ES2020152T3 - Diagnosticos y vacunas para nanbv. - Google Patents

Diagnosticos y vacunas para nanbv.

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ES2020152T3 ES90302866T ES90302866T ES2020152T3 ES 2020152 T3 ES2020152 T3 ES 2020152T3 ES 90302866 T ES90302866 T ES 90302866T ES 90302866 T ES90302866 T ES 90302866T ES 2020152 T3 ES2020152 T3 ES 2020152T3
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Abstract

UN NUEVO VIRUS, EL DE LA HEPATITIS C (HCV) QUE HA DEMOSTRADO SER EL MAYOR AGENTE ETIOLOGICO DE NANBH LLEVADO EN LA SANGRE FUE DESCUBIERTO POR EL APLICANTE. EL TRABAJO INICIAL SOBRE ESTE VIRUS, EL CUAL INCLUYE UNA SECUENCIA PARCIAL GENOMICA DEL PROTOTIPO AISLADO HCV ES DESCRITO EN LA UB..EPO N 3L8210 Y EN LA PUB. PCT N WO/89/04669. LA PRESENTE INVENCION QUE EN PARTE ESTA BASADA EN LOS NUEVOS POLIPEPTIDOS Y SECUENCIAS DE HCV QUE NO SON DESVELADOS EN LAS PUBLICACIONES YA MENCIONADAS INCLUYE LA APLICACION DE ESTAS NUEVAS SECUENCIAS Y POLIPEPTIDOS ENINMUNOENSAYOS, DIAGNOSTICOS SONDA, PRODUCCION DE ANTICUERPOS ANTI-HCV, TECNOLOGIA PCR Y TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE. INCLUIDOS EN LA INVENCION ESTAN TAMBIEN LOS NUEVOS POLIPEPTIDOS INMUNOGENICOS ENCODIFICADOS CON CLONES QUE CONTIENEN CDNA HCV, NUEVOS METODOS PARA PURIFICAR UN POLIPEPTIDO HCVINMUNOGENICO Y POLINUCLEOTICOS ANTI-SENSACION DERIVADOS DEL CDNA HCV.

Description

Diagnósticos y vacunas para NANBV.
Campo técnico
La invención se refiere a materiales y metodologías para controlar la propagación de la infección por el virus de la hepatitis No A, No B (NANBV). Más específicamente, se refiere a polinucleótidos derivados del genoma de un agente etiológico de NANBH, el virus de la hepatitis C (HCV), a polipéptidos allí codificados, y a anticuerpos dirigidos a los polipéptidos. Estos reactivos son útiles como agentes detectores de HCV y su infección, y como agentes protectores contra la enfermedad.
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Patente De EE.UU. Nº 4.466.917
Patente De EE.UU. Nº 4.472.500
Patente De EE.UU. Nº 4.491.632
Patente De EE.UU. Nº 4.493.890
Técnica anterior
La hepatitis No-A, No-B (NANBH) es una enfermedad o una familia de enfermedades de transmisión que se creen inducidas por virus, y que se distinguen de otras formas de enfermedad hepática inducida por virus, incluyendo aquellas causadas por los virus de la hepatitis conocidos, esto es, virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), y virus de la hepatitis D (HDV), al igual que la hepatitis inducida por citomegalovirus (CMV) o virus de Epstein-Barr (EBV). NANBH se identificó por primera vez en individuos que habían sufrido una transfusión. La transmisión del hombre al chimpancé y el paso en serie en chimpancés evidenció que NANBH se debe a un agente o agentes infecciosos transmisibles.
La evidencia epidemiológica sugiere que puede haber tres tipos de NANBH: el tipo de epidemia transmitida por agua; el tipo asociado a sangre o aguja; y el tipo que ocurre de forma esporádica (adquirido por la comunidad). Sin embargo, se desconoce el número de agentes que pueden causar NANBH.
El diagnóstico y la identificación clínicos de NANBH se ha logrado fundamentalmente por exclusión de otros marcadores virales. Entre los procedimientos usados para detectar supuestos antígenos y anticuerpos de NANBV están la difusión agar-gel, la contrainmunoelectroforesis, el microscopio de inmunofluorescencia, el microscopio de inmuno electrones, el radioinmunoensayo, y el ensayo de inmunoabsorción asociado a enzima. Sin embargo, ninguno de estos ensayos ha resultado ser suficientemente sensible, específico, y reproducible para usarse como prueba de diagnóstico para NANBH.
Anteriormente no había ni claridad ni acuerdo en cuanto a la identidad o especificidad de los sistemas antígeno anticuerpo asociados con agentes de NANBH. Esto se debía, al menos en parte, a la infección anterior o al mismo tiempo de HBV con NANBV en individuos, y a la conocida complejidad de los antígenos solubles y particulados asociados con HBV, al igual que a la integración del ADN de HBV en el genoma de células hepáticas. Además, existe la posibilidad de que NANBH esté provocada por más de un agente infeccioso, al igual que la posibilidad de que NANBH haya sido mal diagnosticada. Por otra parte, no está claro qué es lo que los ensayos serológicos detectan en el suero de pacientes con NANBH. Se ha postulado que los ensayos de difusión agar-gel y contrainmunoelectroforesis detectan respuestas autoinmunes o interacciones proteicas no específicas que a veces ocurren entre muestras de suero, y que no representan reacciones antígeno-anticuerpo específicas para NANBV. La inmunofluorescencia, y la inmunoabsorción asociada a enzima, y los radioinmunoensayos parecen detectar bajos niveles de un material parecido al factor reumatoide que se encuentra frecuentemente en el suero de pacientes con NANBH al igual que en pacientes con otras enfermedades hepáticas y no hepáticas. Parte de la reactividad detectada puede representar un anticuerpo a antígenos citoplásmicos determinados por el huésped.
Han existido varios NANBV candidatos. Véase, por ejemplo las publicaciones de Prince (1983), Feinsone y Hoofnagle (1984), y Overby (1985, 1986, 1987) y el artículo de Iwarson (1987). Sin embargo, no existe prueba de que ninguno de estos candidatos represente el agente etiológico de NANBH.
La demanda de procedimientos sensibles y específicos para detectar e identificar portadores de NANBV y sangre contaminada por NANBV o productos sanguíneos es significativa. La hepatitis post-transfusión (PTH) se produce en aproximadamente el 10% de pacientes que han sufrido una transfusión, y NANBH representa hasta el 90% de estos casos. El mayor problema en esta enfermedad es la progresión frecuente al daño hepático crónico (25-55%).
El cuidado de los pacientes al igual que la prevención de la transmisión de NANBH por sangre o productos sanguíneos o por contacto personal estrecho requiere unas herramientas para la detección, diagnóstico y prognosis que sean fiables para detectar ácidos nucleicos, antígenos y anticuerpos relacionados con NANBV. Además, también son necesarios vacunas y agentes terapéuticos e inmunoterapéuticos efectivos para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad.
El solicitante descubrió un nuevo virus, el virus de la Hepatitis C (HCV), que ha demostrado ser el mayor agente etiológico de NANBH transmitida por sangre (BB-NANBH). El trabajo inicial del solicitante, incluyendo una secuencia genómica parcial del aislado de HCV prototipo, CDC/HCV1 (también llamado HCV1), se describe en EPO Publicada Nº 318.216 (publicada el 31 de mayo de 1989) y PCT Publicada Nº WO/8904669 (publicada el 1 de junio de 1989). Las exposiciones de estas solicitudes de patentes, al igual que cualquier solicitud de patente nacional correspondiente, se incorporan a la presente memoria descriptiva como referencia. Estas solicitudes enseñan, entre otras cosas, procedimientos de ADN recombinante para clonar y expresar secuencias de HCV, polipéptidos de HCV, técnicas de inmunodiágnostico de HCV, técnicas de diagnóstico con sonda de HCV, anticuerpos anti-HCV, y procedimientos para aislar nuevas secuencias de HCV, incluyendo secuencias de aislados de HCV nuevos.
Exposición de la invención
La presente invención se basa, en parte, en nuevas secuencias y polipéptidos de HCV que no se desvelan en la EPO Publicada Nº 318.216, o en la PCT Publicada Nº WO89/04669. Incluida en la invención está la solicitud de estas nuevas secuencias y polipéptidos en, entre otras cosas, inmunodiagnósticos, diagnósticos por sonda, producción de anticuerpos anti-HCV, tecnología PCR y tecnología de ADN recombinante. También incluidos en la invención hay nuevos inmunoensayos que se basan en la inmunogenicidad de polipéptidos HCV que se exponen en el presente documento. El nuevo tema según el presente documento, al desarrollarse usando técnicas que se describen en, por ejemplo, la EPO Publicada Nº 318,216, tiene una fecha prioritaria que antecede esa publicación, para cualquier homólogo del mismo. Así, la invención aporta nuevas composiciones y procedimientos útiles para detectar muestras para antígenos y anticuerpos de HCV, y útiles para el tratamiento de infecciones por HCV.
En consecuencia, un aspecto de la invención se basa en la caracterización de polinucleótidos recombinantes que comprenden secuencias derivadas del ADNc del HCV, en los que el ADNc del HCV está en el clon 13i, o en el clon 26j, o en el clon 59a, o en el clon 84a, o en el clon CA156e, o en el clon 167b, o en el clon pi14a, o en el clon CA216a, o en el clon CA290a, o en el clon ag30a, o en el clon 205a, o en el clon 18g, o en el clon 16jh, o en el que el ADNc del HCV es de una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 en la Figura 17.
Otro aspecto de la invención se basa en la caracterización de polipéptidos purificados que comprenden un epítopo codificado dentro del ADNc del HCV en el que el ADNc del HCV es de una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 en la Figura 17.
En consecuencia, la presente invención aporta un polipéptido en una forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia contigua de una poliproteína de un virus de la Hepatitis C (HCV) de al menos 10 aminoácidos en el que dicha secuencia contigua es de aminoácidos 1 a 449 de una poliproteína de HCV, en el que el HCV se caracteriza por:
a.
genoma de ARN de cadena positiva:
dicho genoma comprende un marco de lectura libre (ORF) que codifica una poliproteína; y
la totalidad de dicha poliproteína codificada tiene al menos un 40% de homología con el total de la poliproteína seleccionada de entre (i) la poliproteína tal como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado vírico del genoma del cual se preparó ADNc depositado en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección De EE.UU. de Cultivos Tipo (ATCC) según el Registro Nº 40394.
Preferentemente, la secuencia contigua es:
a.
aminoácidos 1 a 84 de HCV;
b.
aminoácidos 9 a 177 de HCV;
c.
un fragmento inmunológicamente reactivo de los anteriores (a) o (b).
El fragmento inmunológicamente reactivo puede ser de aminoácidos 1 a 50, 35 a 45, 50 a 100, 40 a 90, 65 a 75, 80 a 90, 99 a 120, 95 a 110 ó 100 a 150 de la poliproteína del HCV.
Además, otro aspecto de la invención se refiere a polipéptidos inmunogénicos producidos por una célula transformada con un vector de expresión recombinante que comprende un ORF de ADN derivado del ADNc del HCV, en el que el ADNc del HCV se compone de una secuencia derivada de la secuencia de ADNc del HCV en el clon CA279a, o el clon CA74a, o el clon 13i, o el clon CA290a, o el clon 33C o el clon 40b, o el clon 33b, o el clon 25c, o el clon 14c, o el clon 8f, o el clon 33f, o el clon 33g, o el clon 39c, o el clon 15e, y en el que ORF está unido de forma operativa a una secuencia control compatible con un huésped deseado.
Otro aspecto de la invención es un polipéptido en el que la secuencia contigua tiene la fórmula
AA_{x}-AA_{y}
en el que x e y designan números de aminoácidos que se muestran en la Figura 17, y en el que el péptido se selecciona de entre un grupo que consiste de AA1-AA35, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177, AA1-AA10, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA45-AA65, AA65-AA75, AA80-AA90, AA99-AA120, AA95-AA110, AA105-AA120, AA100-AA150, AA150-AA200, AA155-AA170, AA190-AA210, AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250-AA300, AA290-AA330, AA290-305, AA300-AA350, AA310-AA330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA405-AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA440-AA460.
La invención además se refiere a segmentos de polinucleótidos para el HCV, en particular segmentos compuestos de una secuencia de HCV derivada de una secuencia de ADNc del HCV indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 en la Figura 17, o del complemento de la secuencia de ADNc del HCV. Así la invención aporta un polinucleótido vírico recombinante o purificado que comprende una secuencia genómica del HCV o el complemento de la misma que se puede hibridar selectivamente a nucleótidos -319 a 1348 del genoma de HCV o el complemento del
mismo.
La invención también aporta un equipo para analizar muestras para la presencia de polinucleótidos del HCV, los cuales equipos comprenden un segmento de polinucleótido de la invención en un contenedor apropiado.
Otro aspecto de la invención es un equipo para analizar muestras para la presencia de un antígeno del HCV que comprende un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con un antígeno del HCV de la invención, tal como un antígeno que contiene un epítopo codificado dentro del ADNc del HCV que es de una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 en la Figura 17, o en el que el ADNc del HCV está en el clon 13i, o en el clon 26j, o en el clon 59a, o en el clon 84a, o en el clon CA156e, o en el clon 167b, o en el clon pi14a, o en el clon CA216a, o en el clon CA290a, o en el clon ag30a, o en el clon 205a, o en el clon 18g, o en el clon 16jh.
Además otro aspecto de la invención es un equipo para analizar muestras para la presencia de un anticuerpo del HCV que comprende un polipéptido antigénico que contiene un epítopo del HCV de la invención tal como un epítopo codificado dentro del ADNc del HCV que tiene una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 en la Figura 17, o está en el clon 13i, o en el clon 26j, o en el clon 59a, o en el clon 84a, o en el clon CA156e, o en el clon 167b, o en el clon pi14a, o en el clon CA216a, o en el clon CA290a, o en el clon ag30a, o en el clon 205a, o en el clon 18g, o en el clon 16jh.
Otro aspecto de la invención es un equipo para el análisis de muestras para la presencia de un anticuerpo del HCV que comprende un polipéptido antigénico de la invención tal como el polipéptido que se expresa del ADNc del HCV en el clon CA279a, o en el clon CA74a, o en el clon 13i, o en el clon CA290a, o en el clon 33C o en el clon 40b, o en el clon 33b, o en el clon 25c, o en el clon 14c, o en el clon 8f, o en el clon 33f, o en el clon 33g, o en el clon 39c, o en el clon 15e, en el que el polipéptido antigénico está presente en un contenedor apropiado.
Todavía otro aspecto de la invención es un procedimiento para detectar ácidos nucleicos del HCV en una muestra que comprende:
(a) ácidos nucleicos reactivos de la muestra con un segmento de polinucleótido para HCV, en el que el segmento está compuesto de una secuencia de HCV de la invención, en el que la reacción se realiza en condiciones que permiten la formación de un dúplex de polinucleótido entre el segmento y el ácido nucleico del HCV de la muestra; y (b) se detecta un dúplex de polinucleótido que contiene el segmento, formado en el paso (a).
Aún otro aspecto de la invención es un inmunoensayo para detectar un antígeno del HCV que comprende:
(a) la incubación de una muestra sospechosa de contener un antígeno del HCV con un anticuerpo dirigido contra un epítopo del HCV codificado en el ADNc del HCV, en el que el ADNc del HCV es de una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 ó 8659 a 8866 en la Figura 17, o es la secuencia presente en el clon 13i, o en el clon 26j, o en el clon 59a, o en el clon 84a, o en el clon CA156e, o en el clon 167b, o en el clon pi14a, o en el clon CA216a, o en el clon CA290a, o en el clon ag30a, o en el clon 205a, o en el clon 18g, o en el clon 16jh, y en el que la incubación se realiza en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; y (b) la detección de un complejo anticuerpo-antígeno formado en el paso (a) que contiene el anticuerpo.
Todavía otro aspecto de la invención es un inmunoensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra un antígeno del HCV que comprende:
(a) la incubación de una muestra sospechosa de contener anticuerpos anti-HCV con un polipéptido antigénico que contiene un epítopo codificado en el ADNc del HCv, en el que el ADNc del HCV es de una secuencia indicada por los nucleótidos números -319 a 1348 ó 8659 a 8866 en la Figura 17, o es la secuencia presente en el clon 13i, o en el clon 26j, o en el clon 59a, o en el clon 84a, o en el clon CA156e, o en el clon 167b, o en el clon pi14a, o en el clon CA216a, o en el clon CA290a, o en el clon ag30a, o en el clon 205a, o en el clon 18g, o en el clon 16jh, y en el que la incubación se realiza en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; y la detección de un complejo anticuerpo-antígeno formado en el paso (a) que contiene el polipéptido antigénico.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de ADNc del HCV en el clon 12f, y los aminoácidos allí codificados.
