JPS62261961A - 抗イデイオタイプ抗体を用いた抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定方法および肝疾患診断への応用 - Google Patents
抗イデイオタイプ抗体を用いた抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定方法および肝疾患診断への応用Info
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- JPS62261961A JPS62261961A JP61104741A JP10474186A JPS62261961A JP S62261961 A JPS62261961 A JP S62261961A JP 61104741 A JP61104741 A JP 61104741A JP 10474186 A JP10474186 A JP 10474186A JP S62261961 A JPS62261961 A JP S62261961A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト肝細胞抗原に対して特異的に作用する新
規なモノクローナル抗体のイディオタイプに特異性を有
する抗イディオタイプ抗体勿用いる。血清中の肝細胞抗
原に対する抗体、いわゆる自己抗体の量を測定するため
の方法に関する。
規なモノクローナル抗体のイディオタイプに特異性を有
する抗イディオタイプ抗体勿用いる。血清中の肝細胞抗
原に対する抗体、いわゆる自己抗体の量を測定するため
の方法に関する。
また本発明は、上記し几新規なモノクローナル抗体のイ
ディオタイプに対する抗イディオタイプ抗体勿用いる肝
疾患診断法に関するものである。
ディオタイプに対する抗イディオタイプ抗体勿用いる肝
疾患診断法に関するものである。
従来肝機能の診断にはAL’I: (アラニンアミノ転
移酵素)、AST (アスノ9ライン駿アミノ転移酵素
)等肝臓に存在する酵素の活性を測定する方法等が用い
られてい友、これらの方法によって肝機能や肝疾患につ
いて種々の情報を得ることができるが必ずしも肝機能に
特有のものではなく正確な測定や診断の几めにはさらに
他の情報を得る手段が求められていた。
移酵素)、AST (アスノ9ライン駿アミノ転移酵素
)等肝臓に存在する酵素の活性を測定する方法等が用い
られてい友、これらの方法によって肝機能や肝疾患につ
いて種々の情報を得ることができるが必ずしも肝機能に
特有のものではなく正確な測定や診断の几めにはさらに
他の情報を得る手段が求められていた。
本発明者らはさきにヒト肝細胞抗原に対して特異的に作
用する新規なモノクローナル抗体およびその製造性を提
案した(昭和60年2月15日出願特願昭60−265
52号〕。
用する新規なモノクローナル抗体およびその製造性を提
案した(昭和60年2月15日出願特願昭60−265
52号〕。
このヒト肝細胞抗体に対して特異的に作用する新規なモ
ノクローナル抗体は、マウスtヒト肝細胞抗原で免疫し
て得られるマウスの肺細胞と、マウスのミエローマ細胞
とを細胞融合し、得られたヒト肝細胞抗原に対するモノ
クローナル抗体t−1i生する能力を有する融合細廁を
培地で培養するか、ま九はマウスの腹腔内に移植して、
培養液中にかま友は腹水中にこのモノクローナル抗体を
生成させることによって得られたものである。
ノクローナル抗体は、マウスtヒト肝細胞抗原で免疫し
て得られるマウスの肺細胞と、マウスのミエローマ細胞
とを細胞融合し、得られたヒト肝細胞抗原に対するモノ
クローナル抗体t−1i生する能力を有する融合細廁を
培地で培養するか、ま九はマウスの腹腔内に移植して、
培養液中にかま友は腹水中にこのモノクローナル抗体を
生成させることによって得られたものである。
ところで、ヒトの血清中にはヒトの肝細胞組織に由来す
る種々の抗原すなわち肝細胞抗原に反応する抗体である
いわゆる自己抗体が存在することが矧られている。本発
明者らはこのヒト肝細胞抗原に対して特異的に作用する
上記の新規なモノクローナル抗体の挙動を研究する過程
で、血清中の自己抗体のitkこのモノクローナル抗体
を用いて測定しうろことを見出して被検査血清中の抗ヒ
ト肝特異抗原抗体tr測定する方法r完成した(昭和6
0年4月19日出願特願昭60−82664号)。本発
明者らは更に研究の結果血清中の自己抗体量をこのモノ
クローナル抗体より得られた抗モノクローナル抗体Ig
G勿用いて測定しうろこと、およびこのようにして測定
しt自己抗体量の多寡が肝疾患の有無と深い関連がある
ことを見出してこの発明を完成したのである。
る種々の抗原すなわち肝細胞抗原に反応する抗体である
いわゆる自己抗体が存在することが矧られている。本発
明者らはこのヒト肝細胞抗原に対して特異的に作用する
上記の新規なモノクローナル抗体の挙動を研究する過程
で、血清中の自己抗体のitkこのモノクローナル抗体
