JPH0797399A - 新規ポリペプチド及びヒト老化マーカータンパクｓｍｐ３０測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトの老化関連タンパクＨ−ＳＭＰ３０の単
離確立、更にその結合タンパクの確立、そしてこれを用
いる免疫学的測定手段を提供すること並びにＨ−ＳＭＰ
３０をコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを検出するための
手段を提供すること。 【構成】 配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ領域を含む、クローン化ＤＮＡ、請求項１記載のポ
リペプチド又はその部分を抗原とする抗体又はその抗原
結合性フラグメントを含む、ヒト老化マーカータンパク
ＳＭＰ３０測定用試薬及び配列表の配列番号１に示され
る塩基配列の一部又はそれと相補的な塩基配列を有する
一本鎖核酸断片を含む、ヒト老化マーカータンパクＳＭ
Ｐ３０コード遺伝子検出用プローブを提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトの臓器、組織、血
液、尿、髄液に存在するヒト老化マーカータンパク（以
下、Ｈ−ＳＭＰ３０という）に関する。更に本発明はそ
の抗体及び測定試薬に関する。本測定は肝細胞障害のモ
ニタリングとして利用することや腎尿細管の破壊のモニ
ターに使用される。更に新生児の肝臓および腎臓の発達
の程度を観察することができる。また、この測定により
対年齢の老化率の観察を行い健康状態のモニターとして
使用される。

【０００２】

【従来の技術】ラット肝臓ＳＭＰ３０は老化因子として
アンドロゲン非依存的に加令と共にその値が低下し、そ
の週令と相関することが本発明者らの１人により明らか
にされた（Biochimica Biophysica Acta 1116:297-305
(1992) ）。ヒトのＳＭＰ３０については確立されてお
らず、その測定も不可能であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】Ｈ−ＳＭＰ３０は、肝
障害や腎障害で血中濃度が増大する。従って、血中のＨ
−ＳＭＰ３０を測定することにより、肝細胞障害のモニ
タリングとして利用することや腎尿細管の破壊のモニタ
ーに使用される。また、これを測定することにより、新
生児の肝臓及び腎臓の発達の程度を観察することができ
る。また、Ｈ−ＳＭＰ３０は老化するほどその濃度が下
がるので、これを測定することにより対年齢の老化率の
観察を行い、健康状態をモニターすることもできる。

【０００４】本発明の目的はヒトの老化関連タンパクＨ
−ＳＭＰ３０の単離確立、更にその結合タンパクの確
立、そしてこれを用いる免疫学的測定手段を提供するこ
とである。さらにまた、本発明の目的は、Ｈ−ＳＭＰ３
０をコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを検出するための手
段を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、Ｈ−ＳＭＰ３０の単離に成功し、これをコード
するＤＮＡのクローン化に成功し、かつ該ＤＮＡの塩基
配列の決定及びそれに基づくＨ−ＳＭＰ３０のアミノ酸
配列の決定に成功した。さらにＨ−ＳＭＰ３０に対する
抗体を多数作製した。そしてこれらの抗体を使用して組
織中のＨ−ＳＭＰ３０の存在を確認するに至った。さら
にこれらの抗体を組み合わせることにより免疫測定法を
確立し、血液中のＨ−ＳＭＰ３０を測定することを初め
て見いだした。

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号２
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供す
る。また、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ領域を含む、クローン化ＤＮＡを提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のポリペプチド又は
その部分を抗原とする抗体又はその抗原結合性フラグメ
ントを含む、ヒト老化マーカータンパクＳＭＰ３０測定
用試薬を提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番
号１に示される塩基配列の一部又はそれと相補的な塩基
配列を有する一本鎖核酸断片を含む、ヒト老化マーカー
タンパクＳＭＰ３０コード遺伝子検出用プローブを提供
する。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】本発明のポリペプチドであるＨ−ＳＭＰ３
０はヒトの肝臓に多く存在しそのＤＮＡのアミノ酸配列
は配列表の配列番号２で示される通りである。

【０００９】その単離する方法は概略以下の通りであ
る。

【００１０】ヒト肝臓をホモジェナイズし、遠心する。
この上清を５０−７０％硫安で塩析しタンパクを沈澱さ
せる。遠心して沈澱したタンパクを回収しこれを再溶解
させ分画等電点電気泳動する。ｐＩ＝４．９の分画を回
収し透析後、ゲル濾過して分子量３０ｋＤａの目的のＨ
−ＳＭＰ３０を得る。なお、単離方法の詳細は下記実施
例に記載されている。