La Figura 2 muestra la secuencia de ADNc del HCV en el clon k9-1, y los aminoácidos allí codificados.
La Figura 3 muestra la secuencia del clon 15e, y los aminoácidos allí codificados.
La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon 13i, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con el clon 12f.
La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos de ADNc del HCV en el clon 26j, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con el clon 13i.
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA59a, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con los clones 26j y K9-1.
La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA48a, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con al clon CA59a.
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA156e, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con CA84a.
La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA167b, los aminoácidos allí codificados, y las secuencias que se superponen con CA156e.
La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA216a, los aminoácidos allí codificados, y la superposisión con el clon CA167b.
La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA290a, los aminoácidos allí codificados, y la superposición con el clon CA216a.
La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon ag30a y la superposición con el clon CA290a.
La Figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon CA205a, y la superposición con la secuencia de ADNc del HCV en el clon CA290a.
La Figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon 18g, y la superposición con la secuencia del ADNc del HCV en el clon ag30a.
La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del HCV en el clon 16jh, los aminoácidos allí codificados, y la superposición de nucleótidos con la secuencia de ADNc del HCV en el clon 15e.
La Figura 16 muestra el ORF del ADNc del HCV derivado de los clones pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, y
15e.
La Figura 17 muestra la cadena de sentido de la secuencia de ADNc del HCV compilada derivada de los clones descritos arriba y la secuencia de ADNc del HCV compilada publicada en EPO Publicada Nº 318.216. Los clones de los que se derivó la secuencia son b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (también llamado k9-1), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, y 16jh. En la figura los tres guiones horizontales sobre la secuencia indican la posición del supuesto codón de metionina iniciador; los dos guiones verticales indican el nucleótido primero y último de la secuencia publicada. También se muestra en la figura la secuencia de aminoácido de la supuesta poliproteína codificada en el ADNc del HCV.
La Figura 18 es un diagrama del procedimiento de detección de la colonia inmunológica usado en los estudios de mapeo antigénico.
La Figura 19 muestra los perfiles de hidrofobicidad de las poliproteínas codificadas en el HCV y en el virus West Nile.
La Figura 20 es una traza del perfil de hidrofilicidad/hidrofobicidad y del índice antigénico de la supuesta poliproteína del HCV.
La Figura 21 muestra los péptidos co-lineales conservados en el HCV y en los Flavivirus.
Formas de llevar a cabo la invención I. Definiciones
El término "virus de la hepatitis C" lo han reservado las personas que trabajan en este campo para un agente etiológico de NANBH hasta el momento desconocido. En consecuencia, tal como aquí se usa, "virus de la hepatitis C" (HCV) se refiere a un agente que causa NANBH, al que antes se llamaba NANBV y/o BB-NANBV. Los términos HCV, NANBV, y BB-NANBV se usan de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva. Como extensión de esta terminología, la enfermedad causada por HCV, antes llamada hepatitis NANB (NANBH), se llama hepatitis C. Los términos NANBH y hepatitis C se pueden usar de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva.
El término "HCV", como aquí se usa, denota una especie vírica cuyas cadenas patógenas causan NANBH, y cadenas atenuadas o partículas defectuosas que interfieren derivadas de las mismas. Como se muestra más adelante, el genoma de HCV está formado por ARN. Se sabe que los virus que contienen ARN tienen tasas relativamente altas de mutación espontánea, esto es, según se informa del orden de 10^{-3} a 10^{-4}por nucleótido incorporado (Fields y Knipe (1986)). Por lo tanto, hay múltiples cadenas, que pueden ser virulentas o no virulentas, entre las especies de HCV que se describen más adelante Las composiciones y procedimientos que aquí se describen, permiten la propagación, identificación, detección, y aislamiento de las diversas cadenas o aislados de HCV. Además, la presente exposición permite la preparación de diagnósticos y vacunas para las diversas cadenas, al igual que composiciones y procedimientos que tienen utilidad en los procedimientos de detección para agentes anti-virales para uso farmacológico, como agentes que inhiben la replicación del HCV.
La información que aquí se aporta, aunque se deriva de la cadena o aislado prototipo de HCV, a la que en adelante se hará referencia como CDC/HCV1 (también llamada HCV1), es suficiente para permitir a un taxonomista vírico identificar otras cadenas que se encuentran en las especies. La información que aquí se aporta permite creer que el HCV es un virus del tipo Flavi. Se conoce la morfología y composición de las partículas de Flavivirus, y se discuten en Brinton (1986). En general, con respecto a la morfología, los Flavivirus contienen una nucleocápside central rodeada por una membrana lipídica. Los viriones son esféricos y tienen un diámetro de 40-50 nm. Sus núcleos tienen aproximadamente 25-30 nm de diámetro. A lo largo de la superficie externa de la envoltura del virión hay proyecciones de aproximadamente 5-10 nm de longitud con protuberancias terminales de aproximadamente 2 nm de diámetro.
Se espera que diferentes cadenas o aislados de HCV contengan variaciones en los aminoácidos y ácidos nucleicos en comparación con el aislado prototipo, HCV1. Se espera que muchos aislados muestren mucha (esto es, más de aproximadamente el 40%) homología en la secuencia de aminoácidos total en comparación con HCV1. Sin embargo, también se pueden encontrar otros aislados de HCV menos homólogos. Esto se definiría como cadenas de HCV de acuerdo con varios criterios, como un ORF de aproximadamente 9.000 nucleótidos a aproximadamente 12.000 nucleótidos, codificando una poliproteína similar en tamaño a la de HCV1, una poliproteína codificada de carácter hidrófobo y antigénico similar a los del HCV1, y la presencia de secuencias de péptido co-linear que se conservan con el HCV1. Además, el genoma sería un ARN de cadena positiva.
El HCV codifica al menos un epítopo que es identificable inmunológicamente con un epítopo en el genoma del HCV del que se derivan los ADNc aquí descritos; preferentemente el epítopo contiene una secuencia de aminoácidos aquí descrita. El epítopo es único para el HCV cuando se compara con otros Flavivirus conocidos. La calidad de único del epítopo se puede determinar por su reactividad inmunológica con anticuerpos anti-HCV y su falta de reactividad inmunológica con anticuerpos para otras especies de Flavivirus. Los procedimientos para determinar la reactividad inmunológica se conocen en la técnica, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo, mediante ensayo Elisa, por hemaglutinación, y diversos ejemplos de técnicas apropiadas para ensayos que se aportan en la presente memoria descriptiva.
Además de lo anterior, son aplicables los siguientes parámetros de homología de ácido nucleico y homología de aminoácido, bien solos o en combinación, para identificar una cadena o aislado de HCV. Ya que las cadenas y aislados de HCV están relacionadas en cuanto a la evolución, se espera que la homología global de los genomas al nivel del nucleótido probablemente será de aproximadamente el 40% o mayor, probablemente aproximadamente el 60% o mayor, y todavía más probablemente aproximadamente el 80% o mayor; y que además habrá secuencias contiguas correspondientes de al menos 13 nucleótidos. La correspondencia entre la supuesta secuencia genómica de la cadena de HCV y la secuencia de ADNc de CDC/HCV1 se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden determinar mediante comparación directa de la información de la secuencia del polinucleótido del supuesto HCV, y la(s) secuencia(s) de ADNc de HCV aquí descrita(s). Por ejemplo, también se pueden determinar mediante hibridación de los polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre regiones homólogas (por ejemplo, aquellas que se usarían antes de la digestión de S_{1}), seguido de digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena sencilla, seguido de la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.
Debido a la relación evolutiva de las cadenas y aislados de HCV, las supuestas cadenas o aislados de HCV se pueden identificar por su homología a nivel de polipéptido. Generalmente, se espera que las cadenas y aislados de HCV sean homólogos en más del 40%, probablemente en más del 70%, y todavía más probablemente en más del 80%, y algunos pueden ser homólogos incluso en más de aproximadamente el 90% a nivel de polipéptido. Las técnicas para determinar la homología de la secuencia de aminoácidos se conocen en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido se puede determinar directamente y compararse con las secuencias que se aportan en la presente memoria descriptiva. De forma alternativa se puede determinar la secuencia de nucleótido del material genómico del supuesto HCV (normalmente por medio de un ADNc intermedio), se puede determinar la secuencia de aminoácido allí codificada, y se pueden comparar las regiones correspondientes.
Como se usa aquí, un polinucleótido "derivado de" una secuencia designada se refiere a una secuencia de polinucleótido compuesta por una secuencia de al menos 10-12 nucleótidos, y preferentemente al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos que corresponden a una región de la secuencia de nucleótido designada. "Que corresponde" significa que es homólogo o complementario con la secuencia designada. Preferentemente, la secuencia de la región de la que se deriva el polinucleótido es homóloga o complementaria de una secuencia que es única para un genoma de HCV. El que una secuencia sea única o no para un genoma de HCV se puede determinar mediante procedimientos conocidos para aquellos con destreza en la técnica. Por ejemplo, la secuencia se puede comparar con secuencias de bancos de datos, por ejemplo, Genebank, para determinar si está presente en el huésped no infectado o en otros organismos. La secuencia también se puede comparar con las secuencias conocidas de otros agentes víricos, incluyendo aquellos que se sabe que causan hepatitis, por ejemplo, HAV, HBV, y HDV, y con otros miembros de los Flaviviridae. También se puede determinar la correspondencia o no correspondencia de la secuencia derivada con otras secuencias mediante hibridación en condiciones de rigor apropiadas. Las técnicas de hibridación para determinar la complementariedad de las secuencias de ácido nucleico se conocen en la técnica, y se discuten más adelante Véase también, por ejemplo, Maniatis y col. (1982). Además, se puede determinar la falta de complementariedad de dúplex de polinucleótidos formados por hibridación mediante técnicas conocidas, incluyendo por ejemplo, la digestión con una nucleasa como S1, que específicamente digiere áreas de cadena sencilla en dúplex de polinucleótidos. Las regiones de las que se pueden "derivar" secuencias típicas de ADN incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, regiones que codifican epítopos específicos, al igual que regiones no transcritas y/o no traducidas.
El polinucleótido derivado no necesariamente se deriva físicamente de la secuencia de nucleótido mostrada, pero se puede generar de cualquier manera, incluyendo por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción inversa o transcripción. Además, se pueden modificar combinaciones de regiones que corresponden a aquellas de la secuencia designada de formas conocidas en la técnica para que concuerden con un uso intencionado.
De manera semejante, una secuencia de polipéptido o aminoácido "derivada de" una secuencia de ácido nucleico designada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una porción de la misma en la que la porción consiste en al menos 10 aminoácidos, y todavía más preferentemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es identificable inmunológicamente con un polipéptido codificado en la secuencia.
No es necesario traducir un polipéptido recombinante o derivado de una secuencia de ácido nucleico designada, por ejemplo, las secuencias de ADNc del HCV aquí descritas, o de un genoma de HCV; se puede generar de cualquier manera, incluyendo por ejemplo, síntesis química, o expresión de un sistema de expresión recombinante, o aislamiento de HCv mutado. Un polipéptido recombinante o derivado puede incluir uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no naturales en su secuencia. Se conocen en la técnica procedimientos para insertar análogos de aminoácidos en una secuencia. También puede incluir uno o más marcadores, que aquellos con destreza en la técnica conocen.
El término "polinucleótido recombinante" tal como se usa aquí supone un polinucleótido de origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con el total o una porción de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido diferente de aquel al que está unido en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza.
El término "polinucleótido" como aquí se usa se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, bien ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. Este término sólo se refiere a la estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye ADN de cadena doble o sencilla, al igual que ARN de cadena doble o sencilla. También incluye tipos de modificaciones conocidas, por ejemplo, marcadores conocidos en la técnica, metilación, remates, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquellas con uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, triésteres de fósforo, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, tioatos de fósforo, ditioatos de fósforo, etc.), aquellos que contienen mitades colgantes, como, por ejemplo, proteínas (incluyendo por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), al igual que formas no modificadas del polinucleótido.
"Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros términos semejantes que denotan microorganismos o líneas celulares eucarióticas mayores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como recipientes para vectores recombinantes u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se entiende que la progenie de una célula parental única no necesariamente tiene que ser completamente idéntica en morfología o en genoma o en complemento de ADN total al progenitor original, debido a mutaciones naturales, accidentales, o deliberadas.
Un "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc. que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o expresión del segmento unido.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y terminadores; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en ocasiones, estimulantes. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura libre" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
"Identificable inmunológicamente con/como" se refiere a la presencia de epitopo(s) y polipéptido(s) que también están presentes en el(los) polipéptido(s) designados, normalmente proteínas de HCV. La identidad inmunológica se puede determinar mediante unión de anticuerpos y/o competición en la unión; estos procedimientos los conocen aquellos con destreza media en la técnica, y también se ilustran más adelante.
Como aquí se usa, "epitopo" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido; un epitopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epitopo, generalmente un epitopo consiste de al menos 5 de tales aminoácidos, y más habitualmente, consiste de al menos 8-10 de tales aminoácidos. En la técnica se conocen procedimientos para determinar la conformación espacial de aminoácidos, e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.
Un polipéptido es "inmunológicamente reactivo" con un anticuerpo cuando se une a un anticuerpo debido a que el anticuerpo reconoce un epitopo específico contenido dentro del polipéptido. Se puede determinar la reactividad inmunológica mediante unión de anticuerpos, más particularmente mediante la cinética de la unión de anticuerpos, y/o mediante competencia en la unión usando como competidor(es) un(os) polipéptido(s) conocido(s) que contiene(n) un epitopo contra el que se dirige el anticuerpo. Los procedimientos para determinar si un polipéptido es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo se conocen en la técnica.
Como aquí se usa, el término "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que provoca una respuesta celular y/o humoral, bien solo o unido a un portador en presencia o ausencia de coadyuvante.
El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; así, se incluyen péptidos, oligopéptidos, y proteínas dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere a ni excluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y otros. Incluidos en la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con uniones sustituidas, al igual que otras modificaciones conocidas en la técnica, que ocurren tanto de forma natural como no
natural.
"Transformación", como aquí se usa, se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, sin importar el procedimiento usado para la inserción, por ejemplo, absorción directa, transducción, acoplamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente, se puede integrar en el genoma del huésped.
"Tratamiento" como aquí se usa se refiere a profilaxis y/o terapia.
Un "individuo", como aquí se usa, se refiere a vertebrados, en particular a miembros de las especies de mamíferos, e incluye pero no se limita a animales domésticos, animales dedicados al deporte, y primates, incluyendo humanos.
Como aquí se usa, la "cadena de sentido" de un ácido nucleico contiene la secuencia que posee homología secuencial a la del ARNm. La "cadena anti-sentido" contiene una secuencia que es complementaria a la de la "cadena de sentido".
Como aquí se usa, "un genoma de cadena positiva" de un virus es aquel en que el genoma, bien sea ARN o ADN, es de cadena única y codifica un(os) polipéptido(s) viral(es). Ejemplos de virus con ARN de cadena positiva incluyen a los Togavirus, Coronavirus, Retrovirus, Picornavirus, y Calicivirus. También se incluyen los Flavivirus, que anteriormente se clasificaban como Togavirus. Véase Fields y Knipe (1986).
Como aquí se usa, "componente corporal que contiene anticuerpo" se refiere a un componente del cuerpo de un individuo que es una fuente de los anticuerpos de interés. Los componentes corporales que contienen anticuerpo se conocen en la técnica, e incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, las secciones externas de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células blancas sanguíneas, y mielomas.
Como aquí se usa, "HCV purificado" se refiere a una preparación de HCV que se ha aislado de los componentes celulares con los que el virus suele estar asociado, y de otros tipos de virus que pueden estar presentes en el tejido infectado. Los procedimientos para aislar virus los conocen aquellos con destreza en la técnica, e incluyen, por ejemplo, centrifugación y cromatografía de afinidad; un procedimiento para preparar HCV purificado se discute más adelante.
El término "partículas de HCV" como aquí se usa incluye viriones completos al igual que partículas que son intermedios en la formación de viriones. Las partículas de HCV generalmente tienen una o más proteínas asociadas de HCV con el ácido nucleico del HCV.
Como aquí se usa, el término "sonda" se refiere a un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia en una región objetivo, debido a la complementariedad de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en la región objetivo. La sonda, sin embargo, no contiene una secuencia complementaria de secuencia(s) usada(s) para preparar la reacción en cadena de la polimerasa.