を用いて測定しうろことを見出して被検査血清中の抗ヒ
ト肝特異抗原抗体tr測定する方法r完成した(昭和6
0年4月19日出願特願昭60−82664号)。本発
明者らは更に研究の結果血清中の自己抗体量をこのモノ
クローナル抗体より得られた抗モノクローナル抗体Ig
G勿用いて測定しうろこと、およびこのようにして測定
しt自己抗体量の多寡が肝疾患の有無と深い関連がある
ことを見出してこの発明を完成したのである。
すなわち、自己抗体量tこの抗イデイオタイプ抗体であ
る抗モノクローナル抗体IgG 音用いて測定すると以
下に詳述するように肝疾患を持つ被検者の血清中には正
常人のそれと比較して多量の自己抗体が存在することが
見出され、この自己抗体量tモニターすることによって
肝疾患の有無?マークしうろことが明らかにされ友ので
ある。従ってこの発明による血清中の自己抗体の測定に
よって肝疾患の診断に新友な手段と可能性を導入し友こ
とKなる。
る抗モノクローナル抗体IgG 音用いて測定すると以
下に詳述するように肝疾患を持つ被検者の血清中には正
常人のそれと比較して多量の自己抗体が存在することが
見出され、この自己抗体量tモニターすることによって
肝疾患の有無?マークしうろことが明らかにされ友ので
ある。従ってこの発明による血清中の自己抗体の測定に
よって肝疾患の診断に新友な手段と可能性を導入し友こ
とKなる。
不発明は、ヒト肝細胞抗原に対するモノクロ−ナル抗体
のイディオタイプに特異性?有する抗イデイオタイプ抗
体を用いて、免疫化学的方法によって被検者の血清中の
抗ヒト肝特異抗原抗体量を測定する方法を提供する本の
である。
のイディオタイプに特異性?有する抗イデイオタイプ抗
体を用いて、免疫化学的方法によって被検者の血清中の
抗ヒト肝特異抗原抗体量を測定する方法を提供する本の
である。
更に具体的には本発明は、本モノクローナル抗体より得
られた抗モノクローナル抗体IgG f固足化し、これ
に被検血清を加え、上記のモノクローナル抗体に対する
抗イデイオタイプ抗体である抗モノクローナル抗体Ig
Gと抗ヒト肝特異抗原抗体とr結合させ、固定化した机
イディオタイプ抗体に結合した抗ヒト肝特異抗原抗体に
、更に酵素、ラジオアイソトープ、螢光体等で標識した
抗ヒト血清免疫グロブリンを加えて結合させ、この結合
した机ヒト血清免疫グロブリンの量を免疫化学的に測定
することによる、被検者の血清中の抗ヒト肝特異抗原抗
体量勿測定する方法を提供するものである。
られた抗モノクローナル抗体IgG f固足化し、これ
に被検血清を加え、上記のモノクローナル抗体に対する
抗イデイオタイプ抗体である抗モノクローナル抗体Ig
Gと抗ヒト肝特異抗原抗体とr結合させ、固定化した机
イディオタイプ抗体に結合した抗ヒト肝特異抗原抗体に
、更に酵素、ラジオアイソトープ、螢光体等で標識した
抗ヒト血清免疫グロブリンを加えて結合させ、この結合
した机ヒト血清免疫グロブリンの量を免疫化学的に測定
することによる、被検者の血清中の抗ヒト肝特異抗原抗
体量勿測定する方法を提供するものである。
本発明で使用しうる抗モノクローナル抗体IgGは具体
的にはモノクローナル抗体を動物、例えば家兎に投与し
てこの家兎を免疫化しその血清より得られるものである
。このモノクローナル抗体により免疫化する動物として
は、家兎の他にラット、モルモット、山羊、羊、牛、馬
などが挙げられる。
的にはモノクローナル抗体を動物、例えば家兎に投与し
てこの家兎を免疫化しその血清より得られるものである
。このモノクローナル抗体により免疫化する動物として
は、家兎の他にラット、モルモット、山羊、羊、牛、馬
などが挙げられる。
さらにまたこの抗モノクローナル抗体工gGとは機能的
に抗イデイオタイプ抗体として等価のモノクローナル抗
体もこの方法において上記の抗モノクローナル抗体と同
様に使用することができ、そしてこのモノクローナル抗
体は常法による細胞融合の手段で得られる融合細胞から
生成させることができるのである。
に抗イデイオタイプ抗体として等価のモノクローナル抗
体もこの方法において上記の抗モノクローナル抗体と同
様に使用することができ、そしてこのモノクローナル抗
体は常法による細胞融合の手段で得られる融合細胞から
生成させることができるのである。
このモノクローナル抗体kv4製する友めに本発明者ら
は、マウスをヒト肝細胞抗原で免疫して得られるマウス
の脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合してヒト肝
細胞抗原に対するモノクローナル抗体を産生する能力金
有する融合細胞を得几が、この場合に用いられるマウス
ミエローマ細、胞にはこの技術分野で既知の種々の株、
例えばST2− NS1株、26株、P3U1株、MP
C−11株、SF3株、X65株などが挙げられる。
は、マウスをヒト肝細胞抗原で免疫して得られるマウス
の脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合してヒト肝
細胞抗原に対するモノクローナル抗体を産生する能力金