【００１１】更に大量に得る方法としてこのＨ−ＳＭＰ
３０のｃＤＮＡのクローニングを行い、プラスミドベク
ターに組み込み培養により大量にＨ−ＳＭＰ３０を得
た。

【００１２】そのクローニングは次のように行うことが
できる。肝組織中よりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴセル
ロースカラムによりＰｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡとする。こ
のＰｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡよりＤＮＡを合成し、ＰＣＲ
法により増幅する。これを制限酵素λZapII で切断した
ｃＤＮＡライブラリーを得る。更にＴ４リガーゼで処理
し、EcoRI-Not Ｉアダプターにリゲートする。過剰のア
ダプターをゲル濾過で除去し、λZapII ベクターにリゲ
ートする。

【００１３】次にＨ−ＳＭＰ３０のｃＤＮＡフラグメン
トを得るため、既に単離したＨ−ＳＭＰ３０の一部のア
ミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプリマーを合成す
る。ＤＮＡ増幅キットによりＰＣＲ法で増幅し、得られ
たＤＮＡは電気泳動で精製し回収する。この回収ＤＮＡ
をプラスミドのＳｍａＩ部位にインサートする。このよ
うにして得られたプロダクトのＤＮＡ配列を確認し、ス
クリーニングのプローブとして使用する。さきに作製し
たλZapII のプラークをこのプローブでスクリーニング
する。これで陽性と確認された、プラスミドを E coli
XL1-BLUEで増幅する。これによりＨ−ＳＭＰ３０をコー
ドするＤＮＡを含むプラスミドを得る。これを数種類の
制限酵素で切断し配列を分析する。このデータを基にコ
ンピューター解析し全核酸配列およびアミノ酸配列を決
定する。

【００１４】上述のように、本発明は、上記本発明のポ
リペプチド又はその部分を抗原とする抗体又はその抗原
結合性フラグメント（Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａ
ｂ’）₂ フラグメント等）を含むＨ−ＳＭＰ３０測定用
試薬を提供する。この抗体は、下記に詳細に説明するよ
うに、上記本発明のポリペプチドを免疫原として用いる
常法により得ることができる。また、このポリペプチド
の一部分を抗原として利用することもできる。この場
合、このような部分ポリペプチドを合成するには固相合
成法を採用することができる。例えば、まずp-ヒドロキ
シルベンシル樹脂にLEU を結合させ、順次Ｃ末端より保
護アミノ酸を反応させ合成していくものである。最終的
には保護基及びＣ末端を樹脂から除去しイオン交換クロ
マトグラフィーにより精製することにより得ることがで
きる（詳しくは「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善
（株）、１９８５年）参照）。また自動合成装置により
製造することもできる（「続生化学実験講座２タンパク
質下」（東京化学同人、１９８７年）参照）。本発明を
実施するにあたっては、前記方法により製造されたペプ
チドは、免疫活性を高めるためや高分子タンパクに結合
させるために必要に応じて修飾剤、例えば無水酢酸、チ
オグリコール酸で、アセチル化、アルキル化、チオール
化など化学的修飾したものを使用することもできる。

【００１５】免疫原としては高分子タンパク、例えば、
ヘモシアニン、アルブミン、ＩｇＧなどに結合させたも
のを用いることができる。その結合法は一般的に水溶液
中で行なわれるのが通例であり本発明においてもこの方
法を利用することができる（これについては例えば「酵
素免疫測定法」（タンパク質核酸酵素増補版、共立出
版、１９８８）参照））。一般的には水溶性カルボジイ
ミドやベンゾキノン、グルタールアルデヒドなどを縮合
剤としてｐＨ５．０〜１０．０で蛋白濃度０．５〜５．
０ｍｇ／ｍｌで縮合剤を０．０１〜５．０ｍｇ／ｍｌを
加え室温から３７℃で反応させ１〜４時間後にセファデ
ックスＧ−５０カラムで脱塩する。これにより免疫原を
得ることができる。

