CN104569403B - 用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶联免疫试剂盒，具体提供了一种用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照，所述阳性对照由鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体按2:1‑1:32比例混合制成。本发明利用免疫学方法解决丙型肝炎间接法酶免诊断试剂阳性对照材料的来源并避免使用人血清潜在的风险。

Description

用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照
技术领域
本发明涉及酶联免疫试剂盒，具体地说，涉及一种用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照及其制备方法与应用。
背景技术
丙型病毒性肝炎(hepatitis C)是一种主要经血液传播的疾病，由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起，呈全球性流行，感染率约3％。我国一般人群感染率为3.2％，长江以北为3.6％，中南和东北地区分别高达3.8％和4.6％。
丙型肝炎的危害在于HCV感染后自发痊愈病例极少，慢性化率可高达60％～85％。其后果是导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，容易转化为肝硬化、肝细胞癌(HCC)等终末期肝病，预后差。我国十五科技攻关的资料表明，感染10年和20年以上的肝硬化发生率分别为9.20％和15.29％。世界卫生组织(WHO)对6个国家的11项研究资料表明，感染20年后平均肝硬化发生率为10％～15％，最高可达55％，而HCC的发生率最高可达23％。由于其流行的广泛性和致病后果，与乙肝一起，被专家称为比艾滋病还要严重的疾病。
HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，可分为6个基因型及11种以上不同亚型。HCV进入人体后，与宿主染色体整合，宿主可以重复感染不同的基因型或亚型。HCV目前尚不能用常规方法培养，也没有疫苗和特效药物，控制其流行以预防为主。
鉴于丙型肝炎对人民健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题，我国卫生部和中华医学会于2004年3月推出了《丙型肝炎防治指南》，几乎同时，美国也发布了《丙型肝炎诊断处理和治疗指南》。
《指南》指出目前国内外广泛使用的主流试剂是第三代抗-HCV酶联免疫检测试剂，其基本原理为采用基因工程重组表达的丙肝病毒特异性抗原(Core、E2、NS3、NS4、NS5)包被酶联板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG(抗r链)单克隆抗体为示踪物，TMB显色系统，间接ELISA方法检测人血清或血浆中的丙肝病毒IgG抗体。适用于辅助丙型肝炎和筛查丙型肝炎病毒感染者。具有灵敏度高，特异性强，操作简便，加样变色，反应快速，反应模式好、重复性好等优点。试剂盒中阳性对照为人HCV阳性血清，材料来源受限，且虽已进行灭活处理仍有潜在的生物危害风险，需按传染性污染物处理。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照及其制备方法与应用。解决阳性对照材料的来源受限并避免使用人血清潜在的风险。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照，所述阳性对照由鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体按2:1-1:32的比例混合制成，优选1:4。
所述鼠抗HCV抗体，为可与HCV病毒发生免疫学反应的鼠源IgG抗体，该抗体可以是基因工程表达、化学修饰、通过免疫小鼠、融合后细胞培养等多种途径获得。
所述抗鼠IgG抗体，为可与鼠源IgG抗体发生免疫学反应的抗体，该抗体可以是基因工程表达、化学修饰、通过免疫小鼠、融合后细胞培养等多种途径获得。
进一步地，所述鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体利用免疫学方法制备。
更进一步地，所述阳性对照的制备方法包括如下步骤：
(1)制备鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体；
(2)阳性对照的获得：取鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释作为阳性对照。
作为优选，所述步骤(2)取鼠抗HCV抗体1mg和抗鼠IgG抗体4mg混合并加入50ml小牛血清和10ml 10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
所述鼠抗HCV抗体可为单抗或多抗，在本发明的具体实施方式中，优选所述鼠抗HCV抗体为鼠抗HCV单抗。由于单抗与多抗相比，批间差小，更有利于质控，制备的试剂盒更稳定。
所述抗鼠IgG抗体可为单抗或多抗，在本发明的具体实施方式中，优选所述抗鼠IgG抗体为兔抗鼠IgG多抗。
本发明还提供了含有前述阳性对照的丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括：阴性对照、包被板、酶标二抗、样品稀释液、洗液等常规试剂盒的组成成分。
作为优选，试剂盒组成：
试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存
说明书 1份 1份
封板膜 2片(48) 2片(96)
密封袋 1个 1个
酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
阴性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
阳性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶标试剂 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
样品稀释液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
显色剂A液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
显色剂B液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
浓缩洗涤液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存
作为优选，所述阳性对照的浓度为0.5mg/ml。
本发明还提供了前述阳性对照在制备丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒中的应用。
利用免疫学方法制备鼠抗HCV的单抗或多抗和兔抗鼠IgG的单抗或多抗，按照一定比例加入混合在一起作为阳性对照，在试剂检测中可形成HCVAg-鼠抗HCV-兔抗鼠-鼠抗人IgG-HRP复合物，替代HCVAg-人抗HCV-鼠抗人IgG-HRP复合物解决阳性对照材料的来源并避免使用人血清潜在的风险。
本发明的有益效果在于：
本发明利用免疫学方法制备鼠抗HCV的单抗或多抗和兔抗鼠IgG的单抗或多抗，按照一定比例加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用人血清潜在的风险。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照
1、鼠抗HCV单抗的获得
以HCV病毒基因工程抗原(含有HCV病毒Core、NS3、NS4、NS5、E2等基因编码的蛋白)作为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，然后用有限稀释方法获得可分泌红细胞单抗的杂交瘤。具体步骤如下：