有する融合細胞を得几が、この場合に用いられるマウス
ミエローマ細、胞にはこの技術分野で既知の種々の株、
例えばST2− NS1株、26株、P3U1株、MP
C−11株、SF3株、X65株などが挙げられる。
これら既知の種々のマウスミエローマ細胞株が本発明の
方法で用いるモノクローナル抗体tM生ずる友めの融合
細胞調製の几めに用いうるものであるが、これら多数の
ミエローマ細胞株の一つとして以下の実施例ではマウス
ミエローマ細胞ST2− NS1株を使用した例r示す
。
方法で用いるモノクローナル抗体tM生ずる友めの融合
細胞調製の几めに用いうるものであるが、これら多数の
ミエローマ細胞株の一つとして以下の実施例ではマウス
ミエローマ細胞ST2− NS1株を使用した例r示す
。
このマウスミエローマ細胞ST2− NS1株を用いて
得られた融合細胞については本発明者らはこれを融合細
胞H−2株と命名した。そしてこの融合細胞H−2株が
産生ずるモノクローナル抗体については本発明者らはこ
れ7H−2モノクロ一ナル抗体とも呼称することとじ几
。
得られた融合細胞については本発明者らはこれを融合細
胞H−2株と命名した。そしてこの融合細胞H−2株が
産生ずるモノクローナル抗体については本発明者らはこ
れ7H−2モノクロ一ナル抗体とも呼称することとじ几
。
このようにして得られるモノクローナル抗体は工gG2
bに属する免疫グロブリンであるヒト肝細胞抗原に対し
て特異なモノクローナル抗体である。
bに属する免疫グロブリンであるヒト肝細胞抗原に対し
て特異なモノクローナル抗体である。
そして本発明者らはヒトの肝臓で産生する肝臓組織由来
の抗原に対する自己抗体量は以下に詳述するように肝疾
患r持つ被検者と正常者との間には著しい差があること
を見出したが、本発明によるモノクローナル抗体より得
られた机イディオタイプ抗体である抗モノクローナル抗
体IgG ’i用いる上記の自己抗体量の検定によって
肝疾患の有無の判定が可能となつ窺のである。
の抗原に対する自己抗体量は以下に詳述するように肝疾
患r持つ被検者と正常者との間には著しい差があること
を見出したが、本発明によるモノクローナル抗体より得
られた机イディオタイプ抗体である抗モノクローナル抗
体IgG ’i用いる上記の自己抗体量の検定によって
肝疾患の有無の判定が可能となつ窺のである。
このモノクローナル抗体より得られた抗モノクローナル
抗体IgGは従って各種ヒト肝疾患の病態診断のために
用いうるものでるる。
抗体IgGは従って各種ヒト肝疾患の病態診断のために
用いうるものでるる。
かくして本発明の測定方法は従来の肝機能検査の1つで
あるALTの検査結果とは相互関係を有しないので全く
異なった面から肝機能の測定を可能とし比ものである。
あるALTの検査結果とは相互関係を有しないので全く
異なった面から肝機能の測定を可能とし比ものである。
本発明の方法で用いるヒト肝細胞抗原に対して特異なモ
ノクローナル抗体は次のようにして製造される。
ノクローナル抗体は次のようにして製造される。
(1) ヒト肝細胞抗原の調製
ヒト肝臓組織(正常肝)の破砕物tシュクロース水溶液
で抽出し、抽出物を超遠心にかけ、上清をグル濾過処理
する。ゲル濾過は好ましくはセファデックスG−100
(米国、ファルマシア社製) カラムr用い、Tris
−HCL 、 NaCj 。
で抽出し、抽出物を超遠心にかけ、上清をグル濾過処理
する。ゲル濾過は好ましくはセファデックスG−100
(米国、ファルマシア社製) カラムr用い、Tris
−HCL 、 NaCj 。
gDTAからなる緩衝液で溶出し、浴出液の第1ピーク
分画rセファロース(米国、ファルマシア社!り6Bカ
ラムにかけ、上記の緩衝液で溶出する。浴出液の第1ピ
ーク画分から抗原物質が得られる。
分画rセファロース(米国、ファルマシア社!り6Bカ
ラムにかけ、上記の緩衝液で溶出する。浴出液の第1ピ
ーク画分から抗原物質が得られる。
(2)免疫化動物!fa胞のR製
マウス勿ヒト肝細胞抗原で免疫し、その動物から脾細胞
を採取する。免疫化はそれ自体公知の方法によって実施
される。
を採取する。免疫化はそれ自体公知の方法によって実施
される。
(3)融合細胞の作成
上記免疫化脾細胞とマウスミエローマ細胞とを常法に従
って融合させる。融合細胞はヒポキサンチンーアミノプ
リランーチきジン(HAT)培地中で選択培養する。ラ
ジオイムノアッセイ(RIA)により抗体を産生じてい
る細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒト肝細胞
抗原に特異的なモノクローナル抗体rM生する融合細胞
H−2株を得る。
って融合させる。融合細胞はヒポキサンチンーアミノプ
リランーチきジン(HAT)培地中で選択培養する。ラ
ジオイムノアッセイ(RIA)により抗体を産生じてい
る細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒト肝細胞
抗原に特異的なモノクローナル抗体rM生する融合細胞