【００１６】抗体の製造方法としては、前記方法により
精製された免疫原を例えば、ウサギ、山羊、馬、モルモ
ット、ニワトリなどの温血動物に体重１ｋｇあたり０．
３〜２ｍｇを１〜数回背中皮下、フットパット、大腿筋
などにアジュバントとともに注射し、得られた血清は必
要に応じて精製し、当該抗体を得ることができる。逆受
身凝集反応や二抗体沈降ＲＩＡ法、二抗体ＥＬＩＳＡ競
争反応法などを本方法により実施するにあたっては、血
清を精製せずにそのまま希釈して用いることもできる。

【００１７】また、モノクローナル抗体を取得する方法
は、既に多くの成書に開示されている（例えば、「モノ
クローナル抗体とがん」、（株）サイエンスフォーラム
社、１９８５参照）。一般的には、Ｈ−ＳＭＰ３０又は
その部分をアジュバントと共に注射し、抗体価が高くな
った状態で脾臓を摘出し、その脾細胞をポリエチレング
リコールによりマウスミエローマ細胞と融合させ、その
細胞より当該抗体を産生するクローンをモノクローン細
胞として増殖させ、マウス腹腔中あるいは培養液中で大
量細胞培養することにより、製造することができる。

【００１８】このようにして得られた抗体又はその抗原
結合性フラグメントを使用して組織中に存在するＨ−Ｓ
ＭＰ３０を確認することができる。すなわち、オートプ
シーされた組織をスライドに固定した後、この抗体を反
応させ更に例えばパーオキシダーゼ等で標識した抗Ｉｇ
Ｇ抗体を反応させる。そして基質液を反応させることに
よりこのＨ−ＳＭＰ３０の存在部位を染色することがで
きる。

【００１９】また、前記した抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントは、そのままで、あるいは酵素標識、放射標
識、蛍光標識等を結合してＨ−ＳＭＰ３０測定用試薬と
することができる。あるいは該抗体又はその抗原結合性
フラグメントをウェルやビーズ等に固相化したものもＨ
−ＳＭＰ３０測定用試薬として用いることができる。こ
れらの使用態様、すなわち、これらを用いる免疫測定方
法はこの分野において周知であり、いずれの免疫測定方
法に用いられるものであってもよい。すなわち、このよ
うな免疫測定法として、放射免疫測定法、酵素免疫測定
法、免疫比濁法、凝集免疫法等を挙げることができ、こ
れらのいづれの方法を採用してもＨ−ＳＭＰ３０の定量
を充分行なうことができる。本発明で測定されるＨ−Ｓ
ＭＰ３０は分子量３０ｋｄであり、標識を用いる免疫測
定法ではサンドイッチ法により定量することが好まし
い。この方法は、マイクロタイタープレートやポリスチ
レンビーズに本発明で得られた抗体を０．００１〜０．
１ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃一夜放置し固定化し、生理食
塩水溶液で洗浄し、２％ＢＳＡ溶液でポストコートし、
固定化抗体を得るものである。

【００２０】本発明の試薬を用いる酵素免疫測定法で
は、該固定化抗体とは異なる抗原決定基を認識する抗体
と酵素を化学的に結合させた酵素標識抗体とＨ−ＳＭＰ
３０を含む検体とを反応させ、同時にあるいは１０分〜
３時間後に該固定化固相を反応させることができる。実
施の際の反応温度は４℃〜４０℃であり、好ましくは２
５〜３８℃である。洗浄後、固相に結合した酵素の量を
酵素基質を加え活性測定することにより検体のＨ−ＳＭ
Ｐ３０を定量することができる。本方法において用いる
ことのできる酵素は、パーオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼなどである。この際基質は、用いる酵素に適した
ものを用いることは言うまでもない。例えば、ABTS、ル
ミノール−H₂O₂（パーオキシダーゼ用）、3-(2'-ピロト
リシクロ[3,3,1,1^3,7]デカン)-4-メトキシ-4-(3"- ホス
フォリルオキシ）フェニル-1,2- ジオキセタン二ナトリ
ウム塩（ＡＭＰＰＤ）、p-ニトロフェニルホスフェー
ト、メチルウンベリフェリルホスフェート（アルカリホ
スファターゼ用）、p-ニトロフェニル−β-D−ガラクト
ース、メチルウンベリフェリルー β-D- ガラクトース、
3-(2'-スピロアダマンタン)-4-(3−β-D−ガラクトピラ
ノシル）フェニル-1,2−ジオキセタン（ＡＭＧＰＤ）
（βー ガラクトシダーゼ用）などを挙げることができ
る。酵素反応させ、測定は４℃から４０℃で加温しなが
らレート法あるいは１分〜１８時間反応させ、生じた発
色、蛍光あるいは、発光の測定により行なうことができ
る。本方法における抗体の組合せは固相に抗Ｈ−ＳＭＰ
３０抗体を結合させ、標識抗体にポリクローナル抗体も
しくはモノクローナル抗体を使用する。