Como aquí se usa, el término "región objetivo" se refiere a una región del ácido nucleico que se va a amplificar y/o detectar.
Como aquí se usa, el término "ARN viral", que incluye ARN de HCV, se refiere a ARN del genoma viral, fragmentos del mismo, transcripciones del mismo, y secuencias mutantes derivadas del mismo.
Como aquí se usa, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un individuo, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, las secciones externas de la piel y de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos, y también muestras de componentes de cultivos celulares in vitro (incluyendo pero sin limitarse a un medio condicionado que resulte del crecimiento de células en un medio de cultivo celular, células supuestamente infectadas por virus, células recombinantes, y componentes celulares).
II. Descripción de la invención
La práctica de la presente invención usará, a no ser que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Dichos procedimientos se explican completamente en la literatura. Véase por ejemplo, Maniatis, Fitsch y Sambrook, MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLÚMENES I Y II (D.N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDATION (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. 1986); IMMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds, respectivamente), Mayer y Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLÚMENES I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds 1986). Todas las patentes, solicitudes de patentes, y publicaciones aquí mencionadas, tanto anteriormente como más adelante, se incorporan a la presente memoria descriptiva como referencia.
Los materiales y procesos útiles de la presente invención son posibles gracias a la aportación de una familia de secuencias de nucleótidos aisladas de librerías de ADNc que contienen secuencias de ADNc de HCV. Estas librerías de ADNc se derivaron de secuencias de ácido nucleico presentes en el plasma de un chimpancé infectado con HCV. La construcción de una de estas librerías, la librería "c" (ATCC Nº 40394), se expuso en EPO Publicada Nº 318.216. Varios de los clones que contenían ADNc de HCV que aquí se exponen se obtuvieron de la librería "c". Aunque otros clones que aquí se exponen se obtuvieron de otras librerías de ADNc de HCV, se confirmó la presencia de clones que contenían las secuencias de la librería "c". Como se expone en la EPO Publicada Nº 318.216, la familia de secuencias de ADNc de HCV aisladas de la librería "c" no son de origen humano o del chimpancé, y no muestran homología significativa con secuencias contenidas en el genoma de HBV.
La disponibilidad de los ADNc de HCV descritos en la presente memoria descriptiva permite la construcción de sondas de polinucleótidos que son reactivos útiles para detectar polinucleótidos virales en muestras biológicas, incluyendo sangre donada. Por ejemplo, a partir de las secuencias es posible sintetizar oligómeros de ADN de aproximadamente 8-10 nucleótidos, o mayores, que son útiles como sondas de hibridación para detectar la presencia de ARN de HCV en, por ejemplo, sangre donada, sueros de sujetos sospechosos de albergar el virus, o sistemas de cultivo celular en los que el virus se está replicando. Además, las secuencias de ADNc también permiten el diseño y producción de polipéptidos específicos de HCV que son útiles como reactivos de diagnóstico para la presencia de anticuerpos producidos durante la infección con HCV. Los anticuerpos de polipéptidos purificados que se derivan de ADNc también se pueden usar para detectar antígenos virales en muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, muestras de sangre donada, sueros de pacientes con NANBH, y en sistemas de cultivo tisulares que se usan para la replicación del HCV. Además, los polipéptidos inmunogénicos que aquí se exponen, que están codificados en porciones del ORF del ADNc de HCV que se muestran en la Figura 17, también son útiles para la detección, diagnóstico y tratamiento de HCV, y para producir anticuerpos que también son útiles para estos propósitos.
Además, las secuencias de ADNc noveles aquí descritas permiten la caracterización del genoma de HCV. Las sondas e iniciadores de polinucleótidos derivados de estas secuencias se pueden usar para amplificar secuencias presentes en librerías de ADNc, y/o para detectar librerías de ADNc para de secuencias de ADNc superpuestas adicionales, las cuales, a su vez, se pueden usar para obtener más secuencias de superposición. Como se indica más adelante y en la EPO Publicada Nº 318,216, el genoma de HCV es ARN compuesto principalmente de un marco de lectura libre (ORF) grande que codifica una poliproteína grande.
Las secuencias de ADNc de HCV que aquí se aportan, los polipéptidos derivados de estas secuencias, y los polipéptidos inmunogénicos que aquí se describen, al igual que los anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos también son útiles en el aislamiento e identificación del agente(s) de NANBV (BB-NANBV) transmitido por sangre. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra los epitopos de HCV contenidos en polipéptidos derivados de los ADNc se pueden usar en procesos basados en cromatografía de afinidad para aislar el virus. De forma alternativa, los anticuerpos se pueden usar para identificar partículas virales aisladas mediante otras técnicas. Los antígenos virales y el material genómico de las partículas virales aisladas también se pueden caracterizar.
Además de lo anterior, la información que se aporta más adelante permite la identificación de cadenas y aislados de HCV adicionales. El aislamiento y caracterización de cadenas o aislados de HCV adicionales se puede conseguir aislando los ácidos nucleicos de componentes corporales que contengan partículas virales y/o ARN viral, creando librerías de ADNc utilizando sondas de polinucleótidos basadas en las sondas de ADNc de HCV descritas más adelante, examinando la librerías para buscar clones que contienen secuencias de ADNc de HCV descritas más adelante, y comparando los ADNc de HCV de los nuevos aislados con los ADNc descritos más adelante. Los polipéptidos allí codificados, o en el genoma viral, se pueden monitorizar para reactividad inmunológica cruzada utilizando los polipéptidos y anticuerpos descritos arriba. Las cadenas o aislados que se ajustan a los parámetros de HCV, tal como se describe en la sección de Definiciones, arriba, se identifican de forma rápida. Otros procedimientos para identificar cadenas de HCV serán obvios para aquellos con destreza en la técnica, basándose en la información que se aporta en la presente memoria descriptiva.
Aislamiento de las Secuencias de ADNc de HCV
Las secuencias de ADNc de HCV noveles descritas más adelante prolongan la secuencia del ADNc al genoma de HCV expuesto en la EPO Publicada Nº 318.216. Las secuencias que están presentes en los clones b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, y CA59a están hacia arriba de la secuencia que se expone, y cuando se compilan, dan los nucleótidos números -319 a 1348 de la secuencia de ADNc de HCV compuesta. (El número negativo en un nucleótido indica su distancia hacia arriba del nucleótido que empieza con el codón MET de iniciación putativo.) La secuencia de ADNc de HCV compuesta que incluye las secuencias en los clones antes mencionados se muestra en la Figura 17.
Los ADNc de HCV noveles aquí descritos fueron aislados de una variedad de librerías de ADNc de HCV, incluyendo la librería "c" presente en lambda gt11 (ATCC Nº 40394). Las librerías de ADNc de HCV se construyeron usando una mezcla de suero de un chimpancé con una infección por HCV crónica y que contiene una elevada proporción del virus, esto es, al menos 10^{6} dosis infecciosas de chimpancé por ml (CID/ml). La mezcla de suero se utilizó para aislar partículas virales; el aislado de ácidos nucleicos de estas partículas se usó como patrón en la construcción de librerías de ADNc del genoma viral. Los procedimientos para aislar las supuestas partículas de HCV y para construir la librería "c" de ADNc de HCV se describen en la EPO Publicada Nº 318.216. Se conocen otros procedimientos para construir librerías de ADNc de HCV en la técnica, y algunos de estos procedimientos se describen más adelante, en los Ejemplos. El aislamiento de las secuencias se realizaba mediante examen de las librerías usando sondas de polinucleótidos sintéticas, cuyas secuencias se derivaban de la región 5' y de la región 3' de la secuencia de ADNc de HCV conocida. La descripción del procedimiento para reparar las secuencias de ADNc es principalmente de interés histórico. Las secuencias resultantes (y sus complementos) se aportan en la presente memoria, y las secuencias, o cualquier porción de las mismas, se podrían preparar usando procedimientos sintéticos, o mediante combinación de procedimientos sintéticos con reparación de secuencias parciales usando procedimientos similares a los descritos en la presente memoria.
Preparación de Polipéptidos y Fragmentos Virales
La disponibilidad de secuencias de ADNc de HCV, o secuencias de nucleótidos derivadas de las mismas (incluyendo segmentos y modificaciones de la secuencia), permite la construcción de vectores de expresión que codifican regiones antigénicamente activas del polipéptido codificado en cualquiera de las cadenas. Estas regiones antigénicamente activas se pueden derivar de antígenos de membrana o envoltura o de antígenos nucleicos, o de antígenos que no son estructurales incluyendo, por ejemplo, proteínas de unión de polinucleótidos, polimerasa(s) polinucleótida(s), y otras proteínas virales necesarias para la replicación y/o ensamblaje de la partícula viral. Los fragmentos que codifican los polipéptidos deseados se derivan de los clones de ADNc usando digestión restrictiva convencional o mediante procedimientos sintéticos, y se unen en vectores que pueden, por ejemplo, contener porciones de secuencias de fusión como beta-galactosidasa o superóxido dismutasa (SOD), preferentemente SOD. Los procedimientos y vectores que son útiles para la producción de polipéptidos que contienen secuencias de fusión de SOD se describen en la Publicación de la Oficina de Patentes Europea número 0196056, publicada el 1 de octubre de 1986. Los vectores para la expresión de polipéptidos de fusión de SOD y polipéptidos de HCV codificados en una cantidad de clones de HCV se describen más adelante, en los Ejemplos. Cualquier porción deseada del ADNc del HCV que contiene un marco de lectura libre, en cualquiera de las cadenas de sentido, se puede obtener como polipéptido recombinante, tal como una proteína madura o de fusión; alternativamente, se puede obtener un polipéptido codificado en el ADNc mediante síntesis química.
El ADN que codifica el polipéptido deseado, tanto en forma fusionada como madura, y conteniendo o no una secuencia de señal para permitir la secreción, se puede ligar a vectores de expresión apropiados para cualquier huésped conveniente. Tanto los sistemas de huésped eucariota como procariota se usan para crear polipéptidos recombinantes, y se ofrece más adelante un resumen de algunos de los sistemas de control y líneas de células huésped más comunes. Luego se aísla el polipéptido de células lisadas o del medio de cultivo y se purifica en la medida necesaria para su uso intencionado. La purificación se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial, fraccionamiento con sal, cromatografía en resinas de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, centrifugación, y otros. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology para obtener una variedad de procedimientos de purificación de proteínas. Dichos polipéptidos se pueden usar como diagnóstico, o aquellos que dan lugar a anticuerpos neutralizadores se pueden formular como vacunas. Los anticuerpos producidos contra estos polipéptidos también se pueden usar como diagnóstico, o para inmunoterapia pasiva. Además, como se discute más adelante, los anticuerpos para estos polipéptidos son útiles para aislar e identificar partículas de
HCV.
Preparación de Polipéptidos Antigénicos y Conjugación con el Portador
Una región antigénica de un polipéptido es generalmente relativamente pequeña, normalmente de 8 a 10 aminoácidos o menos de longitud. Una región antigénica se puede caracterizar por fragmentos de tan poco como 5 aminoácidos. Estos segmentos pueden corresponder a regiones de antígeno de HCV. En concordancia, usando los ADNc de HCV como base, los ADN que codifican segmentos cortos de polipéptidos de HCV se pueden expresar de forma recombinante como proteínas de fusión, o como polipéptidos aislados. Además, se pueden obtener secuencias cortas de aminoácidos convenientemente mediante síntesis química. En casos en los que el polipéptido sintetizado está correctamente configurado para aportar el epitopo correcto, pero es demasiado pequeño para ser inmunogénico, el polipéptido se puede unir a un portador apropiado.
En la técnica se conocen una serie de procedimientos para obtener dicha unión, incluyendo la formación de uniones disulfuro usando N-succinimidil-3-(2-piridil-tio)propionato (SPDP) y succinimidil 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) obtenidos de Pierce Company, Rockford, Illinois, (si el péptido carece de un grupo sulfidrilo, éste se puede aportar añadiendo un residuo de cisteína.) Estos reactivos crean una unión disulfuro entre ellos y residuos de cisteína peptídica en una proteína y una unión amido a través del epsilon-amino en una lisina, u otros grupos amino libres en los otros. Se conoce una variedad de dichos agentes que forman uniones disulfuro/amido. Véase, por ejemplo, Inmun. Rev. (1982) 62:185. Otros agentes de unión bifuncionales forman un tioéter más que una unión disulfuro. Muchos de estos agentes productores de tio-éter se pueden conseguir en comercios e incluyen ésteres reactivos del ácido 6-maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxílico, y otros. Los grupos carboxilo se pueden activar combinándolos con succinimida o ácido 1-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico, sal de sodio. Procedimientos adicionales para emparejar antígenos usan el sistema rotavirus/"péptido de unión" descrito en la EPO Publicada Nº 259,149, cuya exposición se incorpora en la presente memoria mediante referencia. No se pretende que la lista anterior sea exhaustiva, y se pueden usar claramente modificaciones de los compuestos nombrados.
Se puede usar cualquier portador que no induzca por si mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el huésped. Los portadores apropiados suelen ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, como proteínas; polisacáridos, como sefarosa, agarosa, celulosa, bolas de celulosa y otros, funcionalizados con látex; aminoácidos poliméricos, como ácido poliglutámico, polilisina, y otros; copolímeros de aminoácido; y partículas virales inactivas. Sustratos proteicos especialmente útiles son albúminas séricas, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico, y otras proteínas bien conocidas para aquellos con destreza en la técnica.
Además de las proteínas virales de longitud total, los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos de HCV truncadas que codifican al menos un epitopo viral son reactivos inmunológicos útiles. Por ejemplo, los polipéptidos que comprenden dichas secuencias truncadas se pueden usar como reactivos en un inmunoensayo. Estos polipéptidos también son posibles antígenos de subunidad en composiciones para la producción de antisuero o vacunas. Mientras estas secuencias truncadas se pueden producir mediante varios tratamientos conocidos de una proteína viral nativa, generalmente se prefiere crear polipéptidos sintéticos o recombinantes que comprenden la secuencia de HCV. Los polipéptidos que comprenden estas secuencias truncadas se pueden formar enteramente con secuencias de HCV (uno o más epitopos, bien contiguos o no contiguos), o secuencias de HCV y secuencias heterólogas en una proteína de fusión. Las secuencias heterólogas útiles incluyen secuencias que provocan la secreción desde un huésped recombinante, aumentan la reactividad inmunológica del(los) epitopos del HCV, o facilitan el emparejamiento del polipéptido con un soporte de inmunoensayo o un portador de vacuna. Véase, por ejemplo, EPO Publicada Nº 116.201; Patente De EE.UU. Nº 4.722.840; EPO Publicada Nº 259.149; Patente De EE.UU. Nº 4.629.783, cuyas exposiciones se incorporan a la presente memoria descriptiva mediante referencia.
El tamaño de los polipéptidos que comprenden las secuencias de HCV truncadas puede variar mucho, siendo el tamaño mínimo una secuencia de tamaño suficiente para aportar un epitopo de HCV, mientras que el tamaño máximo no es crítico. Por conveniencia, el tamaño máximo no suele ser sustancialmente mayor que el necesario para aportar los epitopos de HCV deseados y la(s) función(es) de la secuencia heteróloga, si existen. Habitualmente, la secuencia de aminoácido de HCV truncada estará en un intervalo de aproximadamente 5 a 100 aminoácidos de longitud. Más habitualmente, sin embargo, la secuencia de HCV será de un largo máximo de aproximadamente 50 aminoácidos, preferentemente un máximo de aproximadamente 30 aminoácidos. Normalmente es deseable seleccionar las secuencias de al menos aproximadamente 10, 12 ó 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 ó 25 aminoácidos.
Las secuencias de aminoácidos de HCV truncadas que comprenden epitopos se pueden identificar de diversas maneras. Por ejemplo, la secuencia proteica viral completa se puede detectar preparando una serie de péptidos cortos que juntos abarcan la secuencia de la proteína completa. Un ejemplo de detección antigénica de las regiones de la poliproteína de HCV se muestra más adelante. Además, empezando con, por ejemplo, polipéptidos 100mero, sería una rutina probar cada polipéptido para detectar la presencia de un(os) epitopo(s) que muestre(n) una reactividad deseada, y luego probar progresivamente fragmentos más pequeños y que se superponen de un 100mero identificado para mapear el epitopo de interés. La detección de dichos péptidos en un inmunoensayo se encuentra dentro de la destreza de la técnica. También se sabe que realiza un análisis por ordenador de una secuencia proteica para identificar potenciales epitopos, y luego prepara oligopéptidos que comprenden las regiones identificadas para la detección. Tal análisis por ordenador de la secuencia de aminoácidos de HCV se muestra en la Figura 20, donde se expone el carácter hidrófilo/hidrófobo sobre el índice del antígeno. Los aminoácidos se enumeran desde la MET inicial (posición 1) como se muestra en la Figura 17. Aquellos con destreza en la técnica aprecian que dicho análisis por ordenador de la antigenicidad no siempre identifique un epitopo que ya existe, y puede también identificar de forma incorrecta una región de la proteína como contenedora de un epitopo.
