Regucalcin gene-transferred non-human animals <130> YG2002-18PCT <150> JP P2001-287698 <151> 2001-09-20 <150> JP P2002-177666 <151> 2002-06-18 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 900 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(897) <400> 1 atg tct tcc atc aag att gaa tgt gtt tta agg gag aac tac agg tgt 48 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 1 5 10 15 ggg gag tcc cct gtg tgg gag gag gca tca aag tgt ctg ctg ttt gta 96 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 gac atc cct tca aag act gtc tgc cga tgg gat tcg atc agc aat cga 144 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 gtg cag cga gtt ggt gta gat gcc cca gtc agt tca gtg gca ctt cga 192 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 cag tca gga ggc tat gtt gcc acc att gga acc aag ttc tgt gct ttg 240 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 aac tgg gaa gat caa tca gta ttt atc cta gcc atg gtg gat gaa gat 288 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 aag aaa aac aat cga ttc aat gat ggg aag gtg gat cct gct ggg aga 336 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 tac ttt gct ggt acc atg gct gag gaa acc gcc cca gct gtt ctg gag 384 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 cgg cac caa ggg tcc ttg tac tcc ctt ttt cct gat cac agt gtg aag 432 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 aaa tac ttt aac caa gtg gat atc tcc aat ggt ttg gat tgg tcc ctg 480 Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 gac cat aaa atc ttc tac tac att gac agc ctg tcc tac act gtg gat 528 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 gcc ttt gac tat gac ctg cca aca gga cag att tcc aac cgc agg act 576 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 gtt tac aag atg gaa aaa gat gaa caa atc cca gat gga atg tgc att 624 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 gat gtt gag ggg aag ctt tgg gtg gcc tgt tac aat gga gga aga gta 672 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 att cgc cta gat cct gag aca ggg aaa aga ctg caa act gtg aag ttg 720 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 cct gtt gat aaa aca act tca tgc tgc ttt gga ggg aag gat tac tct 768 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 gaa atg tac gtg aca tgt gcc agg gat ggg atg agc gcc gaa ggt ctt 816 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 ttg agg cag cct gat gct ggt aac att ttc aag ata aca ggt ctt ggg 864 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 gtc aaa gga att gct cca tat tcc tat gca ggg taa 900 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295 <210> 2 <211> 299 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Arg Glu Asn Tyr Arg Cys 1 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Ala Ser Lys Cys Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ser Lys Thr Val Cys Arg Trp Asp Ser Ile Ser Asn Arg 35 40 45 Val Gln Arg Val Gly Val Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Glu Asp Gln Ser Val Phe Ile Leu Ala Met Val Asp Glu Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ser Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His Ser Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asn Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Pro Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Val Tyr Lys Met Glu Lys Asp Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Val Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asp Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Ser Ala Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Asp Ala Gly Asn Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Senquence : Primer huRC-1 <400> 3 ggaggctatg ttgccaccat tgga 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequnce : Primer huRC-2 <400> 4 ccctccaaag cagcatgaag ttg 23

Claims

레규칼신유전자가 도입되어, 레규칼신을 과잉발현하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항에 있어서, 사이토메가로바이러스-ⅠE인핸서, 치킨β-액틴프로모터, 레규칼신유전자, 토끼β-글로빈폴리A시그널의 순서로 서열된 직쇄 DNA가 도입된 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 레규칼신유전자가, 서열표의 서열번호2기재의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제3항에 있어서, 서열표의 서열번호2기재의 아미노산서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 유전자가, 서열표의 서열번호1기재의 DNA서열로 이루어지는 쥐 레규칼신유전자인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물,
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 호모체인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 체중증가 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대뇌기능장해 발증성인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 비의존성 당뇨병발증성인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 신성(腎性)고혈압 발증성인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 요세관 재흡수장해발증성인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간동물이 쥐인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간동물.
청구항1 내지 11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신의 제조방법.
청구항1∼11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물 또는 상기 트랜스제닉 비인간동물유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제13항에 있어서, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중증가의 정도를 측정 ·평가하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병이, 대뇌기능장해인 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병이, 인슐린 비의존성 당뇨병인 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 레귤칸신 과잉발현에 기인하는 질병이, 신성고혈압인 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방·치료약의 스크리닝방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병은, 요세관 재흡수장해인 것을 특징으로 하는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약의 스크리닝 방법.
청구항13 내지 18항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 과잉발현에 기인하는 질병의 예방 ·치료약.
청구항1 내지 11항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간동물 또는 상기 트랜스제닉 비인간동물유래의 조직, 기관 또는 세포와 피검물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법.
제20항에 있어서, 트랜스제닉 비인간동물에 피검물질을 투여하고, 상기 트랜스제닉 비인간동물에 있어서의 체중감소의 정도를 측정 ·평가하는 것을 특징으로 하는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법.
제20항에 있어서, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병이, 동맥경화심근경색인 것을 특징으로 하는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법.
제20항 또는 제21항에 있어서, 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병이, 심근경색인 것을 특징으로 하는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질의 스크리닝방법.
청구항22 내지 23항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝방법에 의해 얻어지는 레규칼신 발현저하에 기인하는 질병의 원인물질.
레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물에 있어서, 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제25항에 있어서, 골조직의 취약화, 골형태의 변화, 골성장지연 중 어느 하나이상의 뼈병태를 나타내는 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제25항 또는 제26항에 있어서, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물로부터, 뼈의 형태학적 측정평가 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가에 의해 선발 ·확인된 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제27항에 있어서, 뼈의 형태학적 측정평가가, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제27항에 있어서, 골성분의 생화학적 측정평가가 칼슘량, 알칼리포스파타제활성, 골조직 중의 DNA량 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
청구항25 내지 29항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈병태의 표현형질이 계대적으로 안정되어 있는 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 레규칼신 유전자가 도입된 트랜스제닉 비인간동물인 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이 호모체인 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 암컷의 비인간동물인 것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 레규칼신을 과잉발현하는 비인간동물이, 쥐인것을 특징으로 하는 뼈병태 모델동물.
청구항25 내지 34항중 어느 한 항에 기재된 뼈병태 모델동물에 피검물질을 투여하고, 상기 뼈병태 모델동물에 있어서의 뼈의 형태학적 측정평가 및/또는 골성분의 생화학적 측정평가를 실시하는 것을 특징으로 하는 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제35항에 있어서, 뼈의 형태학적 측정평가가, 골밀도, 골강도, 골간부피질골두께, 피질골주위 길이 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
제35항에 있어서, 골성분의 생화학적 측정평가가 칼슘량, 알칼리포스포타제활성, 골조직중의 DNA량 중 어느 하나이상의 측정평가인 것을 특징으로 하는 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
청구항35항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 뼈병태가 골다공증인 것을 특징으로 하는 뼈병태의 예방 ·치료약의 스크리닝방법.
청구항35항 내지 38항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어지는 뼈병태의 예방·치료약.