【００２１】放射免疫測定法の場合には、上記酵素標識
のかわりに ¹²⁵Ｉなどの放射性同位元素を標識し、行な
うものである。本方法の実施の際の測定操作は前記酵素
免疫測定法の場合と全く同じである。一般的には１／４
インチのポリスチレンビーズや直径１ｃｍのポリスチレ
ンチューブ、あるいは０．２〜１０μｍのフェライト粒
子に得られた特異的な抗体を結合させた固相を調製し、
使用することができる。例えばカルボキシメチル化され
た固相の場合、０．１〜１ｍｇの抗体溶液（ｐＨ３．５
〜７）に水溶性カルボジイミドを加え１〜５時間反応さ
せることより調製される。また抗体の放射標識は既に市
販されているボルトンハンター試薬により容易に調製す
ることができる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム
水溶液に溶かした抗体溶液にこのボルトンハンター試薬
を加え１〜２時間後にＧ−２５の脱塩カラム等を用いて
未反応のボルトンハンター試薬を除去するのみで調製す
ることができる。この他、クロラミンＴ法やヨードジェ
ン法などを採用することにより容易に ¹²⁵Ｉの放射標識
を行なうことができる。免疫反応を行なうにあたっては
先に述べた抗体固定固相にサンプルを加え、４℃〜４０
℃好ましくは２０〜３８℃で１〜１８時間反応させるも
のである。この後、生理食塩水あるいは蒸留水で洗浄を
行い、放射標識抗体をこの固相に加え、４℃〜４０℃好
ましくは２０〜３８℃で１〜１８時間反応させ、生理食
塩水あるいは蒸留水で洗浄を行い、その放射能活性を計
測するものである。測定にはシンチレーションカウンタ
ーを使用するものである。

【００２２】また、本発明のＨ−ＳＭＰ３０測定用試薬
は、イソルミノールやアクリジンエステルなどをラベル
した化学発光測定法、フルオレッセインやローダミンを
ラベルした蛍光免疫測定法に用いられるものであっても
よい。この際、ラベル体の標識は活性化エステル法やイ
ソチアネート法を採用することにより容易に行なうこと
ができる（「酵素免疫測定法」（医学書院、１９８７
年）参照）。

【００２３】また、本発明のＨ−ＳＭＰ３０測定用試薬
は、凝集免疫法に用いられるものであってもよい。すな
わち、抗Ｈ−ＳＭＰ３０抗体を血球や人工粒子（例えば
ラテックス、ゼラチン粒子）に結合させ、検体の抗原と
反応させ、生じた凝集像によりそのその濃度を判定する
ものである。血球や粒子への抗体の結合はタンニン酸処
理法やグルタールアルデヒド法により行なうことができ
る（「免疫学実験入門」（学会出版センター、１９８１
年）参照）。その反応は室温で１〜５時間放置すること
により行い生じた血球や粒子の凝集像をパターンアナラ
イザーや目視で判定することができる。

【００２４】更に、免疫比濁法用の試薬であってもよ
く、この場合には、前述の凝集免疫法で示した凝集を光
学的散乱により測定するものである。例えば、波長を５
５０ｎｍにセットした分光光度計に抗体感作粒子と高分
子化ペプチド抗原とサンプルを混和し直ちにその吸光度
変化を測定することにより行なうことができる。

【００２５】上記免疫測定に供される検体としては、ヒ
トの臓器、組織、血液、尿及び髄液等を挙げることがで
きるがこれらに限定されるものではない。

【００２６】本発明はさらに、配列表の配列番号１に示
される塩基配列の一部又はそれと相補的な塩基配列を有
する一本鎖核酸断片を含む、Ｈ−ＳＭＰ３０コード遺伝
子検出用プローブを提供する。プローブに含まれるヌク
レオチド数は特に限定されないが通常１０〜３０程度、
特に１５〜２５程度が好ましいがこれより長いものであ
ってもよい。プローブは放射標識、蛍光標識等で標識さ
れたものであり、その使用方法はこの分野において周知
である。