Más adelante se describen ejemplos de secuencias de aminoácidos de HCV que pueden ser útiles, las cuales se expresan a partir de vectores de expresión que comprenden los clones 5-1-1, 81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, CA167b. Otros ejemplos de secuencias de aminoácidos de HCV que pueden ser útiles como se describen en la presente memoria descriptiva se exponen más abajo. Se ha de entender que estos péptidos no necesariamente precisamente mapean un epitopo, y también pueden contener una secuencia de HCV que no es inmunogénica. Estas porciones no inmunogénicas de la secuencia se pueden definir como se describen más arriba usando procedimientos convencionales y borrarse de las secuencias descritas. Además, secuencias adicionales de aminoácidos de HCV truncadas que comprenden un epitopo o son inmunogénicas se pueden identificar como se describe más arriba. Las siguientes secuencias están representadas por un número de aminoácido dado (esto es, "AAn") donde n es el número de aminoácido según se muestra en la Figura 17:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150;
AA150-AA200; AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;
AA400-AA450; AA405-AA415; AA415-AA425; AA425-AA435; AA437-AA582; AA440-AA460.
Las anteriores secuencias de aminoácidos de HCV se pueden preparar como péptidos diferenciados o incorporarse a un polipéptido mayor, y puede tener utilidad como aquí se describe. En los ejemplos se describen más polipéptidos que comprenden secuencias de HCV truncadas.
La relación observada entre las poliproteínas putativas de HCV y los Flavivirus permite alguna predicción de los dominios putativos de las proteínas "no estructurales" (NS) del HCV. La situación de las proteínas NS individuales en la poliproteína precursora de Flavivirus putativo se conoce bastante bien. Además, ésta también coincide con fluctuaciones brutas observadas en el perfil de hidrofobicidad de la poliproteína. Se establece que NS5 de Flavivirus codifica la polimerasa del virión, y que NS1 se corresponde con un antígeno de fijación del complemento que ha demostrado ser una vacuna efectiva en animales. Recientemente, se ha observado que una función proteasa flaviviral reside en NS3. Debido a las similitudes observadas entre el HCV y los Flavivirus, descrito más adelante, es posible deducir la situación aproximada de los dominios y funciones proteicos correspondientes en la poliproteína del HCV. La expresión de polipéptidos que contienen estos dominios en una variedad de células huésped recombinantes, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de insectos, y de vertebrados, debería producir importantes reactivos inmunológicos que se pueden usar para el diagnóstico, detección, y vacunas.
Aunque las regiones de proteínas no estructurales de las poliproteínas putativas del aislado de HCV aquí descritas y de Flavivirus parecen tener alguna similitud, existe menos similitud entre las regiones estructurales putativas que se encuentran hacia el extremo N. En esta región, hay una mayor divergencia en cuanto a la secuencia, y además, el perfil hidrófobo de las dos regiones muestra menos similitud. Esta "divergencia" comienza en la región N-terminal del dominio NS1 putativo en el HCV, y se extiende hasta el supuesto extremo N. No obstante, todavía puede ser posible predecir la situación aproximada de los dominios putativos de la nucleocápside (dominio básico N-terminal) y de E (generalmente hidrófobo) dentro de la poliproteína de HCV. En los Ejemplos las predicciones se basan en los cambios observados en el perfil hidrófobo de la poliproteína HCV, y en el conocimiento de la situación y carácter de las proteínas flavivirales. A partir de estas predicciones puede ser posible identificar regiones aproximadas de la poliproteína del HCV que podrían corresponder con reactivos inmunológicos útiles. Por ejemplo, las proteínas E y NS1 de los Flavivirus se sabe que tienen eficacia como vacunas protectoras. Estas regiones, al igual que algunas que se muestra que son antigénicas en el aislado de HCV aquí descrito, por ejemplo aquellas dentro de NS3, C, y NS5, etc. putativas, también deberían aportar reactivos de diagnóstico. Además, la situación y expresión de enzimas codificadas por virus también puede permitir la evaluación de inhibidores enzimáticos antivirales, esto es, por ejemplo, inhibidores que previenen la actividad enzimática en virtud de una interacción con la misma enzima, o sustancias que pueden evitar la expresión de la enzima (por ejemplo, ARN anti-sentido, u otros medicamentos que interfieren con la expresión).
Preparación de Inmunógenos de Partículas Híbridas que Contienen Epitopos de HCV
La inmunogenicidad de los epitopos de HCV también se puede aumentar preparándolos en sistemas de mamíferos o levadura fusionados con o ensamblados con proteínas productoras de partículas como, por ejemplo, aquellas asociadas con el antígeno de superficie de la hepatitis B. Las construcciones en las que el epitopo de NANBV está unido directamente a las secuencias codificadoras de la proteína productora de partículas producen híbridos que son inmunogénicos con respecto al epitopo del HCV. Además, todos los vectores preparados incluyen epitopos específicos para el HBV, que tienen diversos grados de inmunogenicidad, como, por ejemplo, el péptido pre-S. Así, las partículas que se forman a partir de la proteína productora de partículas que incluyen secuencias de HCV son inmunogénicas respecto al HCV y HBV.
Se ha visto que el antígeno de superficie de la hepatitis (HBSAg) está formado y ensamblado en partículas en S. Cerevisiae (Valenzuela y col. (1982)), al igual que en, por ejemplo, células de mamíferos (Valenzuela, P. Y col. (1984)). Se ha visto que la formación de dichas partículas aumenta la inmunogenicidad de la subunidad de monómero. Las construcciones también pueden incluir el epitopo inmunodominante de HBSAg, que comprende los 55 aminoácidos de la región presuperficial (pre-S). Neurath y col. (1984). Las construcciones de la partícula pre-S-HBSAg que se puede expresar en levadura se exponen en la EPO 174.444, publicada el 19 de marzo de 1986; los híbridos que incluyen secuencias virales heterólogas para la expresión en levadura se exponen en la EPO 175.261, publicada el 26 de marzo de 1966. Estas construcciones también se pueden expresar en células de mamíferos como en células del ovario de hámster chino (CHO) usando un vector de reductasa dihidrofolato SV40 (Michelle y col. (1984)).
Además, porciones de la secuencia codificadora de la proteína productora de partículas se pueden reemplazar con codones que codifican un epitopo del HCV. En esta sustitución, se pueden borrar regiones que no son necesarias para mediar en la agregación de las unidades para formar partículas inmunogénicas en levadura o mamíferos, eliminando así sitios antigénicos de HBV adicionales de competir con el epitopo de HCV.
Preparación de Vacunas
Las vacunas se pueden preparar a partir de uno o más polipéptidos inmunogénicos derivados del ADNc del HCV, incluyendo las secuencias de ADNc descritas en los Ejemplos. La homología observada entre el HCV y los Flavivirus aporta información referente a los polipéptidos que puede ser muy efectiva como vacunas, al igual que las regiones del genoma en las que están codificados. La estructura general del genoma de Flavivirus se discute en Rice y col. (1986). El ARN genómico de Flavivirus se cree que es el único de la especie de ARNm específico para virus, y se traduce a las tres proteínas estructurales virales, esto es, C, M, y E, al igual que dos proteínas no estructurales grandes, NS4 y NS5, y un grupo complejo de proteínas no estructurales más pequeñas. Se sabe que los epitopos neutralizadores mayores para Flavivirus residen en la proteína E (envoltura) (Roehrig (1986)). Así, las vacunas se pueden componer de polipéptidos recombinantes que contienen epitopos de HCV E. Estos polipéptidos se pueden expresar en células bacterianas, de levadura, o de mamífero, o alternativamente se pueden aislar de preparados virales. También se anticipa que las otras proteínas estructurales también pueden contener epitopos que dan lugar a anticuerpos anti-HCV protectores. Así, los polipéptidos que contienen los epitopos de E, C, y M también se pueden usar, bien solos o en combinación, en vacunas de HCV.
Además de lo anterior, se ha visto que la inmunización con NS1 (proteína no estructural 1), tiene como resultado la protección contra la fiebre amarilla (Schlesinger y col. (1986)). Esto es verdad incluso aunque la inmunización no produce anticuerpos neutralizadores. Así, en particular ya que esta proteína parece conservarse mucho entre los Flavivirus, es probable que la NS1 del HCV también será protectora contra la infección por HCV. Además, también muestra que las proteínas no estructurales pueden aportar protección contra la patogenicidad viral, incluso si no causan la producción de anticuerpos neutralizadores.
La información que se da en los Ejemplos referente a la inmunogenicidad de los polipéptidos que se expresan a partir de ADNc del HCV clonado que abarca las diversas regiones del ORF del HCV también permiten predicciones en relación con su uso en vacunas.
En vista de lo anterior, las vacunas multivalentes contra el HCV pueden componerse de uno o más epitopos de una o más proteínas estructurales, y/o uno o más epitopos de una o más proteínas no estructurales. Estas vacunas pueden estar compuestas de, por ejemplo, polipéptidos de HCV recombinantes y/o polipéptidos aislados de los viriones. En particular, se contempla que las vacunas estén compuestas de una o más de las siguientes proteínas de HCV, o antígenos de subunidades derivados de ellas: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 y NS5. Particularmente se prefieren las vacunas que comprenden E y/o NS1, o subunidades de las mismas.
La preparación de vacunas que contienen un(os) polipéptido(s) inmunogénico(s) como ingrediente(s) activo(s), la conoce aquel con destreza en la técnica. Normalmente, dichas vacunas se preparan como inyectables, bien como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas apropiadas para solución en, o suspensión en, líquido anterior a la inyección. La preparación también se puede emulsionar, o la proteína encapsularse en liposomas. Los ingredientes inmunogénicos activos a menudo se mezclan con excipientes que son aceptables y compatibles farmacéuticamente con el ingrediente activo. Excipientes apropiados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, u otros y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, y/o coadyuvantes que aumentan la efectividad de la vacuna. Ejemplos de coadyuvantes que pueden ser efectivos incluyen pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, a la que se hace referencia como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, a la que se hace referencia como MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trealosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión escualeno/Tween 80 al 2%. La efectividad de un coadyuvante se puede determinar midiendo la cantidad de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido inmunogénico que contiene una secuencia antigénica de HCV que resulta de la administración de este polipéptido en vacunas que también se componen de varios coadyuvantes.
Convencionalmente las vacunas se administran de forma parenteral, por inyección, por ejemplo, subcutánea o intramuscular. Formulaciones adicionales que son apropiadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los ensambladores y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilen glicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en un intervalo del 0,5% al 10%, preferentemente 1%-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes utilizados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y otros. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pastillas, cápsulas, sustancias de liberación retardada o polvos y contienen el 10%-95% de ingrediente activo, preferentemente el 25%-70%.
Las proteínas se pueden formular en la vacuna como formas neutras o salinas. Las sales aceptables farmacéuticamente incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres de los péptidos) y que están formadas con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos hidroclóricos o fosfóricos, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, maleico, y otros. Las sales que se forman con grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o hierro, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y otros.
Dosificación y Administración de Vacunas
La vacunas se administran de forma compatible con la formulación de la dosificación, y en tal cantidad que sea efectiva profiláctica y/o terapéuticamente. La cantidad a administrar, que generalmente se encuentra en el intervalo de 5 microorganismos a 250 microorganismos de antígeno por dosis, depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmunológico del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que es necesario administrar pueden depender del juicio del médico y puede ser característico para cada sujeto.
La vacuna se puede administrar en una única dosis, o preferentemente en un programa de dosis múltiple. Un programa de dosis múltiple es uno en el que una primera tanda de vacunación puede conllevar 1-10 dosis separadas, seguida de otras dosis administradas a intervalos de tiempo subsiguientes necesarias para mantener y reforzar la respuesta inmune, por ejemplo, 1-4 meses para una segunda dosis, y si se necesita, una(s) dosis posterior(es) tras varios meses. El régimen de dosificación también estará determinado, al menos en parte, por las necesidades del individuo y dependerá del juicio del médico.
Además, la vacuna que contiene el(los) antígeno(s) de HCV inmunogénico(s) se puede administrar en conjunción con otros agentes inmunorreguladores, por ejemplo, inmunoglobulinas.
Preparación de Anticuerpos contra Epitopos de HCV
Los polipéptidos inmunogénicos preparados como se describe más arriba se usan para producir anticuerpos, tanto poli como monoclonales. Si se quieren obtener anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc.) con un polipéptido inmunogénico que lleva un epitopo(s) de HCV. Se recoge suero del animal inmunizado y se trata según procedimientos conocidos. Si el suero que contiene anticuerpos policlonales para un epitopo de HCV contiene anticuerpos para otros antígenos, se pueden purificar los anticuerpos policlonales mediante cromatografía de inmunoafinidad. Se conocen procedimientos para producir y procesar antisueros policlonales en la técnica, véase por ejemplo, Mayer y Walker (1987).
De forma alternativa, se pueden aislar anticuerpos policlonales de un mamífero que previamente ha sido infectado con HCV. Un ejemplo de un procedimiento para purificar anticuerpos para epitopos de HCV del suero de un individuo infectado, que se basa en cromatografía de afinidad y utiliza un polipéptido de fusión del SOD y un polipéptido codificado en el clon 5-1-1 del ADNc, se presenta en la EPO Publicada Nº 318.216.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopos de HCV también se pueden producir rápidamente por uno con destreza en la técnica. Se conoce bien la metodología general para crear anticuerpos monoclonales mediante hibridomas. Se pueden crear líneas celulares productoras de anticuerpos inmortales mediante fusión celular, y también mediante otros procedimientos como la transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con el virus de Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier y col. (1980); Hammerling y col. (1981); Kennet y col. (1980); véanse también, Patentes de EE.UU. Nº 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; y 4.493.890. Se pueden examinar paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra epitopos de HCV para detectar varias propiedades; esto es, para isotipo, afinidad de epitopo, etc.
Los anticuerpos, tanto mono como policlonales, que se dirigen contra epitopos de HCV son particularmente útiles en el diagnóstico, y aquellos que son neutalizadores son útiles en la inmunoterapia pasiva. Los anticuerpos monoclonales, en particular, se pueden usar para producir anticuerpos anti-idiotipo.
Los anticuerpos anti-idiotipo son inmuglobulinas que portan una "imagen interna" del antígeno del agente infeccioso contra el cual se desea obtener la protección. Véase, por ejemplo, Nisonoff, A., y col. (1981) y Dreesman y col. (1985).
Se conocen procedimientos para producir anticuerpos anti-idiotipo en la técnica. Véase, por ejemplo, Grzych (1985), MacNamara y col. (1984), y Uytdehaag y col. (1985). Estos anticuerpos anti-idiotipo también pueden ser útiles para el tratamiento y/o diagnóstico de NANBH, al igual que para una elucidación de las regiones inmunogénicas de los antígenos de HCV.
Una persona con una destreza normal en la técnica también reconocería que se puede producir una variedad de tipos de anticuerpos dirigidos contra epitopos de HCV. Como aquí se usa, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que están compuestos por al menos un sitio combinador de anticuerpos. Un "sitio combinador de anticuerpos" o "dominio de unión" está formado del plegado de dominios variables de una molécu-
la(s) de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensional con una forma superficial interna y una distribución de la carga complementaria a las características de un epitopo de un antígeno, lo que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Un sitio combinador de anticuerpos puede estar formado de un dominio de cadena pesada y/o ligera (VH y VL, respectivamente), que forman vueltas hipervariables que contribuyen a la unión del antígeno. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, las proteínas Fab, y anticuerpos de dominio único.
Un "anticuerpo de dominio único" (dAB) es un anticuerpo compuesto por un dominio VH, que reacciona inmunológicamente con un antígeno designado. Un dAB no contiene un dominio VL, pero puede contener otros dominio de unión antigénica que se sabe que existen en anticuerpos, por ejemplo, los dominios kapa y lambda. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar dABs. Véase, por ejemplo, Ward y col. (1989).