H−2株を得る。
(4) モノクローナル抗体の調製
融合細胞H−2株を培地で培養するがt比はマウス腹腔
内に移植して腹水癌化することにより培養液中ま九は腹
水中にモノクローナル抗体?生成蓄積させ、培養液また
は腹水中から常法によりモノクローナル抗体を採取する
。
内に移植して腹水癌化することにより培養液中ま九は腹
水中にモノクローナル抗体?生成蓄積させ、培養液また
は腹水中から常法によりモノクローナル抗体を採取する
。
このようにして得られる融合細胞H−2株は次の特性を
有する。
有する。
(由 来)
マウスミエローマMm (ST2−NS1 ) トマウ
ス牌臓細胞との融合細胞である。
ス牌臓細胞との融合細胞である。
(形 態)
マウスミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示す。
(機 能)
免疫グロブリンIgG2b f定常的に産生する。
(増殖性)
ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性【示す。
九とえは、72時間で約10倍に増殖する。
(保存性)
一80℃以下で長期間保存可能である。
(最適増殖条件)
pH7,2、温度37℃
(培 地)
FIPMI 1640 (米国、ギプコ社製)に10−
の牛胎児血清を含ませ次もの。
の牛胎児血清を含ませ次もの。
上記融合細胞H−2株は昭和60年2月12日に工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託申請され72.(寄託
受託拒否通知書、60微寄文第192号)。
術院微生物工業技術研究所に寄託申請され72.(寄託
受託拒否通知書、60微寄文第192号)。
つぎに、上記のようにして得られるモノクローナル抗体
に用いる被検食血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体すなわち
ヒトの肝臓で産生ずる肝臓組織由来の抗原に対する自己
抗体の存在量の測定方法について述べる。
に用いる被検食血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体すなわち
ヒトの肝臓で産生ずる肝臓組織由来の抗原に対する自己
抗体の存在量の測定方法について述べる。
本発明において用いる測定原理は次の如くである。即ち
本モノクローナル抗体と同様のイデイオタイブを有する
自己抗体を認識する友めに轟該モノクロナール抗体金家
兎に免疫して得た抗H2Ig()(抗イデイオタイプ抗
体)?!−固相化し、次に被検体液(血液や骨ずい液)
を加えて固相化し友抗H2IgGに結合した自己抗体を
酵素標識した机ヒト血清免疫グロブリン〔カッベル社M
(米国)、CAPPEL LABORATOEIIES
INC,)を加えることにより定量するものである。
本モノクローナル抗体と同様のイデイオタイブを有する
自己抗体を認識する友めに轟該モノクロナール抗体金家
兎に免疫して得た抗H2Ig()(抗イデイオタイプ抗
体)?!−固相化し、次に被検体液(血液や骨ずい液)
を加えて固相化し友抗H2IgGに結合した自己抗体を
酵素標識した机ヒト血清免疫グロブリン〔カッベル社M
(米国)、CAPPEL LABORATOEIIES
INC,)を加えることにより定量するものである。
従来の自己抗体の定量法は例えばオフタロニー法や組織
切片音用い友間接螢光法により行なわれそれぞれ組織抽
出抗原や組織切片を必要としてい友ことからこれら組織
抽出抗原や組織切片の入手がしばしば困llr来してい
友。これに対し、本性はその安定供給が可能な抗イディ
オタイプ抗体音用いるもので、従来法に比べ試薬厘料の
入手等に問題は全くない。
切片音用い友間接螢光法により行なわれそれぞれ組織抽
出抗原や組織切片を必要としてい友ことからこれら組織
抽出抗原や組織切片の入手がしばしば困llr来してい
友。これに対し、本性はその安定供給が可能な抗イディ
オタイプ抗体音用いるもので、従来法に比べ試薬厘料の
入手等に問題は全くない。
この方法は広く自己抗体の検出・定量を可能にし友もの
であり、ヒト肝特異抗原に対する自己抗体の定量にのみ
使用されるものではない。
であり、ヒト肝特異抗原に対する自己抗体の定量にのみ
使用されるものではない。
この抗イデイオタイプ抗体を用いる血清中の自己抗体の
測定は免疫化学的測定法によって行なわれ、その抗イデ
イオタイプ抗体の固相化は通常プラスチックウェル(P
lastic well )で行なわれ、このグラスチ
ックウェルに抗イデイオタイプ抗体が固相化されていな
い部分がある場合は次に添加する血清中の自己抗体が更
に固相されることになって測定エラーを生ずるので、上
記部分の目づめの几めに蛋白質例えば牛胎児血清で保護
することが行なわれる。
測定は免疫化学的測定法によって行なわれ、その抗イデ
イオタイプ抗体の固相化は通常プラスチックウェル(P
lastic well )で行なわれ、このグラスチ
ックウェルに抗イデイオタイプ抗体が固相化されていな