【００２７】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２８】実施例１ ヒト肝臓１００ｇを１０００ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ／１ｍＭＤＴＴ，１ｍＭフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭＮａＦ溶
液（ｐＨ＝８．０）でホモジェナイズし、６０分間遠心
(35000xg) した。この上清を５０−７０％硫安で塩析し
タンパクを沈澱させた。２０分間遠心(35000xg) して沈
澱したタンパクを回収し、これを前述の抽出液１００ｍ
ｌで再溶解させ同液で３回透析した。この液をシューク
ロース濃度勾配等電点電気泳動し、ｐＩ＝４．９（４．
５−５．５）の分画を回収し透析した。さらに濃縮し、
セファデックスＧ−７５（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１mM Ｄ
ＴＴ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）でゲル濾
過して分子量３０ｋＤａの目的のＨ−ＳＭＰ３０を１．
０ｍｇ得た。なお、このようにして精製された物質が、
Ｈ−ＳＭＰ３０であることは抗ラットＳＭＰ−３０ウサ
ギ抗体の交叉性を利用したウェスタンブロット法で分子
量３０ｋｄのバンドにより確認した。

【００２９】実施例２ Ｈ−ＳＭＰ３０のｃＤＮＡのク
ローニング Ｈ−ＳＭＰ３０のｃＤＮＡのクローニングを行い、プラ
スミドベクターに組み込み培養により大量にＨ−ＳＭＰ
３０を得た。これは次のように行った。

【００３０】肝組織中よりＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴ
セルロースカラム（ファルマシア社）によりＰｏｌｙ
（Ａ）⁺ ＲＮＡとした。このＰｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡよ
りＤＮＡを合成し、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法
に用いたプライマーの配列は、5'-GGGAGGCCCCTTTTTTTTT
TTT-3'及び5'-AAGGAATTCCCCCCCCCCCCC-3' であった。こ
れを制限酵素λZapII で切断したｃＤＮＡライブラリー
を得る。更にＴ４リガーゼで処理し、EcoRI-NotIアダプ
ター（Invitrogene 社）にリゲートした。過剰のアダプ
ターをゲル濾過で除去し、λZapII ベクター（Stratege
n 社）にリゲートした。

【００３１】次にＨ−ＳＭＰ３０のｃＤＮＡフラグメン
トを得るため、既に単離したＨ−ＳＭＰ３０の一部のア
ミノ酸配列よりオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た。合成したプライマーの配列は、5'-AGGCTATGTTGCCAC
CATTGGAA-3' 及び5'-TTCCTCAGCCATGGTACCAGCAAA-3'であ
った。これらのプライマーを用い、先に作製したｃＤＮ
Ａライブラリーを用い鋳型にして、ＤＮＡ増幅キットに
よりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡは電気泳動で精
製し回収した。この回収ＤＮＡをプラスミドのＳｍａＩ
部位にインサートした。

【００３２】このようにして得られたプロダクトのＤＮ
Ａ配列を確認し、スクリーニングのプローブとして使用
するため³²Ｐで標識した。さきに作製したλZapII のバ
クテリオファージのプラーク（１ｘ１０⁵ ）をこのプロ
ーブでスクリーニングする。このプラークをHybond-Nで
固定しプレハイブリダイゼーション後この³²Ｐで標識し
たプローブでハイブリダイゼーションした。オートラジ
オグラフィーはＸ線フィルムに感光させて行った。これ
で陽性と確認された、プラスミドを E coli XL1-BLUEで
増幅した。これによりＨ−ＳＭＰ３０をコードするＤＮ
Ａを含むプラスミドを得た。これを数種類の制限酵素で
切断し配列を分析した。このデータを基にコンピュータ
ー解析し全核酸配列およびアミノ酸配列を決定した。結
果を配列表の配列番号１に示す。なお、配列番号１中に
示されるアミノ酸配列のみを取り出して示したものが配
列番号２である。