取0.2mg/ml的HCV病毒基因工程抗原，初次免疫采用皮下多点注射，0.1ml/点，共四点。2周后第二次免疫，剂量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，剂量同上，腹腔注射(5～7天后采血测其效价)。再过2～3周后加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射。最后一次加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取1×107脾淋巴细胞悬液备用，准备融合。
将6～10周大的BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75％酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min，用20％小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数至1×107/ml，加入96孔板，100μl/孔放入37℃CO2孵箱培养，制得饲养细胞。
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37℃预温的1ml45％PEG(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动，37℃水浴作用90s，加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，离心，800rpm,6min。弃上清，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬细胞。将上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养，完成融合。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。最后进行有限稀释得到单克隆：克隆前1天制备饲养细胞层(同上)；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，计数，调整细胞为3～10个细胞/ml；取头天准备的有饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl，孵育于37℃、5％CO2孵箱中；在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。挑取效价高于8×107的特异性单克隆冻存，并复苏传代，挑取稳定的细胞株冻存备用。
腹水的制备：是先注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠腹腔，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获2～5ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到2～5mg/ml。
单克隆抗体的纯化：将蛋白A-Sepharose置于50倍体积的Tris缓冲液(pH8.6)中(超过介质50倍v/v)，充分溶胀，在室温下将其装入直径2.5cm的玻璃层析柱中，用Tris缓冲液洗以平衡；腹水样品经三倍体积Tris缓冲液稀释后，以1-5ml/min速度上样，用Tris缓冲液洗至未结合的蛋白全被洗脱(以A280进行监测)；依次用柠檬酸缓冲液、乙酸盐缓冲液以及甘氨酸--HCl缓冲液连续洗脱结合蛋白；将分部收集的洗脱的蛋白直接装入有中和缓冲液的试管中(所加有的中和缓冲液应为洗脱液的1/4体积)；用超滤器浓缩所得的单克隆抗体至1-5mg/ml，将浓缩的抗体置-20℃储存。
2、兔抗鼠IgG的多抗的制备
纯化后的鼠IgG对生理水透析后，取0.1mg与等体积福氏完全佐剂混和，用乳化器完全乳化，背部皮下多点免疫2Kg左右兔子一只，三周后，改用福氏不完全佐剂，0.1mg鼠IgG背部皮下再次免疫，第二次免疫4周后，取0.2mg鼠IgG耳静脉加强免疫，10天后从耳静脉取血，免疫扩散法测抗体效价，若效价大于32，则从颈动脉采血，获得鼠IgG多抗血清，若效价小于32，两周后再用同剂量鼠IgG加强免疫，直至获得满意效价。
3、鼠抗HCV的单抗和兔抗鼠IgG多抗混合阳性对照的获得：取鼠抗HCV的单抗1mg和兔抗鼠IgG的多抗4mg混合并加入50ml小牛血清和10ml 10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
4、阳性对照的使用：
在使用丙型肝炎间接法酶免诊断试剂检测时直接使用。
实施例2 丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒
利用实施例1得到的无害化阳性对照制备丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒，组成如下：
试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存
说明书 1份 1份
封板膜 2片(48) 2片(96)
密封袋 1个 1个
酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
阴性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
阳性对照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
酶标试剂 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
样品稀释液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
显色剂A液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
显色剂B液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
浓缩洗涤液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存
在试剂盒生产中阳性对照采用人HCV抗体阳性血清经灭活和稀释而制成，这种血清只能来源于HCV病毒感染者，由于需要保持抗体活性，不允许采用灭活效果好的高温高压或化学试剂灭活，所以在制备、运输和使用过程中存在生物安全问题，不仅对直接接触者和环境有风险，而且有人源病原体感染、传播、扩散的风险，大多数厂家的试剂盒说明书均对该问题进行了强调。
本申请采用严格检验的实验动物进行抗体制备，从源头上保障了生物安全性，这些来源于实验动物的抗体制成的阳性对照不存在生物危害风险，同时，和从HCV病毒感染者身体内采集相比较来源更广泛，抗体效价更高，完全可以满足试剂盒中作为阳性对照的需要。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种用于丙型肝炎酶联免疫诊断的无害化阳性对照，其特征在于，所述阳性对照由鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体按1:4的比例混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释制成；所述鼠抗HCV抗体为鼠抗HCV单抗；所述抗鼠IgG抗体为兔抗鼠IgG多抗。
2.根据权利要求1所述的阳性对照，其特征在于，所述鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体利用免疫学方法制备。
3.根据权利要求1或2所述的阳性对照，其特征在于，所述阳性对照的制备方法包括如下步骤：
(1)制备鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体；
(2)阳性对照的获得：取鼠抗HCV抗体1mg和抗鼠IgG抗体4mg混合并加入50ml小牛血清和10ml 10％的硫柳汞后用生理盐水稀释至1000ml作为阳性对照。
4.含有权利要求1-3任一项所述阳性对照的丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照、包被板、酶标二抗、样品稀释液和洗液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的浓度为0.5mg/ml。
7.权利要求1-3任一项所述阳性对照在制备丙型肝炎酶联免疫诊断试剂盒中的应用。
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