い部分がある場合は次に添加する血清中の自己抗体が更
に固相されることになって測定エラーを生ずるので、上
記部分の目づめの几めに蛋白質例えば牛胎児血清で保護
することが行なわれる。
次に実施例を示して本発明勿さらに具体的に説明する。
実施例1 融合細胞の調製
(1) ヒト肝細胞抗原の調製
ヒトの正常肝組織全2.5%シュクロースでホモジナイ
ズし、100.Doorの超遠心にかける1時間後に得
られる上清に、セファデックスG−100のカラムにか
ける。浴出には、[LIMTrls −Hct (p)
Ia O)、CL2M NaCt、 0.1MEDT
A緩衝液を用い文。得られた第1ピークの分画勿セファ
ロース6Bカラムにかけ、同様の緩衝液での出された第
1ピークで集めて、以下に用いる抗原物質とし友。
ズし、100.Doorの超遠心にかける1時間後に得
られる上清に、セファデックスG−100のカラムにか
ける。浴出には、[LIMTrls −Hct (p)
Ia O)、CL2M NaCt、 0.1MEDT
A緩衝液を用い文。得られた第1ピークの分画勿セファ
ロース6Bカラムにかけ、同様の緩衝液での出された第
1ピークで集めて、以下に用いる抗原物質とし友。
抗原物質の梢製の詳細については、マッグ・7アーラy
(Me Farlane )らの方法〔「ビューリイ
フイケーション・アンド・キャラクタライゼーション・
オブ・ヒユーマン・リバースベシフインク・メンプラン
・リポプロティン (Purification and Charact
erization of humanliver−s
pecific membrane 1ipoprot
ein (LSP ) )、「クリニカル・エクスベリ
メンタル・イムノロギーJ (C11nical Ex
perimental Immunology ) 2
7 。
(Me Farlane )らの方法〔「ビューリイ
フイケーション・アンド・キャラクタライゼーション・
オブ・ヒユーマン・リバースベシフインク・メンプラン
・リポプロティン (Purification and Charact
erization of humanliver−s
pecific membrane 1ipoprot
ein (LSP ) )、「クリニカル・エクスベリ
メンタル・イムノロギーJ (C11nical Ex
perimental Immunology ) 2
7 。
381〜390(1977))に準じて行なり几。
(2)融合のための膵臓細胞の調製
Ba1b/Cマウス(5週令、♀)に70インP完全ア
ジユバントに溶解させ次160μtの抗原物質を皮下お
よび腹腔内に半分ずつ注射する。1力月後同様に皮下投
与7行ない、さらに1力月後同様に注射し友、最終投与
の4日後に肺臓tとり出し、脾細胞を血清不含の培養液
(RPM11640 (ギブコ社製)Z5田M lPE
5 、 pH7,2で緩衝)中に浮遊させ次。
ジユバントに溶解させ次160μtの抗原物質を皮下お
よび腹腔内に半分ずつ注射する。1力月後同様に皮下投
与7行ない、さらに1力月後同様に注射し友、最終投与
の4日後に肺臓tとり出し、脾細胞を血清不含の培養液
(RPM11640 (ギブコ社製)Z5田M lPE
5 、 pH7,2で緩衝)中に浮遊させ次。
(3) 細胞融合のためのミエローマ細胞の調製マウ
スミエローマ細胞(SF2/NS1 )は10%牛胎児
血清を含有するRPM11640培地で継代培養し友も
のである。このミエローマ細胞(8P2/N91 )の
培養は、5−の炭酸ガスを含む気流を流した炭醗ガスイ
ンキエベーター中で2五7℃で行われtゆこの細胞は選
択的にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地
中で阻害されることを確認し几。
スミエローマ細胞(SF2/NS1 )は10%牛胎児
血清を含有するRPM11640培地で継代培養し友も
のである。このミエローマ細胞(8P2/N91 )の
培養は、5−の炭酸ガスを含む気流を流した炭醗ガスイ
ンキエベーター中で2五7℃で行われtゆこの細胞は選
択的にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地
中で阻害されることを確認し几。
(4)融合細胞の作製
マウスミエローマ細胞(SP2/NS1 )のRPMI
浮遊[(2x107個)を用意し、前記の脾細胞浮遊液
(7X107個)と混合した後400Xrで5分間遠心
分離して上清を除き両細胞の混合した沈澱を採取し友、
沈澱に50%(重量/容量)ポリエチレングリコール溶
液1dk37℃、1分間にわ几ってゆるく攪拌しながら
加えて、両細胞を融合させ友。その後、牛胎児血清を含
まない15−の!tPM11640培地を徐々に加えて
反応を停止させ、RPM11640で2〜5回洗浄(4
00Xf、5分間)し、融合細胞を得友。
浮遊[(2x107個)を用意し、前記の脾細胞浮遊液
(7X107個)と混合した後400Xrで5分間遠心
分離して上清を除き両細胞の混合した沈澱を採取し友、