【００３３】実施例３ 抗ヒトＳＭＰ３０特異ウサギ抗体の調製 実施例１で調製したＨ−ＳＭＰ３０１ｍｇを含む１ｍｌ
のＰＢＳを１ｍｌのフロイント完全アジュバントと混合
し、ウサギ背皮下に各々注射した。次に３週間後、上記
結合物を同様に注射した。更に４週間後に再度同量の免
疫原を注射し、その１カ月後に同量の免疫原を背皮に注
射した。最後の注射の１週間後に全採血し、抗血清を得
た。この抗血清を５０−７０％硫安で塩析しタンパクを
沈澱させた。２０分間遠心(10000xg) して沈澱したタン
パクを回収し、これを前述のＰＢＳ，ｐＨ７．０で再溶
解させ同液で３回透析した。この液を、スーパーロース
１２で（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．０）でゲル濾過して分子量
１６０ｋＤａのＩｇＧフラクションを得た。

【００３４】実施例４ 抗体とパーオキシダーゼとの結合物の調製 ホースラディシュパーオキシダーゼ（以下ＰＯＤと記
す、ベーリンガー社）５ｍｇを５０ｍＭ炭酸水素ナトリ
ウム水溶液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶かし、ＧＭＢＳ５
ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液１００μｌを混和
した。室温２時間撹拌後、予め実施例３で作製した抗ヒ
トＳＭＰ３０特異ウサギ抗体のＦ（ａｂ’）₂ を０．１
Ｍの２メルカプトエチルアミンで還元し脱塩したＦａｂ
２ｍｇを添加し３時間室温に放置した。この反応液を予
めＰＢＳで平衡化したセファクリルＡｃＡ３４カラムに
チャージし、溶出しＰＯＤと抗体の結合物１ｍｇを得
た。

【００３５】実施例５ ＥＬＩＳＡ法によるＨ−ＳＭＰ３０の測定 実施例３で得られた抗ヒトＳＭＰ３０ＩｇＧ抗体のＰＢ
Ｓ溶液（１０μｇ／ｍｌ）を９６穴のマイクロプレート
（ヌンク社製）に５０μｌ／ウエルずつ分注し、４℃で
一夜放置した。このマイクロプレートを生理食塩水で２
回洗浄した後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液２００μｌ
を各ウエルに分注し、４℃にて一夜放置した。以後の洗
浄は全て０．０５％Tween ２０を含むＰＢＳで行なっ
た。このプレートを３回洗浄し、検体あるいはスタンダ
ード抗原、５０μｌを加え室温で１時間撹はんした。３
回洗浄し、実施例４で作製した抗ヒトＳＭＰ３０ウサギ
抗体とＰＯＤとの結合物２５μｌ（５０００倍希釈）を
加え室温１時間反応させた。３回の洗浄の後、０．１％
のＡＢＴＳと１ｍＭのＨ₂ Ｏ₂ を含む基質液１００μｌ
を各ウエルに分注し、室温で３０分反応させた後、タイ
ターテックマルチレコーダーを用いて４１５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。図１にその定量曲線を示す。

【００３６】実施例６ 血球凝集反応によるＨ−ＳＭＰ３０の測定 ニワトリ赤血球をＰＢＳで３回洗浄した。この４ｍｌ溶
液にタンニン酸溶液（０．０２５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）２
０ｍｌを加え３７℃、６０分加温した。ＰＢＳで３回洗
浄し、この４ｍｌ溶液に抗Ｈ−ＳＭＰ３０ヤギ抗体（２
ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）１０ｍｌを加え３７℃，３時間加温
した。ＰＢＳで３回洗浄し１％ヤギ血清を含むＰＢＳに
懸濁し１％血球溶液とした。検体もしくはスタンダード
溶液を９６穴のタイタープレートに２ⁿ 倍希釈で実施例
２で得られた高分子結合物とともに加え（２５μｌ）、
抗体感作血球（１％）２５μｌを各ウエルに添加した。
撹はん後、３時間室温に放置し、その凝集像を判定し
た。結果を下記表１に示す。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【発明の効果】本発明により、Ｈ−ＳＭＰ３０が初めて
単離され、そのアミノ酸配列が決定された。さらに、本
発明により、Ｈ−ＳＭＰ３０をコードするＤＮＡが初め
てクローニングされ、その塩基配列が決定された。さら
に、本発明により、Ｈ−ＳＭＰ３０に対する抗体が初め
て提供された。これにより、ヒト組織中又は体液中に存
在するＨ−ＳＭＰ３０を検出及び定量することができる
ようになった。従って、本発明は、肝障害や腎障害のモ
ニタリング及び新生児の肝臓及び腎臓の発達の程度の観
察に大いに寄与するものと考えられる。