Los anticuerpos también pueden estar compuestos por dominios VH y VL, al igual que otros dominios de unión antigénica conocidos. Ejemplos de estos tipos de anticuerpos y procedimientos para su preparación se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Patente De EE.UU. Nº 4,816,467, que se incorpora en la presente memoria como referencia), e incluye lo siguiente. Por ejemplo, "anticuerpos de vertebrados" se refiere a anticuerpos que son tetrámeros o agregados de los mismos, que comprenden cadenas ligeras y pesadas que normalmente se agregan en configuración "Y" y que pueden tener o no uniones covalentes entre las cadenas. En los anticuerpos de vertebrados, las secuencias de aminoácidos de todas las cadenas de un anticuerpo en particular son homólogas con las cadenas encontradas en un anticuerpo producido por el linfocito que produce ese anticuerpo in situ, o in vitro (por ejemplo, en hibridomas). Los anticuerpos de vertebrados habitualmente incluyen anticuerpos nativos, por ejemplo, anticuerpos policlonales purificados y anticuerpos monoclonales. A continuación se describen ejemplos de los procedimientos para la preparación de estos anticuerpos.
Los "anticuerpos híbridos" son anticuerpos en los que un par de cadenas pesadas y ligeras es homólogo a aquellas en un primer anticuerpo, mientras que el otro par de cadenas pesadas y ligeras es homólogo a aquellas en un segundo anticuerpo diferente. Normalmente, cada uno de estos dos pares unirá diferentes epitopos, particularmente en diferentes antígenos. Esto da como resultado la propiedad de "bivalencia", esto es, la capacidad de unir dos antígenos simultáneamente. Dichos híbridos también se pueden formar usando cadenas quiméricas, como se indica más
abajo.
Los "anticuerpos quiméricos", son anticuerpos en los que las cadenas pesadas y/o ligeras son proteínas de fusión. Normalmente el dominio constante de las cadenas es de una especie y/o clase en particular, y los dominios variables son de diferentes especies y/o clases. También se incluye cualquier anticuerpo en el que una o ambas de las cadenas pesadas o ligeras están compuestas por combinaciones de secuencias que mimetizan las secuencias en anticuerpos de diferentes fuentes, siendo estas fuentes de diferentes clases, o de diferentes especies de origen, y estando o no el punto de fusión en el entorno variable/constante. Así, es posible producir anticuerpos en los que ni la región constante ni la variable mimeticen secuencias de anticuerpos conocidas. Entonces es posible, por ejemplo, construir anticuerpos cuya región variable tenga una afinidad específica mayor para un antígeno en particular, o cuya región constante pueda provocar un aumento de la fijación del complemento, o hacer otras mejoras en las propiedades que tiene una región constante en particular.
Otro ejemplo son los "anticuerpos alterados", que hacen referencia a anticuerpos en los que la secuencia de aminoácidos que sucede de forma natural en un anticuerpo de vertebrado se ha variado. Utilizando técnicas de ADN recombinante, se pueden rediseñar los anticuerpos para obtener características deseadas. Las variaciones posibles son muchas, y van desde el cambio de uno o más aminoácidos al rediseño completo de una región, por ejemplo, la región constante. Los cambios en la región constante son, en general, para obtener características de proceso celular deseadas, por ejemplo, cambios en la fijación del complemento, interacción con membranas, y otras funciones efectoras. Los cambios en la región variable se pueden hacer para alterar las características de unión del antígeno. El anticuerpo también se puede manipular para ayudar en la entrega específica de una molécula o sustancia a un sitio de célula o tejido específico. Las alteraciones deseadas se pueden llevar a cabo mediante procedimientos conocidos en biología molecular, por ejemplo, técnicas recombinantes, mutagénesis dirigida al sitio, etc.
Aún otro ejemplo son los "anticuerpos univalentes", que son agregados formados por un dímero cadena pesada/cadena ligera unido a la región Fc (esto es, constante) de una segunda cadena pesada. Este tipo de anticuerpo escapa a la modulación antigénica. Véase, por ejemplo, Glennie y col. (1982).
Incluidos también en la definición de anticuerpos están los fragmentos "Fab" de anticuerpos. La región "Fab" se refiere a aquellas porciones de las cadenas pesada y ligera que son más o menos equivalentes, o análogas, a las secuencias que comprenden la porción ramificada de las cadenas pesada y ligera, y que se ha visto que exhiben unión inmunológica a un antígeno especificado, pero que carece de la porción Fc efectora. "Fab" incluye agregados de una cadena pesada y una ligera (conocida normalmente como Fab'), al igual que tetrámeros que contienen cadenas 2H y 2L (conocidas como F(ab)_{2}), que son capaces de reaccionar selectivamente con un antígeno o una familia de antígenos designados. Los anticuerpos "Fab" se pueden dividir en subgrupos análogos a aquellos descritos más arriba, esto es, "Fab de vertebrados", "Fab híbridos", "Fab quiméricos", y "Fab alterados". Los procedimientos para producir fragmentos "Fab" de anticuerpos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, proteolisis, y síntesis mediante técnicas recombinantes.
II.H. Sondas y Equipos de Oligonucleótidos de Diagnóstico
Utilizando las porciones expuestas de los ADNc de HCV aislados como base, se pueden preparar oligómeros de aproximadamente 8 nucleótidos o más, bien por escisión o sintéticamente, que hibridan con el genoma de HCV y son útiles para identificar los agente virales, también caracterizar genoma(s) viral(es), al igual que en la detección de
el(los) virus en individuos enfermos. Las sondas para polinucleótidos de HCV (naturales o derivados) tienen una longitud que permite la detección de secuencias virales únicas mediante hibridación. Mientras que 6-8 nucleótidos puede ser una longitud viable, se prefieren secuencias de 10-12 nucleótidos, y aproximadamente 20 nucleótidos resulta óptimo. Preferentemente, estas secuencias se derivarán de regiones que carecen de heterogenicidad. Estas sondas se pueden preparar usando procedimientos rutinarios, incluyendo procedimientos sintéticos de oligonucleótidos automatizados. Entre las sondas útiles, por ejemplo, están aquellas derivadas de los clones recién aislados que se exponen en la presente memoria descriptiva, al igual que los diversos oligómeros útiles en sondear librerías de ADNc, que se presentan más abajo. Un complemento para cualquier porción del genoma de HCV será satisfactorio. Para usar como sondas, es deseable la complementariedad total, aunque puede no ser necesario al incrementarse la longitud del fragmento.
Para usar dichas sondas como diagnósticos, la muestra biológica a analizar, como sangre o suero, se puede tratar, si se quiere, para extraer los ácidos nucleicos contenidos en ella. El ácido nucleico resultante de la muestra se puede someter a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño; de forma alternativa, la muestra de ácido nucleico puede ser punteada sin separación por tamaño. Luego se marcan las sondas. Los marcadores apropiados, y procedimientos para marcar las sondas se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos incorporados mediante traducción por muescas o quinasación, biotina, sondas fluorescentes, y sondas quimiluminiscentes. Los ácidos nucleicos extraídos de la muestra se tratan entonces con la sonda marcada en condiciones de hibridación de rigurosidad apropiada, y se detectan los dúplex de polinucleótidos que contienen la sonda.
Las sondas se pueden construir totalmente complementarias del genoma de HCV. Por lo tanto, normalmente son deseables unas condiciones de rigurosidad elevada con objeto de prevenir falsos positivos. Sin embargo, sólo se deben usar condiciones de elevada rigurosidad si las sondas son complementarias de regiones del genoma viral que carecen de heterogenicidad. La rigurosidad de la hibridación se determina mediante un número de factores durante la hibridación y durante el proceso de lavado, incluyendo la temperatura, fuerza iónica, duración del tiempo, y concentración de formamida. Estos factores se subrayan en, por ejemplo, Maniatis, T. (1982).
Generalmente, se espera que las secuencias del genoma de HCV estén presentes en el suero de individuos infectados a niveles relativamente bajos, esto es, a aproximadamente 10^{2}-10^{3} dosis infecciosas de chimpancé(CID) por ml. Este nivel puede hacer necesario que se usen técnicas de amplificación en ensayos de hibridación. Dichos procedimientos se conocen en la técnica. Por ejemplo, el sistema de la Corporación Bioquímica Enzo "Biobridge" usa desoxinucleótido transferasa terminal para añadir colas 3'-poli-dT no modificadas a la sonda de ADN. La sonda con cola poli dT se hibrida a la secuencia de nucleótidos objetivo, y luego a un poli-A con biotina modificada. La solicitud PCT 8403520 y EPA124221 describen un ensayo de hibridación de ADN en el que: (1) el analizado se hierve a una sonda de ADN de cadena sencilla que es complementaria de un oligonucleótido marcado con enzima; y (2) el dúplex encolado resultante se hibrida a un oligonucleótido marcado con enzima. EPA204510 describe un ensayo de hibridación de ADN en el que el ADN analizado contacta con una sonda que tiene una cola, como una cola poli-dT, una cadena amplificadora que tiene una secuencia que se hibrida con la cola de la sonda, como una secuencia poli-A, y que es capaz de unir una pluralidad de cadenas marcadas. Una técnica particularmente deseable puede suponer primero la amplificación de las secuencias de HCV objetivo en sueros de aproximadamente 10.000 pliegues, esto es, a aproximadamente 10^{6} secuencias/ml. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante la técnica de reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en Saiki y col. (1986), por Mullis, Patente De EE.UU. Nº 4.683.195, y por Mullis y col. Patente De EE.UU. Nº 4.683.202.
La(s) secuencia(s) amplificada(s) se puede(n) entonces detectar usando un ensayo de hibridación que se describe en la Patente Europea 317.077, publicada el 24 de mayo de 1989. Estos ensayos de hibridación, que deberían detectar secuencias al nivel de 10^{6}/ml, usan multímeros de ácidos nucleicos que se unen a ácidos nucleicos analizados de cadena sencilla, y que también se unen a una variedad de oligonucleótidos marcados de cadena sencilla. Un ensayo sandwich de fase de solución apropiado que se puede usar con sondas de polinucleótidos marcadas, y los procedimientos para la preparación de sondas se describen en la EPO 225.807, publicada el 16 de junio de 1987.
Las sondas se pueden empaquetar en equipos de diagnóstico. Los equipos de diagnóstico incluyen una sonda de ADN, que puede estar marcada; alternativamente, la sonda de ADN puede no estar marcada y los ingredientes para el marcado pueden estar incluidos en el equipo en recipientes separados. El equipo también puede contener otros reactivos apropiados empaquetados y materiales necesarios para el protocolo de hibridación concreto, por ejemplo, estándares, al igual que instrucciones para realizar la prueba.
Equipos de diagnóstico e inmunoensayo
Tanto los polipéptidos que reaccionan inmunológicamente con suero que contiene anticuerpos de HCV, por ejemplo, aquellos detectados por el procedimiento de detección de antígenos descrito a continuación en los Ejemplos, como aquellos que se derivan de o están codificados dentro de los clones aislados descritos en los Ejemplos, y compuestos de los mismos, y los anticuerpos que se producen contra los epitopos específicos de HCV en estos polipéptidos, son útiles en inmunoensayos para detectar la presencia de anticuerpos de HCV, o la presencia de virus y/o antígenos virales, en muestras biológicas. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variaciones, y una variedad de éstas se conocen en la técnica. Por ejemplo, el inmunoensayo puede usar un epitopo viral; alternativamente, el inmunoensayo puede usar una combinación de epitopos virales derivados de estas fuentes; estos epitopos se pueden derivar del mismo o de distintos polipéptidos virales, y pueden estar en polipéptidos recombinantes o naturales separados, o juntos en los mismos polipéptidos recombinantes. Puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido contra un epitopo(s) viral(es), una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopos de un antígeno viral, anticuerpos monoclonales dirigidos contra epitopos de diferentes antígenos virales, anticuerpos policlonales dirigidos contra el mismo antígeno viral, o anticuerpos policlonales dirigidos contra diferentes antígenos virales. Los protocolos se pueden basar en, por ejemplo, competencia, o reacción directa, o ensayos tipo sandwich. Los protocolos también pueden usar, por ejemplo, soportes sólidos, o se pueden realizar por inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos supone el uso de anticuerpo o polipéptido marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimiluminiscentes, radioactivos, o moléculas de color. Los ensayos que amplifican las señales de la sonda también se conocen; ejemplos de los mismos son los ensayos que usan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados con enzima y mediados, como los ensayos ELISA.
Algunas de las regiones antigénicas de la poliproteína putativa se han mapeado e identificado mediante detección de la antigenicidad de los productos de expresión bacteriana de los ADNc de HCV que codifican porciones de la poliproteína. Véase los Ejemplos. Otras regiones antigénicas de HCV se pueden detectar expresando las porciones de los ADNc de HCV en otros sistemas de expresión, incluyendo sistemas de levadura y sistemas celulares derivados de insectos y vertebrados. Además, los estudios que dan lugar a un índice de antigenicidad y a un perfil hidrofobicidad/hidrofilicidad producen información relacionada con la probabilidad de antigenicidad de una región.
Los estudios de mapeo antigénico mediante expresión de ADNc de HCV mostraron que un número de clones que contenía estos polipéptidos expresados con ADNc que eran reactivos inmunológicamente con el suero de individuos con NANBH. Ningún polipéptido solo era inmunológicamente reactivo con todos los sueros. Cinco de estos polipéptidos eran muy inmunogénicos en que los anticuerpos para los epitopos de HCV en estos polipéptidos se detectaban en muchos sueros de pacientes diferentes, aunque la superposición en la detección no era completa. Así, los resultados sobre la inmunogenicidad de los polipéptidos codificados en los diversos clones sugiere que los sistemas de detección efectivos pueden incluir el uso de paneles de epitopos. Los epitopos en el panel se pueden transformar en uno o múltiples polipéptidos.
Los equipos apropiados para el inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados se construyen mediante el empaquetado de los materiales apropiados, incluyendo los polipéptidos de la invención que contienen epitopos de HCV o anticuerpos dirigidos contra epitopos de HCV en recipientes apropiados, junto con los reactivos restantes y los materiales requeridos para llevar a cabo el ensayo, al igual que un conjunto apropiado de instrucciones para el ensayo.
Otra Caracterización del Genoma de HCV, Viriones, y Antígenos Virales Usando Sondas Derivadas de ADNc al Genoma Viral
La información de la secuencia de ADNc de HCV en los clones recién aislados descritos en los Ejemplos se puede usar para conseguir más información sobre la secuencia del genoma de HCV, y para la identificación y aislamiento del agente de HCV, y así ayudará en su caracterización incluyendo la naturaleza del genoma, la estructura de la partícula viral, y la naturaleza de los antígenos de los que está compuesta. Esta información, a su vez, puede llevar a sondas de polinucleótidos adicionales, polipéptidos derivados del genoma de HCV, y anticuerpos dirigidos contra epitopos de HCV que podrían ser útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de NANBH causado por HCV.
La información de la secuencia de ADNc en los clones antes mencionados es útil para el diseño de sondas para el aislamiento de secuencias adicionales de ADNc que se derivan de regiones todavía indefinidas del genoma(s) de HCV de los que se derivan los ADNc de los clones aquí descritos y en la Patente Europea 0.316.218. Por ejemplo, se pueden usar sondas marcadas que contienen una secuencia de aproximadamente 8 o más nucleótidos, y preferentemente 20 o más nucleótidos, que se derivan de regiones próximas e los extremos 5' o 3' de la secuencia compuesta de ADNc de HCV que se muestra en la Figura 17, para aislar secuencias de ADNc superpuestas de librerías de ADNc de HCV. De forma alternativa, se puede realizar la caracterización de segmentos genómicos a partir del genoma(s) viral(es) aisla-
do(s) de partículas de HCV purificadas. En la presente memoria se describen, más adelante, procedimientos para purificar partículas de HCV y para detectarlas durante el procedimiento de purificación. En la técnica se conocen procedimientos para aislar genomas de polinucleótidos de partículas virales, y un procedimiento que se puede usar es el descrito en la Patente Europea 0.218.316. Los segmentos genómicos aislados se pueden entonces clonar y secuenciar. Un ejemplo de esta técnica, que usa la amplificación de las secuencias a clonar, se expone más adelante, y se produce el clon 16jh.
En la técnica se conocen procedimientos para construir librerías de ADNc, y se discuten anterior y posteriormente; un procedimiento para construir librerías de ADNc de HCV en lambda-gt11 se discute en la EPO Publicada Nº 318.216. Sin embargo, las librerías de ADNc que son útiles para el escaneo con sondas de ácidos nucleicos también se pueden construir en otros vectores conocidos en la técnica, por ejemplo, lambda-gt10 (Huynh y col. (1985)).