沈澱に50%(重量/容量)ポリエチレングリコール溶
液1dk37℃、1分間にわ几ってゆるく攪拌しながら
加えて、両細胞を融合させ友。その後、牛胎児血清を含
まない15−の!tPM11640培地を徐々に加えて
反応を停止させ、RPM11640で2〜5回洗浄(4
00Xf、5分間)し、融合細胞を得友。
上記の融合細胞を牛胎児血清15%?添加したFIPM
11640培地に浮遊さセ”C,2X10’(fl/d
の細胞を含む懸濁液とし、その0.1−ずつを96穴の
組織培養プレートに入れ95%空気15%炭酸ガスの気
流中で炭酸ガスインキエペーターを用いて、67℃で2
4時間培養しt後、ヒポキサンチンーアミノプテリンー
チミゾ/(HAT)選択培地α11R1ずつを加えて培
養r行つ几、その後、培養2.3.5日目に数回HAT
培地の変換上行いながら培養を続け、10日0以後は)
IT培地で数回培養液の交換を行い、144日目各培養
液上清を取り抗体勿産生している細胞群をラジオイムノ
アッセイ(RIA)で選びだし次。選別は希釈法を用い
、1ウエルあ友り1個の融合細胞が含まれるようにして
増殖させ友。
11640培地に浮遊さセ”C,2X10’(fl/d
の細胞を含む懸濁液とし、その0.1−ずつを96穴の
組織培養プレートに入れ95%空気15%炭酸ガスの気
流中で炭酸ガスインキエペーターを用いて、67℃で2
4時間培養しt後、ヒポキサンチンーアミノプテリンー
チミゾ/(HAT)選択培地α11R1ずつを加えて培
養r行つ几、その後、培養2.3.5日目に数回HAT
培地の変換上行いながら培養を続け、10日0以後は)
IT培地で数回培養液の交換を行い、144日目各培養
液上清を取り抗体勿産生している細胞群をラジオイムノ
アッセイ(RIA)で選びだし次。選別は希釈法を用い
、1ウエルあ友り1個の融合細胞が含まれるようにして
増殖させ友。
得られたクローンを幾度か希釈して培養金くり返し、ク
ローニングを行つ友、こうしてヒト肝細胞抗原に特異的
なモノクローナル抗体t−産生ずる融合細胞H−2株を
得九。
ローニングを行つ友、こうしてヒト肝細胞抗原に特異的
なモノクローナル抗体t−産生ずる融合細胞H−2株を
得九。
以上の操作はケーラーおよびミルスティン(1975)
ら〔ケーラー・グーおよびミルステイノ・ラニー、(K
;hler 、 G−and Milstein、 C
,rネーチャー(Nat、ure) J 256 49
5(1975)により確立された常法に従って行つ次。
ら〔ケーラー・グーおよびミルステイノ・ラニー、(K
;hler 、 G−and Milstein、 C
,rネーチャー(Nat、ure) J 256 49
5(1975)により確立された常法に従って行つ次。
実施例2 モノクローナル抗体の調製
プロティンAによるH−2モノクロ一ナル抗体の精製
Ba1b/cマウス(6〜8週令・雌性)にプリステー
ン(サメ由来の鉱油)を1匹67tつ0.51Ll腹腔
内投与して1週間後、約106〜107個の抗体産生細
胞H−2株rマウマウ腔内に移植し、1〜2週間後に貯
溜し次腹水?採取した。腹水を硫安分画法により分画し
て0〜50%分画の沈澱を集めl I M IJン酸緩
衝液CpHaO)に溶解し、透析し次。透析物の上清は
pH&0の11Mリン酸緩衝液で平衡させ几プロティン
A−セファロースCL−4Bカラム(米国、ファルマシ
ア社製)に吸着させ、Q、IN酢酸と0.14M N
aCtの混合物を用いて溶出させた。溶出後トリス粉末
にて中性に調良し、CL I M IJン酸緩衝液(P
H″14)で十分に透析してH−2モノクロ一ナル抗体
ケ得た。
ン(サメ由来の鉱油)を1匹67tつ0.51Ll腹腔
内投与して1週間後、約106〜107個の抗体産生細
胞H−2株rマウマウ腔内に移植し、1〜2週間後に貯
溜し次腹水?採取した。腹水を硫安分画法により分画し
て0〜50%分画の沈澱を集めl I M IJン酸緩
衝液CpHaO)に溶解し、透析し次。透析物の上清は
pH&0の11Mリン酸緩衝液で平衡させ几プロティン
A−セファロースCL−4Bカラム(米国、ファルマシ
ア社製)に吸着させ、Q、IN酢酸と0.14M N
aCtの混合物を用いて溶出させた。溶出後トリス粉末
にて中性に調良し、CL I M IJン酸緩衝液(P
H″14)で十分に透析してH−2モノクロ一ナル抗体
ケ得た。
実施例3 血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定
(1)抗H2IgGの調製
550μtのH−2モノクロ一ナル抗体と等量の完全フ
ロインドアジュバントで懸濁a’+[裂し、家ウサギの
前足および背部皮下に注射した。
ロインドアジュバントで懸濁a’+[裂し、家ウサギの
前足および背部皮下に注射した。
3週間後、等量の)1−2モノクローナル抗体金静脈内
注射し友。さらに1.2週間後にそれぞれ同様に静脈内
に投与し最終投与後38目に頚動脈より全採血を行い、
血清を得文、得られ几血清を、正常マウスIgで処理し