【００３９】

【配列表】

配列番号 : 1 配列の長さ : 1356 配列の型 : 核酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列 ACAAACACCA AGGAGTGGAG GTCAGAGTGT CACTTTTTTG TTTTCTTTTT GAAAGATCAT 60 TCGAGAAACA CGTCACTGAT CTCCCCTGCG ACC ATG TCT TCC ATT AAG ATT GAG 114 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu 1 5 TGT GTT TTG CCA GAG AAC TGC CGG TGT GGT GAG TCT CCA GTA TGG GAG 162 Cys Val Leu Pro Glu Asn Cys Arg Cys Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu 10 15 20 GAA GTG TCC AAC TCT CTG CTC TTT GTA GAC ATT CCT GCA AAA AAG GTT 210 Glu Val Ser Asn Ser Leu Leu Phe Val Asp Ile Pro Ala Lys Lys Val 25 30 35 TGC CGG TGG GAT TCA TTC ACC AAG CAA GTA CAG CGA GTG ACC ATG GAT 258 Cys Arg Trp Asp Ser Phe Thr Lys Gln Val Gln Arg Val Thr Met Asp 40 45 50 55 GCC CCA GTC AGC TCC GTG GCT CTT CGC CAG TCG GGA GGC TAT GTT GCC 306 Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala 60 65 70 ACC ATT GGA ACA AAG TTC TGT GCT TTG AAC TGG AAA GAA CAA TCA GCA 354 Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu Asn Trp Lys Glu Gln Ser Ala 75 80 85 GTT GTC TTG GCC ACG GTG GAT AAC GAC AAG AAA AAC AAT CGC TTC AAT 402 Val Val Leu Ala Thr Val Asp Asn Asp Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn 90 95 100 GAT GGG AAG GTG GAT CCC GCC GGG AGG TAC TTT GCT GGC ACC ATG GCT 450 Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala 105 110 115 GAG GAA ACA GCT CCA GCA GTT CTT GAG CGG CAC CAG GGG GCC CTG TAC 498 Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu Arg His Gln Gly Ala Leu Tyr 120 125 130 135 TCC CTC TTT CCT GAT CAC CAC GTG AAA AAG TAC TTT GAC CAG GTG GAC 546 Ser Leu Phe Pro Asp His His Val Lys Lys Tyr Phe Asp Gln Val Asp 140 145 150 ATT TCC AAT GGT TTG GAT TGG TCG CTA GAC CAC AAA ATC TTC TAT TAC 594 Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr 155 160 165 ATT GAC AGC CTG TCC TAC TCC GTG GAT GCC TTT GAC TAT GAC CTG CAG 642 Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Ser Val Asp Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Gln 170 175 180 ACA GGA CAG ATC TCC AAC CGC AGA AGT GTT TAC AAG CTA GAA AAG GAA 690 Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Ser Val Tyr Lys Leu Glu Lys Glu 185 190 195 GAA CAA ATC CCA GAT GGA ATG TGT ATT GAT GCT GAG GGG AAG CTC TGG 738 Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile Asp Ala Glu Gly Lys Leu Trp 200 205 210 215 GTG GCC TGT TAC AAT GGA GGA AGA GTG ATT CGT TTA GAT CCT GTG ACA 786 Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val Ile Arg Leu Asp Pro Val Thr 220 225 230 GGG AAA AGA CTT CAA ACT GTG AAG TTG CCT GTT GAT AAA ACA ACT TCA 834 Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser 235 240 245 TGC TGC TTT GGA GGG AAG AAT TAC TCT GAA ATG TAT GTG ACC TGC GCC 882 Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asn Tyr Ser Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala 250 255 260 CGG GAT GGG ATG GAC CCC GAG GGT CTT TTG AGG CAA CCT GAA GCT GGT 930 Arg Asp Gly Met Asp Pro Glu Gly Leu Leu Arg Gln Pro Glu Ala Gly 265 270 275 GGA ATT TTC AAG ATA ACT GGT CTG GGG GTC AAA GGA ATT GCT CCC TAC 978 Gly Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr 280 285 290 295 TCC TAT GCG GGA TGAGGACAGG TCTTCTTTCC TGCCAGAGGG AGCTCTGAAG 1030 Ser Tyr Ala Gly ACAACTAGAG AATTCTGGGC CTGAAATTTC AATCTAGTTA GAAAGAAAAA TGAGGCAATG 1090 ATTTTATTAA CAGCGTTAAG TTTTAATTTA CAACTTTTAA AAGGCAGAGC ATTTTTAACA 1150 AGGGGTGACA GGTGGTTTTG ATAACACACT TATAAGGCTT TCTGTAAAAG GTACTATAGA 1210 AGGGCGAAGA ATCGTTCAAC TGTCAATCAG CCTCTTGATT CTTTGTAAAT TGCCAGGGTG 1270 GGTGGGTACA TATCTCTTCT TGATTCTGCA TTTCATACTT AACTATATTA AAGCTTCAAG 1330 GAACAATAAA TAGTAACCTG GTAATG 1356