Búsqueda de Agentes Antivirales para HCV
La disponibilidad de sistemas modelo de cultivo celular y animal para HCV hace posible la búsqueda de agentes antivirales que inhiben la replicación del HCV, y particularmente de aquellos agentes que preferentemente permiten el crecimiento y multiplicación celulares mientras inhiben la replicación viral. Estos procedimientos de detección los conocen aquellos con destreza en la técnica. Generalmente, los agentes antivirales se prueban en diversas concentraciones, para ver su efecto en la prevención de la replicación viral en sistemas de cultivo celular que soportan la replicación viral, y luego para la inhibición de la infecciosidad o de la patogenicidad viral (y un nivel bajo de toxicidad) en un sistema modelo animal.
Los procedimientos y composiciones que aquí se exponen para detectar antígenos de HCV y polinucleótidos de HCV son útiles para detectar agentes antivirales porque aportan una alternativa, y probablemente medios más sensibles, para detectar el efecto del agente en la replicación viral que el ensayo en placa celular o ensayo ID_{50}. Por ejemplo, las sondas de polinucleótidos de HCV aquí descritas se pueden usar para cuantificar la cantidad de ácido nucleico viral producido en un cultivo celular. Esto se podría conseguir, por ejemplo, mediante hibridación o hibridación competitiva de los ácidos nucleicos de la célula infectada con una sonda de polinucleótido de HCV marcada. Por ejemplo, también, se pueden usar anticuerpos anti-HCV para identificar y cuantificar antígeno(s) de HCV en el cultivo celular usando los inmunoensayos descritos en la presente memoria. Además, ya que puede ser deseable cuantificar los antígenos de HCV en el cultivo celular infectado mediante un ensayo de competencia, los polipéptidos codificados en los ADNc de HCV aquí descritos son útiles en estos ensayos de competencia. Generalmente, un polipéptido de HCV recombinante derivado del ADNc de HCV estaría marcado, y la inhibición de la unión de este polipéptido marcado a un polipéptido de HCV debido al antígeno producido en el sistema de cultivo celular sería monitorizado. Además, estas técnicas son particularmente útiles en casos en que el HCV puede ser capaz de replicarse en una línea celular sin causar la muerte de la célula.
Los agentes antivirales cuya eficacia se puede probar con estos procedimientos se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, aquellos que interaccionan con componentes del virión y/o componentes celulares que son necesarios para la unión y/o replicación del virus. Los agentes antivirales típicos pueden incluir, por ejemplo, inhibidores de la polimerasa y/o proteasa(s) del virión necesarios para la división de los polipéptidos precursores. Otros agentes antivirales pueden incluir aquellos que actúan con ácidos nucleicos para prevenir la replicación viral, por ejemplo, polinucleótidos antisentido, etc.
Las moléculas de polinucleótidos antisentido se componen de una secuencia de nucleótidos complementaria que les permite hibridar específicamente con regiones designadas de genomas o ARN. Los polinucleótidos antisentido pueden incluir, por ejemplo, moléculas que bloquean la traducción de proteínas mediante unión con ARNm, o pueden ser moléculas que previenen la replicación de ARN viral mediante transcriptasa. También pueden incluir moléculas que portan agentes (unidos de forma no covalente o covalente) que hacen que el ARN viral sea inactivo porque provocan, por ejemplo, escisiones en el ARN viral. También se pueden unir a polinucleótidos celulares que aumentan y/o son necesarios para la infecciosidad viral, capacidad de replicación, o cronicidad. Las moléculas antisentido que se hibridarán con ARN derivados de HCV se pueden diseñar basándose en la información de la secuencia de los ADNc de HCV aquí expuestos. Los agentes antivirales basados en polinucleótidos antisentido para HCV se pueden diseñar para unir con especificidad elevada, para tener una solubilidad aumentada, para ser estable, y para tener una toxicidad baja. Por tanto, se pueden entregar en sistemas especializados, por ejemplo, liposomas, o por terapia genética. Además, pueden incluir análogos, proteínas ligadas, unión sustituida o alterada entre bases, etc.
Otros tipos de medicamentos se pueden basar en polinucleótidos que "mimetizan" importantes regiones de control del genoma de HCV, y que pueden ser terapéuticos debido a sus interacciones con componentes clave del sistema responsable de la infecciosidad o replicación viral.
Procedimientos Generales
Los procedimientos generales usados en la extracción del genoma de un virus, en la preparación y sondeo de librerías de ADN, en la secuenciación de clones, en la construcción de vectores de expresión, en la transformación celular, en el desarrollo de ensayos inmunológicos como radioinmunoensayos y ensayos ELISA, para el crecimiento de células en cultivo, y otros se conocen en la técnica y están disponibles manuales de laboratorio que describen estos procedimientos. Sin embargo, como guía general, lo siguiente presenta algunas fuentes disponibles habitualmente para dichos procedimientos, y para materiales útiles para llevarlos a cabo.
Las células huésped tanto procariotas como eucariotas se pueden usar para la expresión de secuencias de codificación deseadas cuando se usan secuencias de control apropiadas que son compatibles con el huésped designado. Entre los huéspedes procariotas, E. Coli es el que más frecuentemente se usa. Las secuencias de control de expresión para procariotas incluyen promotores, que opcionalmente contienen porciones de operador, y sitios de unión de ribosomas. Los vectores de transferencia compatibles con huéspedes procariotas normalmente se derivan de, por ejemplo, pBR322, un plásmido que contiene operones que confieren resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina, y los diversos vectores pUC, que también contienen secuencias que confieren marcadores de resistencia a antibióticos. Estos marcadores se pueden usar para obtener transformadores satisfactorios mediante selección. Las secuencias de control procariota usadas normalmente incluyen los sistemas promotores de Beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang y col. (1977)), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col. (1980)) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de unión ribosomal del gen N (Shimatake y col. (1981)) y el promotor tac híbrido (De Boer y col. (1983)) derivado de secuencias de los promotores trp y lac UV5. Los sistemas anteriores son particularmente compatibles con E. coli; si se desea, se pueden usar otros huéspedes procariotas como cadenas de Bacillus o Pseudomonas, con las correspondientes secuencias de control.
Los huéspedes eucariotas incluyen células de levadura y mamíferos en sistemas de cultivo. Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carlsbergensis son los huéspedes de levadura más comúnmente usados, y son huéspedes fúngicos convenientes. Los vectores compatibles de levadura portan marcadores que permiten la selección de transformadores satisfactorios al conferir prototrofia a mutantes auxotróficos o resistencia a metales pesados en cadenas de tipo salvaje. Los vectores compatibles de levadura pueden emplear el origen de replicación de 2 micrómetros (Broach y col. (1983)), la combinación de CEN3 y ARS1 u otros medios para asegurar la replicación, como secuencias que darán como resultado la incorporación de un fragmento apropiado en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de control para los vectores de levadura se conocen en la técnica e incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess y col. (1968); Holland y col. (1978)), incluyendo el promotor de la 3 fosfoglicerato quinasa (Hitzeman (1980)). También se pueden incluir terminadores, como aquellos derivados del gen de la enolasa (Holland (1981)). Los sistemas de control particularmente útiles son aquellos que comprenden el promotor de la gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa (GADPH) o el promotor regulable de la alcohol deshidrogenasa (ADH), terminadores también derivados de GAPDH, y si se desea la secreción, la secuencia líder del factor alfa de la levadura. Además, la región reguladora transcriptiva y la región de iniciación transcriptiva que están unidas de forma operativa pueden ser tales que no están asociadas de forma natural en el organismo de tipo salvaje. Estos sistemas se describen en detalle en la EPO 120.551, publicada el 3 de octubre de 1984; EPO 116.201, publicada el 22 de agosto de 1984; y EPO 164.556, publicada el 18 de diciembre de 1985, todas las cuales se asignan al cesionario de la presente memoria descriptiva, y se incorporan aquí como referencia.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección de Cultivos Tipo Estadounidenses (ATCC), incluyendo las células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células del riñón de bebés hámster (BHK), y una variedad de otras líneas celulares. También se conocen en la técnica promotores adecuados para células de mamífero e incluyen promotores virales como el del Virus de Simio 40 (SV40) (Fiers (1978)), el sarcoma virus de Rous (RSV), adenovirus (ADV), y el virus del papiloma bovino (BPV). Las células de mamíferos también pueden requerir secuencias terminadoras y secuencias de adición poli A; también se pueden incluir secuencias estimuladoras que incrementan la expresión, y también pueden ser deseables las secuencias que causan amplificación del gen. Estas secuencias se conocen en la técnica. Los vectores adecuados para la replicación en células de mamíferos pueden incluir replicones virales, o secuencias que aseguran la integración de las secuencias apropiadas que codifican epitopos de NANBV en el genoma del huésped.
La transformación se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo el empaquetado del polinucleótido en un virus y transduciendo una célula huésped con el virus, y mediante ingesta directa del polinucleótido. El procedimiento transformador usado depende del huésped a transformar. Por ejemplo, la transformación de las células huésped de E. coli con lambda-gt11 que contiene secuencias BB-NANBV se discute en la sección de Ejemplos, más adelante. La transformación bacteriana mediante ingesta directa generalmente usa el tratamiento con cloruro de calcio o rubidio (Cohen (1972); Maniatis (1982)). La transformación de levadura mediante ingesta directa se puede llevar a acabo usando el procedimiento de Hinnen y col. (1978). Las transformaciones de mamíferos mediante ingesta directa se puede realizar usando el procedimiento de precipitación de fosfato cálcico de Graham y Van der Eb (1978), o las modificaciones conocidas del mismo.
La construcción de vectores emplea procedimientos conocidos en la técnica. La división del ADN en un sitio específico se realiza tratando con enzimas restrictivas adecuadas en condiciones que generalmente especifica el fabricante de estas enzimas disponibles comercialmente. En general, aproximadamente 1 microgramo de plásmido o secuencia de ADN se divide por 1 unidad de enzima en aproximadamente 20 microlitros de solución tampón mediante incubación durante 1-2 horas a 37ºC. Tras la incubación con la enzima de restricción, la proteína se retira mediante extracción con fenol/cloroformo y el ADN se recupera mediante precipitación con etanol. Los fragmentos divididos se pueden separar usando técnicas de electroforesis en poliacrilamida o gel de agarosa, según los procedimientos generales encontrados en Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.
Los fragmentos de división finales pegajosos pueden finalizar romos usando la polimerasa I de E. coli (Klenow) en presencia de los desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) adecuados presentes en la mezcla. El tratamiento con la S1 nucleasa también se puede usar, resultando en la hidrólisis de cualquier porción de ADN de cadena sencilla.
Las uniones se realizan usando un tampón y condiciones de temperatura estándares usando T4 ADN ligasa y ATP; las uniones de extremo pegajoso necesitan menos ATP y menos ligasa que las uniones de terminaciones romas. Cuando se usan fragmentos de vectores como parte de una mezcla de unión, el fragmento de vector a menudo se trata con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina intestinal de ternera para retirar el fosfato 5' y así prevenir una nueva unión del vector; alternativamente, se puede usar la digestión con enzima de restricción de fragmentos no deseados para prevenir la unión.
Las mezclas de unión se transforman en huéspedes de clonación apropiados, como E. coli, y transformadores satisfactorios seleccionados con, por ejemplo, resistencia antibiótica, y se examinan para su correcta construcción.
Los oligonucleótidos sintéticos se pueden preparar usando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado como describe Warner (1984). Si se desea las cadenas sintéticas se pueden marcar con ^{32}p mediante tratamiento con polinucleótido quinasa en presencia de ^{32}p-ATP, usando condiciones estándares para la reacción.
Las secuencias de ADN, incluyendo aquellas aisladas de librerías de ADNc, se pueden modificar mediante técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo la mutagénesis dirigida al sitio, como describe Zoller (1982). Brevemente, el ADN a modificar se empaqueta en fagos como una secuencia de cadena sencilla, y se convierte en ADN de cadena doble con ADN polimerasa usando, como iniciador, un oligonucleótido sintético complementario a la porción del ADN a modificar, y tiene la modificación deseada incluida en su propia secuencia. El ADN de cadena doble resultante se transforma en un fago que soporta la bacteria huésped. Los cultivos de la bacteria transformada, que contienen replicaciones de cada cadena del fago, se recubren de agar para obtener placas. Teóricamente, el 50% de las nuevas placas contienen fagos que contiene la secuencia mutada, y el 50% restante tienen la secuencia original. Los duplicados de las placas se hibridan a sonda sintética marcada a temperaturas y condiciones que permiten la hibridación con la cadena correcta, pero no con la secuencia no modificada. Las secuencias que se han identificado por hibridación se recuperan y se clonan.
Las librerías de ADN se pueden sondar usando el procedimiento de Grunstein y Hogness (1975). Brevemente, en este procedimiento, el ADN a sondar se inmoviliza en filtros de nitrocelulosa, desnaturalizados, y prehibidados con un tampón que contiene 0-50% de formamida, ClNa 0,75 M, citrato sódico 75 mM, 0,02% (peso/vol) cada uno de albúmina de suero bovino, polivinil pirrolidona, y Ficoll, Fosfato sódico 50 mM (pH 6,5), 0,1% SDS, y 100 microgramos/ml de ADN desnaturalizado portador. El porcentaje de formamida en el tampón, al igual que las condiciones de tiempo y temperatura de los pasos de prehibridación e hibridación subsiguiente dependen de la rigurosidad necesaria. Las sondas oligoméricas que requieren condiciones de menor rigurosidad generalmente se usan con porcentajes bajos de formamida, menores temperaturas, y tiempos de hibridación más largos. Las sondas que contienen más de 30 ó 40 nucleótidos como aquellos que se derivan de ADNc o secuencias genómicas generalmente usan temperaturas más elevadas, por ejemplo, aproximadamente 40-42ºC, y un elevado porcentaje, por ejemplo, 50% de formamida. Siguiendo a la prehibridación, la sonda de oligonucleótido marcado 5'-^{32}p se añade al tampón, y los filtros se incuban en esta mezcla en condiciones de hibridación. Tras el lavado, los filtros tratados se someten a autorradiografía para mostrar la situación de la sonda hibridada; el ADN en las localizaciones correspondientes en las placas de agar originales se usa como fuente del ADN necesario.
Para construcciones de vectores rutinarias, las mezclas de unión se transforman en la cadena HB101 de E. coli u otro huésped aceptable, y transformadores aceptables se seleccionan mediante resistencia a antibióticos u otros marcadores. Luego se preparan los plásmidos de los transformadores de acuerdo con el procedimiento de Clewell y col. (1969), habitualmente usando amplificación con cloranfenicol (Clewell (1972)). El ADN se aísla y analiza, normalmente por análisis y/o secuenciación de enzima de restricción. La secuenciación se puede realizar mediante el procedimiento dideoxi de Sanger y col. (1977) como se describe también en Messing y col. (1981), o por el procedimiento de Maxam y col. (1980). Los problemas con la compresión de la banda, que a veces se observan en regiones ricas en GC, se solucionaron con el uso de T-deazoguanosina según Barr y col. (1986).
El ensayo de inmunoabsorción unida a enzima (ELISA) se puede usar para medir concentraciones de antígeno o de anticuerpo. Este procedimiento depende de la conjugación de la enzima con un antígeno o un anticuerpo, y usa la actividad enzimática de unión como marcador cuantitativo. Para medir anticuerpos, el antígeno conocido se fija a una fase sólida (por ejemplo, un microplato o taza de plástico), incubada con diluciones de suero prueba, lavadas, incubadas con antiinmunoglobulina marcada con una enzima, y nuevamente lavadas. Las enzimas adecuadas para el marcado se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante. La actividad enzimática unida a la fase sólida se mide añadiendo el sustrato específico, y determinando la formación de producto o el uso de sustrato colorimétricamente. La actividad enzimática asociada es una función directa de la cantidad de anticuerpo asociado.
Para medir el antígeno, se fija un anticuerpo específico conocido a la fase sólida, se añade el material de la prueba conteniendo antígeno, tras la incubación se lava la fase sólida, y se añade un segundo anticuerpo marcado con enzima. Tras el lavado, se añade el sustrato, y se calcula la actividad enzimática colorimétricamente, y se relaciona con la concentración de antígeno.
Ejemplos
A continuación se describen ejemplos de la presente invención que se aportan sólo con intención ilustrativa, y no para limitar el alcance de la presente invención. En vista de la presente exposición, numerosas realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones serán aparentes para los expertos en la técnica.
Aislamiento y Secuenciación de los Clones 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e y CA167b de ADNc de HCV Superpuesto
Los clones 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e y CA167b se aislaron de la librería lambda-gt11 que contiene ADNc de HCV (ATCC Nº 40394), cuya preparación se describe en la EPO Publicada Nº 318.216 (publicada el 31 de marzo de 1989), y WO/89/04669 (publicada el 1 de junio de 1989). El examen de la librería se realizó con las sondas descritas abajo, usando el procedimiento descrito en Huynh (1985). Las frecuencias con las que aparecían los clones positivos con las respectivas sondas eran de aproximadamente 1 en 50.000.