、抗血清(抗イデイオタイプ抗血清)t−得九、得られ
た抗血清756℃にて30分間インキュベートし非動化
した抗血清勿等量のリン酸緩衝液(−112)にて希釈
した後、攪拌しながら飽和硫安液で等量徐徐に加える。
注射し友。さらに1.2週間後にそれぞれ同様に静脈内
に投与し最終投与後38目に頚動脈より全採血を行い、
血清を得文、得られ几血清を、正常マウスIgで処理し
、抗血清(抗イデイオタイプ抗血清)t−得九、得られ
た抗血清756℃にて30分間インキュベートし非動化
した抗血清勿等量のリン酸緩衝液(−112)にて希釈
した後、攪拌しながら飽和硫安液で等量徐徐に加える。
加え終ってから30分間攪拌し、その後冷却遠心機にて
遠心分離する。沈澱1!r50チ飽和硫安液に懸濁し、
再び遠心分離して沈澱をうる。沈澱を少量のリン酸緩衝
液(pi(aO)に溶解し、透析チューブにつめて、同
一緩衝液に対して透析する。十分透析後、同一緩衝液に
て平衡化したプロティンA−セファロース0L−4Bカ
ラム(米国、ファルマシア社製)に吸着させQ、1N酢
酸と0.1 M NaCtの混合物を用いて溶出させ友
、溶出後、トリス粉末にて中性に調製し、リン酸緩衝f
i(pHaO)に対して透析する。十分透析後、同一緩
衝液で平衡化し7t、 DEAEセルロースカラムに添
加する。同カラムの素通り画分を集めて濃縮後回fi’
に抗H2IgGとして用い友。
遠心分離する。沈澱1!r50チ飽和硫安液に懸濁し、
再び遠心分離して沈澱をうる。沈澱を少量のリン酸緩衝
液(pi(aO)に溶解し、透析チューブにつめて、同
一緩衝液に対して透析する。十分透析後、同一緩衝液に
て平衡化したプロティンA−セファロース0L−4Bカ
ラム(米国、ファルマシア社製)に吸着させQ、1N酢
酸と0.1 M NaCtの混合物を用いて溶出させ友
、溶出後、トリス粉末にて中性に調製し、リン酸緩衝f
i(pHaO)に対して透析する。十分透析後、同一緩
衝液で平衡化し7t、 DEAEセルロースカラムに添
加する。同カラムの素通り画分を集めて濃縮後回fi’
に抗H2IgGとして用い友。
(2)診断
肝疾患患者血中にH2モノクローナル抗体と同一のイデ
ィオタイプを有する自己抗体すなわち抗ヒト肝特異抗原
抗体の検出と病態との関連を知るために抗)32 Ig
G (抗イデイオタイプ抗体)音用いてサンドインチ(
Sandwich ) ELISA法により自己抗体量
を測定し次。
ィオタイプを有する自己抗体すなわち抗ヒト肝特異抗原
抗体の検出と病態との関連を知るために抗)32 Ig
G (抗イデイオタイプ抗体)音用いてサンドインチ(
Sandwich ) ELISA法により自己抗体量
を測定し次。
抗H2IgG K体’k 2ooμr7*icリン酸緩
衝液(pH7,4)で希釈し、96大の組織培養プレー
トに50μjずつ加えて、37℃−晩インキユペートし
、リン酸緩衝g(p)17.4)で3回洗浄する。
衝液(pH7,4)で希釈し、96大の組織培養プレー
トに50μjずつ加えて、37℃−晩インキユペートし
、リン酸緩衝g(p)17.4)で3回洗浄する。
20%牛脂児血清を含むリン酸緩衝fi(PH7,4)
200μz2各ウエルに加えて、57℃1時間インキュ
ベートし、リン酸緩衝g(pl(7,4)で3回洗浄す
る。CL2チ牛血清アルブミンcL05 % Twee
n20を含むリン酸緩衝液(pi(7,4)で患者血清
上1000倍希釈して、37℃2時間インキュベート後
、3回洗浄して4.000倍希釈し友ペルオキシダーゼ
標識した机ヒト血清免疫グロブリンを50μ!ずつ加え
て37℃1時間インキュベートする。3回洗浄後、0−
フェニルノアミンおよび過酸化水素i ELISAの常
法に従って加えて、490 nmの吸光度を測定し次。
200μz2各ウエルに加えて、57℃1時間インキュ
ベートし、リン酸緩衝g(pl(7,4)で3回洗浄す
る。CL2チ牛血清アルブミンcL05 % Twee
n20を含むリン酸緩衝液(pi(7,4)で患者血清
上1000倍希釈して、37℃2時間インキュベート後
、3回洗浄して4.000倍希釈し友ペルオキシダーゼ
標識した机ヒト血清免疫グロブリンを50μ!ずつ加え
て37℃1時間インキュベートする。3回洗浄後、0−
フェニルノアミンおよび過酸化水素i ELISAの常
法に従って加えて、490 nmの吸光度を測定し次。
被検者血清中の抗体は490111mの吸光度値で表示
し次。その結果、第1表に示した如く、健常人12例の
a225±[]、064に対し、慢性肝炎8例では0.
370±0.155、肝硬変症7例では0.450±0
.118でいずれも有意に高値であつ九。これらの結果
からH2モノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ
抗体を用いて、同様の自己抗体を有する被検者血清中の
抗体すなわち抗ヒト肝特異抗原抗体の濃度を測定するこ
とが可能であることが見出され次。
し次。その結果、第1表に示した如く、健常人12例の
a225±[]、064に対し、慢性肝炎8例では0.