【００４０】配列番号 :２ 配列の長さ : ２９９ 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列 Met Ser Ser Ile Lys Ile Glu Cys Val Leu Pro Glu Asn Cys Arg Cys 1 5 10 15 Gly Glu Ser Pro Val Trp Glu Glu Val Ser Asn Ser Leu Leu Phe Val 20 25 30 Asp Ile Pro Ala Lys Lys Val Cys Arg Trp Asp Ser Phe Thr Lys Gln 35 40 45 Val Gln Arg Val Thr Met Asp Ala Pro Val Ser Ser Val Ala Leu Arg 50 55 60 Gln Ser Gly Gly Tyr Val Ala Thr Ile Gly Thr Lys Phe Cys Ala Leu 65 70 75 80 Asn Trp Lys Glu Gln Ser Ala Val Val Leu Ala Thr Val Asp Asn Asp 85 90 95 Lys Lys Asn Asn Arg Phe Asn Asp Gly Lys Val Asp Pro Ala Gly Arg 100 105 110 Tyr Phe Ala Gly Thr Met Ala Glu Glu Thr Ala Pro Ala Val Leu Glu 115 120 125 Arg His Gln Gly Ala Leu Tyr Ser Leu Phe Pro Asp His His Val Lys 130 135 140 Lys Tyr Phe Asp Gln Val Asp Ile Ser Asn Gly Leu Asp Trp Ser Leu 145 150 155 160 Asp His Lys Ile Phe Tyr Tyr Ile Asp Ser Leu Ser Tyr Ser Val Asp 165 170 175 Ala Phe Asp Tyr Asp Leu Gln Thr Gly Gln Ile Ser Asn Arg Arg Ser 180 185 190 Val Tyr Lys Leu Glu Lys Glu Glu Gln Ile Pro Asp Gly Met Cys Ile 195 200 205 Asp Ala Glu Gly Lys Leu Trp Val Ala Cys Tyr Asn Gly Gly Arg Val 210 215 220 Ile Arg Leu Asp Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu Gln Thr Val Lys Leu 225 230 235 240 Pro Val Asp Lys Thr Thr Ser Cys Cys Phe Gly Gly Lys Asn Tyr Ser 245 250 255 Glu Met Tyr Val Thr Cys Ala Arg Asp Gly Met Asp Pro Glu Gly Leu 260 265 270 Leu Arg Gln Pro Glu Ala Gly Gly Ile Phe Lys Ile Thr Gly Leu Gly 275 280 285 Val Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Tyr Ala Gly 290 295

【図面の簡単な説明】

【図１】抗Ｈ−ＳＭＰ３０抗体を用いたＥＬＩＳＡ法に
より得られた定量曲線を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２で示されるアミノ酸
   配列を有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１記載のポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む、クローン化ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡ領域は、配列表の配列番号１
   で示される９４番目から９９０番目で示される塩基配列
   を有する請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１記載のポリペプチド又はその部
   分を抗原とする抗体又はその抗原結合性フラグメントを
   含む、ヒト老化マーカータンパクＳＭＰ３０測定用試
   薬。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
   の一部又はそれと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸
   断片を含む、ヒト老化マーカータンパクＳＭＰ３０コー
   ド遺伝子検出用プローブ。