El aislamiento del clon 13i se consiguió usando una sonda sintética derivada de la secuencia del clon 12f. La secuencia de la sonda era:
5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.
El aislamiento del clon 26j se consiguió usando una sonda derivada de la región 5' del clon K9-1. La secuencia de la sonda era:
5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.
Los procedimientos de aislamiento para el clon 12f y para el clon k9-1 (también llamado K9-1) se describen en la EPO Publicada Nº 318.216, y sus secuencias se muestran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de ADN de HCV de los clones 13i y 26j, se muestran en las Figuras 4 y 5, respectivamente. También se muestran los aminoácidos allí codificados, al igual que la superposición del clon 13i con el clon 12f, y la superposición del clon 26j con el clon 13i. Las secuencias de estos clones confirmaron la secuencia del clon K9-1. El clon K9-1 fue aislado de una librería de ADNc de HCV diferente (Véase la Patente Europea 0.218. 316).
El clon CA59a se aisló usando una sonda basada en la secuencia de la región 5' del clon 26j. La secuencia de esta sonda era:
5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3'.
Una sonda derivada de la secuencia del clon CA59a se usó para aislar el clon CA84a. La secuencia de la sonda usada para este aislamiento era:
5' AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.
El clon CA156e se aisló usando una sonda derivada de la secuencia del clon CA84a. La secuencia de la sonda era:
5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3'.
El clon CA167b se aisló usando una sonda derivada de la secuencia del clon CA156e. La secuencia de la sonda era:
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3'.
Las secuencias de nucleótidos de los ADNc de HCV en los clones CA59a, CA84a, CA156e, y CA167b, se muestran en las Figuras 6, 7, 8, y 9, respectivamente. Los aminoácidos allí codificados, al igual que la superposición con las secuencias de clones relevantes, también se muestran en las Figuras.
Creación de la Librería "pi" de ADNc de HCV
Se construyó una librería de ADNc de HCV, la librería "pi", de la misma tanda de plasma de chimpancé infeccioso usado para construir la librería lambda-gt11 de ADNc de HCV (ATCC Nº 40394) descrita en la EPO Publicada Nº 318.216, y usando esencialmente las mismas técnicas. Sin embargo, la construcción de la librería pi usó un procedimiento de extensión del iniciador, en el que el iniciador para la transcriptasa inversa se basaba en la secuencia del clon CA59A. La secuencia del iniciador era:
5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'.
Aislamiento y Secuenciación del Clon pi14a
El examen de la librería "pi" de ADNc de HCV descrita arriba, con la sonda usada para aislar el clon CA167b (Véase más arriba) dio como resultado el clon pi14a. El clon contiene aproximadamente 800 pares de bases de ADNc que se superpone a los clones CA167b, CA156e, CA84a y CA59a, que se aislaron de la librería lambda gt-11 de ADNc de HCV (ATCC Nº 40394). Además, pi14a también contiene aproximadamente 250 pares de bases de ADN que están hacia arriba del ADNc de HCV en el clon CA167b.
Aislamiento y Secuenciación de los Clones CA216a, CA290a y ag30a
Basándose en la secuencia del clon CA167b se hizo una sonda sintética que tiene la siguiente secuencia:
5' GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'.
La sonda anterior se usó para examinar la librería lambda-gt11 (ATCC Nº 40394), que produjo el clon CA216a, cuyas secuencias de HCV se muestran en la Figura 10.
Se hizo otra sonda basándose en la secuencia del clon CA216a que tiene la siguiente secuencia:
5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'.
El examen de la librería lambda-gt11 (ATCC Nº 40394) con esta sonda produjo el clon CA290a, mostrándose las secuencias de HCV allí incluidas en la Figura 11.
En un acercamiento paralelo, se hizo una librería de ADNc de extensión del iniciador usando ácidos nucleicos extraídos del mismo plasma infeccioso usado en la librería lambda-gt11 original descrita arriba. El iniciador usado se basaba en la secuencia de los clones CA216a y CA290a:
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3'.
La librería de ADNc se hizo usando procedimientos similares a aquellos descritos anteriormente para librerías usadas en el aislamiento de los clones pi14a y k9-1. La sonda usada para examinar esta librería se basaba en la secuencia del clon CA290a:
5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'.
El clon ag30a se aisló de la nueva librería con la sonda anterior, y contenía aproximadamente 670 pares de bases de la secuencia de HCV. Véase la Figura 12. Parte de esta secuencia se superpone a la secuencia de HCV de los clones CA216a y CA290a. Sin embargo, aproximadamente 300 pares de bases de la secuencia de ag30a está hacia arriba de la secuencia del clon CA290a. La secuencia que no se superpone muestra un codón de iniciación (*) y codones de finalización que pueden indicar el inicio del ORF de HCV. También se indican en la Figura 12 péptidos codificados pequeños putativos (#) que pueden jugar un papel en la regulación de la traducción, al igual que el primer aminoácido putativo del polipéptido putativo (/), y los aminoácidos hacia abajo allí codificados.
Aislamiento y Secuenciación del Clon CA205a
El clon CA205a se aisló de la librería lambda gt-11 original (ATCC Nº 40394), usando una sonda sintética derivada de la secuencia de HCV en el clon CA290a (Figura 11). La secuencia de la sonda era:
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3'.
La secuencia de ADNc de HCV en CA205a, que se muestra en la Figura 13, se superpone con las secuencias del ADNc en ambos clones ag30a y CA290a. La superposición de la secuencia con la de CA290a se muestra junto a la línea de puntos sobre la secuencia (la figura también muestra los aminoácidos putativos codificados en este fragmento).
Como se observa de las secuencias de ADNc de HCV en los clones CA205a y ag30a, la poliproteína de HCV putativa parece empezar en el codón de iniciación ATG; las secuencias de HCV en ambos clones contiene un codón en marco, de doble finalización y contiguo (TGATAG) cuarenta y dos nucleótidos hacia arriba desde este ATG. El ORF del HCV empieza tras estos codones de finalización, y se extienden por al menos 8907 nucleótidos (Véase el ADNc de HCV compuesto que se muestra en la Figura 17).
Aislamiento y Secuenciación del Clon 18g
Basándose en la secuencia del clon ag30a (Véase la Figura 12) y de un clon que se superpone de la librería lambda gt-11 original (ATCC Nº 40394), CA230a, se hizo una sonda sintética teniendo la siguiente secuencia:
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
El examen de la librería lambda-gt11 de ADNc de HCV original con la sonda produjo el clon 18g, cuya secuencia de ADNc de HCV se muestra en la Figura 14. También en la figura se muestra la superposición con el clon ag30a, y los polipéptidos putativos codificados en el ADNc de HCV.
El ADNc en el clon 18g (C18g o 18g) se superpone al de los clones ag30a y CA205a, descritos arriba. La secuencia de C18g también contiene la región del codón de finalización doble observado en el clon ag30a. La región de polinucleótido hacia arriba de estos codones de finalización presumiblemente representa parte de la región 5' del genoma de HCV, que puede contener ORFs cortos, y que se pueden confirmar mediante secuenciación directa del genoma de HCV purificado. Estos polipéptidos codificados pequeños putativos pueden jugar un papel regulador en la traducción. La región del genoma de HCV hacia arriba de la representada por C18g se puede aislar para el análisis de la secuencia usando esencialmente el procedimiento descrito en la EPO Publicada Nº 318,216 para el aislamiento de secuencias de ADNc hacia arriba de la secuencia de ADNc de HCV en el clon 12f. Esencialmente, los iniciadores de oligonucleótidos sintéticos pequeños de la transcriptasa inversa, que se basan en la secuencia de C18g, se sintetizan y usan para unir a la secuencia correspondiente en el ARN genómico de HCV. Las secuencias iniciadoras están próximas al extremo 5' conocido del C18g, pero lo suficientemente hacia abajo para permitir el diseño de secuencias de sonda hacia arriba de las secuencias iniciadoras. Se usan procedimientos estándares conocidos de iniciación y clonación. Las librerías de ADNc resultantes se examinan con secuencias ascendentes de los sitios iniciadores (como se deduce de la secuencia de C18g dilucidada). El ARN genómico de HCV se obtiene de muestras de plasma o de hígado de individuos con NANBH. Como el HCV es un virus tipo Flavi, el extremo 5' del genoma se puede modificar con una estructura rematada. Se sabe que los genomas de Flavivirus contienen estructuras rematadas en el extremo 5'. (Yellow Fever Virus, Rice y col. (1988); Dengue Virus, Hahn y col (1988); Japanese Encephalitis Virus (1987)).
Aislamiento y Secuenciación de Clones de la Librería de ADNc de beta-HCV
Los clones que contienen ADNc representativo de la región terminal 3' del genoma de HCV se aislaron de una librería de ADNc construida a partir de la mezcla de plasma de chimpancé infeccioso original que se usó para la creación de la librería lambda-gt11 de ADNc de HCV (ATCC Nº 40394), descrito en la EPO Publicada Nº 318.216. Para crear una librería de ADN, se "ató" ARN extraído de plasma con poli rA usando poli (rA) polimerasa, y se sintetizó ADNC usando oligo(dT)_{12-18} como iniciador para la transcriptasa inversa. El híbrido ARN:ADNc resultante se digirió con ARNasa H, y se convirtió en ADNc de HCV de doble cadena. El ADNc de HCV resultante se clonó a lambda-gt10, usando esencialmente el procedimiento descrito en Huyhn (1985), produciendo la librería de ADNc de HCV beta (o b). Los procedimientos usados fueron como sigue.
Se trató una alícuota (12 ml) del plasma con proteinasa K, y se extrajo con un volumen igual de fenol saturado con CL-Tris 0,05M, pH 7,5, betamercaptoetanol al 0,05% (v/v), hidroxiquinolona al 0,1% (p/v), EDTA 1 mM. Se reextrajo la fase acuosa resultante con la mezcla de fenol, seguido de 3 extracciones con una mezcla 1:1 conteniendo fenol y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), seguido de 2 extracciones con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (1:1). Subsiguiente al ajuste de la fase acuosa a 200 mM con respecto a ClNa, se precipitaron los ácidos nucleicos en la fase acuosa durante la noche a -20ºC, con 2,5 volúmenes de etanol absoluto frío. Se recogieron los precipitados mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 40 min., se lavaron con etanol al 70% conteniendo ClNa 20 mM, y con etanol frío al 100%, secándose durante 5 min. en un desecador, y se disolvieron en agua.
Los ácidos nucleicos aislados de la mezcla de plasma de chimpancé infeccioso se ataron con poli rA usando polimerasa poli-A en presencia de inhibidor de la ribonucleasa de placenta humana (HPRI) (comprado en Amersham Corp.), usando ARN MS2 como portador. Se incubaron ácidos nucleicos aislados equivalentes a los de 2 ml de plasma en una solución que contiene TMN (Tris ClH 50 mM, pH 7,9, Cl_{2}Mg 10 mM, ClNa 250 mM, Cl_{2}Mn 2,5 mM, ditiotreitol 2 mM (DTT), alfa-[^{32}P] ATP 40 micromolar, 20 unidades de HPRI (Amersham Corp.), y aproximadamente 9 a 10 unidades de poli-A polimerasa libre ARNasa (BRL). La incubación duró 10 min. a 37ºC, y se pararon las reacciones con EDTA (concentración final de aproximadamente 250 mM). Se extrajo la solución con un volumen igual de fenol-cloroformo, y con un volumen igual de cloroformo, y se precipitaron los ácidos nucleicos durante la noche a -20ºC con 2,5 volúmenes de etanol en presencia de ClNa 200 mM.
Aislamiento del Clon b5a
La librería beta de ADNc de HCV se examinó mediante hibridación usando una sonda sintética, que tenía una secuencia basada en la secuencia de ADNc de HCV en el clon 15e. El aislamiento del clon 15e se describe en la EPO Publicada Nº 318,216, y su secuencia se muestra en la Figura 3. La secuencia de la sonda sintética era:
5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'.
El examen de la librería produjo el clon beta-5a (b5a), que contiene una región de ADNc de HCV de aproximadamente 1.000 pares de bases. La región 5' de este ADNc se superpone a los clones 35f, 19g, 26g, y 15e (estos clones se describen más arriba). La región entre la secuencia poli-A en el extremo 3' y la secuencia 3' que se superpone al clon 15e, contiene aproximadamente 200 pares de bases. Este clon permite la identificación de una región de la secuencia 3'-terminal del genoma de HCV.
La secuencia de b5a está incluida en la secuencia de ADNc de HCV del clon 16jh (descrita abajo). Además, la secuencia también está presente en CC34a, aislado de la librería lambda-gt11 original (ATCC Nº 40394). (Se hace aquí referencia a la librería lambda-gt11 original como librería "C").
Aislamiento y Secuenciación de Clones Generados por Amplificación PCR de la Región 3' del Genoma de HCV
Se generaron múltiples clones de ADNc que contienen secuencias de nucleótidos derivadas de la región 3' del genoma de HCV. Esto se consiguió amplificando una región objetivo del genoma mediante un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa descrito en Saiki y col. (1986), y en Saiki y col. (1988), que se modificó como se describe abajo. El ARN de HCV amplificado se obtuvo de la mezcla de plasma de chimpancé infeccioso original que se usó para la creación de la librería lambda-gt11 de ADNc de HCV (ATCC Nº 40394) descrito en la EPO Publicada Nº 318,216. El aislamiento del ARN de HCV fue como se describe arriba. El ARN aislado se ató en el extremo 3' con ATP con polimerasa poli-A de E. coli como se describe en Sippel (1973), excepto que los ácidos nucleicos aislados de suero de chimpancé fueron sustituidos por el sustrato de ácido nucleico. El ARN atado luego se transcribió inversamente a ADNc mediante transcriptasa inversa, usando un adaptador del iniciador oligo dT, esencialmente como describe Han (1987), excepto que los componentes y la secuencia del iniciador-adaptador fueron:
Relleno NotI Promotor SP6 Iniciador
AATTC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T_{15}
El ADNc resultante se sometió a amplificación mediante PCR usando dos iniciadores:
Iniciador Secuencia
JH32 (30mero) ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
JH11 (20mero) AATTCGGGCGGCCGCCATACGA
El iniciador JH32 contenía 20 secuencias de nucleótidos hibridizables al extremo 5' de la región objetivo en el ADNc, con una T_{m} estimada de 66ºC. El JH11 se derivó de una porción del adaptador del iniciador oligo dT; así, es específico para el extremo 3' del ADNc con una T_{m} de 64ºC. Ambos iniciadores se designaron para tener un sitio de reconocimiento para la enzima restrictiva, NotI, en el extremo 5', para usar en la clonación subsiguiente del ADNc de HCV amplificado.
La reacción PCR se llevó a cabo suspendiendo el ADNc y los iniciadores en 100 microlitros de mezcla de reacción conteniendo los cuatro trifosfatos de desoxinucleósido, sales tamponadoras e iones metálicos, y una ADN polimerasa termoestable aislada de Thermus aquaticus (Taq polimerasa), que están en un equipo Perkin Elmer Cetus PCR (N801-0043 o N801-0055). La reacción PCR se realizó por 35 ciclos en un ciclador térmico de ADN Perkin Elmer Cetus. Cada ciclo consistía de un paso de desnaturalización de 1,5 min. a 94ºC, un paso de calentamiento a 60ºC por 2 min., y un paso de extensión del iniciador a 72ºC por 3 min. Los productos PCR se sometieron a análisis de puntos Southern usando una sonda de 30 nucleótidos, JH34, cuya secuencia se basó en la de la región 3'-terminal del clon 15e. La secuencia de JH34 es:
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3'.
Los productos PCR detectados mediante la sonda de ADNc de HCV estaban en un intervalo de tamaño de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 pares de bases.
Para clonar el ADNc de HCV amplificado, los productos PCR se dividieron con NotI y seleccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. El ADN mayor de 300 pares de bases se clonó en el sitio NotI de pUC18S. El vector pUC18S se construye incluyendo un poliunidor NotI clonado entre los sitios EcoRI y SalI de pUC18. Los clones se examinaron para buscar ADNc de HCV usando la sonda JH34. Se obtuvo una variedad de clones positivos y se secuenciaron. La secuencia de nucleótidos del ADNc de HCV insertada en uno de estos clones, 16jh, y los aminoácidos allí codificados, se muestran en la Figura 15. Una heterogenicidad de nucleótidos, detectados en la secuencia del ADNc de HCV en el clon 16jh en comparación con otro clon de esta región, se indica en la figura.