370±0.155、肝硬変症7例では0.450±0
.118でいずれも有意に高値であつ九。これらの結果
からH2モノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ
抗体を用いて、同様の自己抗体を有する被検者血清中の
抗体すなわち抗ヒト肝特異抗原抗体の濃度を測定するこ
とが可能であることが見出され次。
第1表
同 中外製薬株式会社
外2名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体から得
られた抗モノクローナル抗体IgGを用いて免疫化学的
方法によって被検査血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体量を
測定する方法。 2)ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体より得
られた抗モノクローナル抗体IgGを固定化しこれに被
検血清を加えて上記の抗モノクローナル抗体IgGと抗
ヒト肝特異抗原抗体とを結合させ、この固定化した抗モ
ノクローナル抗体IgGに結合した抗ヒト肝特異抗原抗
体に、更に酵素で標識した抗ヒト血清免疫グロブリンを
加えて結合させ、この結合した抗ヒト血清免疫グロブリ
ンの量を測定することからなる特許請求の範囲第1項に
記載の方法。 3)ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体は、マ
ウスをヒト肝細胞抗原で免疫して得られたマウスの脾細
胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合し、得られたヒ
ト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体を産生する能
力を有する融合細胞を培地で培養するかまたはマウス腹
腔内に移植して腹水癌化することにより培養液中または
腹水中に該モノクローナル抗体を生成させ、該培養液ま
たは腹水中からモノクローナル抗体を採取することで得
られたものである特許請求の範囲第1項または第2項に
記載の方法。 4)モノクローナル抗体は、マウスミエローマ細胞ST
2−NS1株を用いて得られた融合細胞H−2株から産
生されるものである特許請求の範囲第3項に記載の方法
。 5)抗モノクローナル抗体IgGがモノクローナル抗体
に対する抗イデイオタイプ抗体である抗H2IgGであ
る特許請求の範囲第1項または第2項に記載の方法。 6)抗モノクローナル抗体IgGの固定化をプラスチッ
クプレート上で行う特許請求の範囲第2項に記載の方法
。 7)抗モノクローナル抗体IgGがモノクローナル抗体
を家ウサギに投与して得られたものであり、また酵素で
標識した抗ヒト血清免疫グロブリンが酵素で標識した抗
ヒト免疫グロブリンである特許請求の範囲第2項に記載
の方法。 8)標識のために用いた酵素がペルオキシダーゼであり
、結合した抗ヒト血清免疫グロブリンの量はO−フェニ
ルジアミンと過酸化水素との反応による着色で測定する
ものである特許請求の範囲第2項に記載の方法。 9)ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体から得
られた抗モノクローナル抗体IgGを用いて免疫化学的
方法によって被検査血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体量を
測定することによる肝疾患診断方法。 10)ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体より
得られた抗モノクローナル抗体IgGを固定化し、これ
に被検血清を加えて抗モノクローナル抗体IgGと抗ヒ
ト肝特異抗原抗体とを結合させ、固定化した抗モノクロ
ーナル抗体IgGに結合した抗ヒト肝特異抗原抗体に、
更に酵素で標識した抗ヒト血清免疫グロブリンを加えて
結合させ、この結合した抗ヒト血清免疫グロブリンの量
を測定することからなる特許請求の範囲第9項に記載の
肝疾患診断方法。 11)モノクローナル抗体は、マウスをヒト肝細胞抗原
で免疫して得られたマウスの脾細胞とマウスミエローマ
細胞とを細胞融合し、得られたヒト肝細胞抗原に対する
モノクローナル抗体を産生する能力を有する融合細胞を
培地で培養するかまたはマウス腹腔内に移植して腹水癌
化することにより培養液中または腹水中に該モノクロー
ナル抗体を生成させ、該培養液または腹水中からモノク
ローナル抗体を採取することで得られたものである特許
請求の範囲第9項または第10項に記載の肝疾患診断方
法。 12)モノクローナル抗体は、マウスミエローマ細胞S
T2−NS1株を用いて得られた融合細胞H−2株から
産生されるものである特許請求の範囲第11項に記載の
肝疾患診断方法。 13)抗モノクローナル抗体IgGがモノクローナル抗
体に対する抗イデイオタイプ抗体である抗H2IgGで
ある特許請求の範囲第9項または第10項に記載の診断
方法。 14)抗モノクローナル抗体IgGの固定化をプラスチ
ックプレート上で行う特許請求の範囲第10項に記載の
肝疾患診断方法。 15)抗モノクローナル抗体IgGがモノクローナル抗
体を家ウサギに投与して得られたものであり、また酵素
で標識した抗ヒト血清免疫グロブリンが酵素で標識した
抗ヒト免疫グロブリンである特許請求の範囲第10項に
記載の肝疾患診断方法。 16)標識のために用いた酵素がペルオキシダーゼであ
り、結合した抗ヒト血清免疫グロブリンの量はO−フェ
ニルジアミンと過酸化水素との反応による着色で測定す
るものである特許請求の範囲第10項に記載の肝疾患診
断方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61104741A JPS62261961A (ja) | 1986-05-09 | 1986-05-09 | 抗イデイオタイプ抗体を用いた抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定方法および肝疾患診断への応用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61104741A JPS62261961A (ja) | 1986-05-09 | 1986-05-09 | 抗イデイオタイプ抗体を用いた抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定方法および肝疾患診断への応用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62261961A true JPS62261961A (ja) | 1987-11-14 |
Family
ID=14388921
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61104741A Pending JPS62261961A (ja) | 1986-05-09 | 1986-05-09 | 抗イデイオタイプ抗体を用いた抗ヒト肝特異抗原抗体量の測定方法および肝疾患診断への応用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62261961A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
CN104569447A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于动物病原体检测的无害化阳性对照品 |
CN104569402A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于间接酶联免疫吸附法检测的无害化阳性对照品 |
CN104569403A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照 |
-
1986
- 1986-05-09 JP JP61104741A patent/JPS62261961A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
CN104569447A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于动物病原体检测的无害化阳性对照品 |
CN104569402A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于间接酶联免疫吸附法检测的无害化阳性对照品 |
CN104569403A (zh) * | 2014-12-15 | 2015-04-29 | 新乡医学院 | 用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照 |
CN104569403B (zh) * | 2014-12-15 | 2016-08-24 | 新乡医学院 | 用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照 |
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