Secuencias de ADNc de HCV Compiladas
Se compiló una secuencia de ADNc de HCV de una serie de clones que se superponen derivados de las diversas librerías de ADNc de HCV descritas arriba. En esta secuencia, la secuencia de ADNc de HCV compilada obtenida de los clones b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, y CA59a está hacia arriba de la secuencia de ADNc de HCV compilada publicada en EPO Publicada 318.216, que se muestra en la Figura 16. La secuencia de ADNc de HCV compilada obtenida de los clones b5a y 16jh hacia abajo de la secuencia de ADNc de HCV está publicada en la EPO Publicada Nº 318.216.
La Figura 17 muestra la secuencia de ADNc de HCV compilada de los clones descritos anteriormente y la secuencia de ADNc de HCV compilada publicada en la EPO Publicada Nº 318.216. Los clones de los que se derivó la secuencia son b114a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pi14a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (también llamado k9-1), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, y 16jh. En la figura los tres guiones sobre la secuencia indican la posición del codón de metionina iniciador putativo.
El clon b114a se obtuvo usando el procedimiento clonador descrito para el clon b5a, arriba, excepto que la sonda era la sonda sintética usada para detectar el clon 18g, arriba. El clon b114a se superpone con los clones 18g, ag30a, y CA205a, excepto que el clon b114a contiene dos nucleótidos extra hacia arriba de la secuencia en el clon 18g (esto es, 5'-CA). Estos dos nucleótidos extra se han incluido en la secuencia genómica de HCV que se muestra en la Figura 17.
Se debe remarcar que aunque varios de los clones descritos arriba se han obtenido de librerías distintas de la librería C lambda-gt11 de ADNc de HCV original (ATCC Nº 40394), estos clones contienen secuencias de ADNc de HCV que se superponen con secuencias de ADNc de HCV de la librería original. Así, esencialemnte toda la secuencia de HCV se puede derivar de la librería C lambda-gt11 original (ATCC Nº 40394) que se usó para aislar el primer clon (5-1-1) de ADNc de HCV. El aislamiento del clon 5-1-1 se describe en la EPO Publicada Nº 318.216.
Purificación del Polipéptido de Fusión C100-3 (Procedimiento alternativo)
El polipéptido de fusión, C100-3 (también llamado HCV C100-3 y alternativamente, c100-3), está compuesto de superóxido dismutasa (SOD) en el extremo N y de un polipéptido C100 HCV en marco en el extremo C. Un procedimiento para preparar el polipéptido por expresión en levadura, y la extracción diferencial de la fracción insoluble de las células de levadura del huésped extraídas, se describe en la EPO Publicada Nº 318.216. Más adelante se describe un procedimiento alternativo para la preparación de este polipéptido de fusión. En este procedimiento el antígeno se precipita del lisado de la célula cruda con acetona; luego se somete el antígeno precipitado con acetona a cromatografía de intercambio iónico, y luego se purifica mediante filtración en gel.
El polipéptido de fusión, C100-3 (HCV c100-3), se expresa en la cadena de levadura JSC 308 (ATCC Nº 20879) se transforma con pAB24C100-3 (ATCC Nº 67976); la levadura transformada se cultiva en condiciones que permiten la expresión (esto es, mediante crecimiento en YEP conteniendo glucosa 1%). (Véase EPO Publicada Nº 318.216). Se prepara un lisado celular suspendiendo las células en Tampón A (Tris ClH 20mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM). Las células se rompen mediante pulverización con bolas de cristal en un homegenizador tipo Dynomill o su equivalente. La extensión de la rotura celular se monitoriza contando células al microscopio con óptica de fase. Las células rotas se ven oscuras, mientras que las células viables son de color claro. Se determina el porcentaje de células rotas.
Cuando el porcentaje de células rotas es aproximadamente el 90% o mayor, los restos de células rotas se separa de las bolas de cristal mediante centrifugación, y las bolas de cristal se lavan con el Tampón A. Tras combinar los lavados y el homogéneo, se obtiene el material insoluble en el lisado mediante centrifugación. Se lava el material en las bolas para retirar las proteínas solubles mediante suspensión en Tampón B (glicina 50 mM, pH 12,0, DTT 1 MM, ClNa 500 mM), seguido del Tampón C (glicina 50 mM, pH 10,0, DTT 1 mM). Se recupera el material insoluble mediante centrifugación, y se solubiliza mediante suspensión en Tampón C conteniendo SDS. La solución extraída se puede calentar en presencia de beta-mercaptoetanol y concentrarse mediante ultrafiltración. Se precipita el HCV c100-3 en el extracto con acetona fría. Si se desea, se puede almacenar el precipitado a temperaturas de aproximadamente o por debajo de -15ºC.
Antes de la cromatografía de intercambio iónico, se recupera el material precipitado con acetona mediante centrifugación, y se puede secar en nitrógeno. Se suspende el precipitado en Tampón C (glicina 50 mM, pH 10,0, DTT 1 mM, urea 7 M), y se centrifuga a material insoluble de la bola. El material sobrenadante se aplica a una columna de intercambio aniónico previamente equilibrada con Tampón D. Se recogen las fracciones y se analizan con absorbancia ultravioleta o electroforesis en gel con geles de poliacrilamida SDS. Esas fracciones que contienen el polipéptido c100-3 de HCV se mezclan.
Para purificar el polipéptido c100-3 de HCV mediante filtración en gel, las fracciones mezcladas de la columna de intercambio iónico se calientan en presencia de beta-mercaptoetanol y SDS, y el eluado se concentra por ultrafiltración. El concentrado se aplica a una columna de filtración en gel previamente equilibrada con el Tampón E (ClH Tris 20 mM, pH 7,0, DTT 1 mM, SDS 0,1%). La presencia de c100-3 de HCV en las fracciones eluídas, al igual que la presencia de impurezas, se determina mediante electroforesis en gel con geles de poliacrilamida en presencia de SDS y visualización de los polipéptidos. Se mezclan aquellas fracciones que contienen c100-3 de HCV. Las fracciones que tienen mucho c100-3 de HCV se pueden purificar más repitiendo el proceso de filtración en gel. Si se desea retirar el material particulado, se puede filtrar el material que contiene c100-3 de HCV con un filtro de 0,22 micrómetros.
Expresión y Antigenicidad de Polipéptidos Codificados en ADNc del HCV Polipéptidos Expresados en E. coli
Los polipéptidos codificados en un número de ADNc de HCV que abarcan el ORF genómico del HCV se expresaron en E. Coli, y se probó su antigenicidad usando suero obtenido de una variedad de individuos con NANBH. Los vectores de expresión que contienen los ADNc de HCV se construyeron a partir de pSODcfl (Steimer y col. (1986)). Para asegurarse el conseguir un marco de lectura correcto, se crearon tres vectores de expresión separados, pcf1AB, pcf1CD, y pcf1EF ligando cualquiera de los tres acopladores AB, CD, y EF a un fragmento BamHI-EcoRI derivado por digestión para terminar el vector pSODcf1 con EcoRI y BamHI, seguido de tratamiento con fosfatasa alcalina. Los acopladores se crearon de seis oligómeros, A, B, C, D, E, y F. Cada oligómero se fosforiló mediante tratamiento con quinasa en presencia de ATP previo al calentamiento de su oligómero complementario. Las secuencias de los acopladores sintéticos fueron los siguientes.
1
Cada uno de los tres acopladores destruye el sitio EcoRI original, y crea un nuevo sitio EcoRI dentro del acoplador, pero dentro de un marco de lectura diferente. Por tanto, los fragmentos de EcoRI del ADNc del HCV aislados de los clones cuando se insertan en el vector de expresión, estaban en tres marcos de lectura diferentes.
Los fragmentos de ADNc del HCV en los clones lambda-gt11 designados se eliminaron mediante digestión con EcoRI; cada fragmento se insertó en pcf1AB, pcf1CD, y pcf1EF. Estas construcciones de expresión se transformaron en células de E. coli D1210, los transformantes se clonaron, y se indujo a las bacterias recombinantes de cada clon a expresar los polipéptidos de fusión mediante el crecimiento de las bacterias en presencia de IPTG.
Se probó la antigenicidad de los productos de expresión de los ADNc del HCV indicados mediante examen inmunológico directo de las colonias, usando una modificación del procedimiento descrito en Helfman y col. (1983). Brevemente, como se muestra en la Fig. 18, las bacterias se recubren en filtros de nitrocelulosa recubierta en bandejas de ampicilina para dar aproximadamente 1.000 colonias por filtro. Las colonias se vuelven a recubrir con filtros de nitrocelulosa, y las réplicas se vuelven a desarrollar durante la noche en presencia de IPTG 2 mM y ampicilina. Las colonias bacterianas se lisaron mediante suspensión en filtros de nitrocelulosa durante aproximadamente 15 a 20 min en una atmósfera saturada con vapor de Cl_{3}CH. Luego se puso cada filtro en una placa Petri de 100 mm individual que contenía 10 ml de ClH Tris 50 mM, pH 7,5, ClNa 150 mM, Cl_{2}Mg 5 mM, BSA (p/v) al 3%, 40 microgramos/ml de lisozima, y 0,1 microgramos/ml de ADNasa. Las bandejas se agitaron suavemente durante al menos 8 horas a temperatura ambiente. Los filtros se enjuagaron en TBST (ClH Tris 50 mM, pH 8,0, ClNa 150 mM, Tween 20 al 0,005%). Tras la incubación, los residuos celulares se enjuagaron e incubaron en TBS (TBST sin Tween) conteniendo un 10% de suero de oveja; la incubación duró una hora. Luego se incubaron los filtros con sueros de individuos con NANBH pretratados en TBS, que incluían: 3 chimpancés; 8 pacientes con NANBH crónica cuyos sueros eran positivos con respecto a anticuerpos del polipéptido C100-3 del HCV (descrito en la EPO Publicada Nº 318,216, y superiores) (también llamado C100); 8 pacientes con NANBH crónica cuyos sueros eran negativos para anticuerpos anti-C100; un paciente convaleciente cuyo suero era negativo para anticuerpos anti-C100; y 6 pacientes con NANBH adquirido por la comunidad, incluyendo uno cuyo suero era fuertemente positivo con respecto a anticuerpos anti-C100, y uno cuyo suero era ligeramente positivo con respecto a anticuerpos anti-C100. Los sueros, diluidos en TBS, se pretrataron mediante preabsorción con hSOD. La incubación de los filtros con los sueros duró al menos dos horas. Tras la incubación, los filtros se lavaron dos veces por 30 min con TBST. Se realizó el marcado de las proteínas expresadas a las que se unían los anticuerpos de los sueros mediante incubación durante 2 horas con anticuerpo anti-humano de oveja marcado con ^{125}I. Tras el lavado, los filtros se lavaron dos veces durante 30 min con TBST, se secaron, y se autorradiografiaron.
Un número de clones (véase abajo) expresaron polipéptidos que contenían epitopos del HCV que eran reactivos inmunológicamente con suero de individuos con NANBH. Cinco de estos polipéptidos eran muy inmunogénicos en que se detectaron anticuerpos de epitopos del HCV en estos polipéptidos en muchos sueros de pacientes diferentes. Los clones que codifican estos polipéptidos, y la situación del polipéptido en la poiproteína putativa del HCV (en la que los números de aminoácidos comienzan con el codón iniciador putativo) son los siguientes: clon 5-1-1, aminoácidos 1694-1735; clon C100, aminoácidos 1569-1931; clon 33c, aminoácidos 1192-1457; clon CA279a, aminoácidos 1-84; y clon CA290a, aminoácidos 9-177. La situación de los polipéptidos inmunogénicos dentro de la poliproteína putativa del HCV se muestran inmediatamente a continuación.
Clones que codifican polipéptidos de reactividad probada con sueros de pacientes con NANBH
Clon Situación dentro de la poliproteína del HCV
(nº de aminoácido empezando con la metionina iniciadora putativa)
CA279a 1-84
CA290a 9-177
Los resultados sobre la inmunogenicidad de los polipéptidos codificados en los diversos clones examinados sugerían que los sistemas de detección e inmunización eficientes pueden incluir paneles de polipéptidos/epitopos del HCV.
Expresión de Epitopos del HCV en Levadura
Se construyen tres vectores de expresión en levadura diferentes que permiten la inserción de ADNc del HCV en tres marcos de lectura diferentes. La construcción de uno de los vectores, pAB24C100-3 se describe en la EPO Publicada Nº 318.216. En los estudios más abajo, el ADNc del HCV de los clones enumerados arriba en el estudio de mapeo de la antigenicidad usando los productos expresados de E. coli se sustituyen con el ADNc C100 del HCV. La construcción de los otros vectores sustituye el adaptador descrito en los estudios anteriores de E. coli con uno de los siguientes adaptadores:
Adaptador 1
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
Adaptador 2
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc del HCV insertado se expresa en levadura transformada con los vectores, usando las condiciones de expresión descritas arriba para la expresión del polipéptido de fusión, C100-3. Los polipéptidos resultantes se examinan usando los sueros de individuos con NANBH, descritos arriba para el examen de polipéptidos inmunogénicos codificados en los ADNc del HCV expresados en E. coli.
Comparación de los Perfiles Hidrófobos de las Poliproteínas del HCV con la Poliproteína del Virus West Nile y el Virus del Dengue SN1
Se comparó el perfil de hidrofobicidad de un segmento de poliproteína del HCV con el de un Flavivirus típico, el virus West Nile. Se dedujo la secuencia del polipéptido de la poliproteína del virus West Nile a partir de secuencias de polinucleótidos conocidas que codifican las proteínas no estructurales de ese virus. La secuencia de la poliproteína del HCV se dedujo de la secuencia de clones de ADNc superpuestos. Los perfiles se determinaron usando un programa antigénico que usa una ventana de 7 aminoácidos de ancho (el aminoácido en cuestión, y 3 residuos en cada lado) para informar de la hidrofobicidad media de un residuo de aminoácido dado. Los parámetros que dan la hidrofobicidad reactiva de cada residuo de aminoácido son de Kyte y Doolittle (1982). La Fig. 19 muestra los perfiles hidrófobos de las dos poliproteínas; las áreas que corresponden a las proteínas no estructurales del virus West Nile, de ns1 a ns5, se indican en la figura. Como se observa en la figura, hay una similitud general en los perfiles de la poliproteína del HCV y la poliproteína del virus West Nile.
Se ha comparado la secuencia de aminoácidos codificada en la región 5' del ADNc del HCV que se muestra en la Fig. 16 con la correspondiente región de una de las cadenas del virus del Dengue, descrito arriba, con respecto al perfil de regiones de hidrofobicidad e hidrofilicidad (no se muestran los datos). Esta comparación indicaba que los polipéptidos del HCV y del Dengue codificados en esta región, que corresponde con la región que codifica NS1 (o una porción de la misma), tienen un perfil de hidrofobicidad/hidrofilicidad similares.
La similitud en los perfiles de hidrofobicidad, en combinación con las homologías previamente identificadas en las secuencias de aminoácidos del HCV y del Flavivirus del Dengue en la Patente Europea 0,218,316 sugiere que el HCV está relacionado con estos miembros de la familia de los Flavivirus.
Caracterización de los Polipéptidos Putativos Codificados en el ORF del HCV
La secuencia de la cadena de sentido del ADNc del HCV, que se muestra en la Fig. 17, se dedujo de los ADNc del HCV superpuestos en los diversos clones descritos en la EPO Publicada Nº 318.216 y aquellos descritos arriba. Se puede deducir de la secuencia que el genoma del HCV contiene fundamentalmente un ORF largo y continuo, que codifica una poliproteína. En la secuencia, el nucleótido número 1 corresponde al primer nucleótido del codón iniciador MET; los números negativos indican que los nucleótidos están a esa distancia en la dirección 5' (hacia arriba), mientras que los números positivos indican que los nucleótidos están a esa distancia en la dirección 3' (hacia abajo). La secuencia compuesta muestra la cadena de "sentido" del ADNc del HCV.
La secuencia de aminoácidos de la poliproteína putativa del HCV deducida de la secuencia de la cadena de sentido del ADNc del HCV también se muestra en la Fig. 17, donde la posición 1 empieza con el iniciador putativo metio-
nina.
Posibles dominios proteicos de la poliproteína del HCV codificada, al igual que los límites aproximados, son los siguientes (los polipéptidos identificados dentro de los paréntesis son los que están codificados en el dominio del Flavivirus):
Dominio Putativo \hskip-1cm Límite Aproximado
\hskip-1cm (nº de aminoácido)
"C" (proteína de la nucleocápside) 1-120
"E" (proteína(s) de la envoltura del virión y posiblemente proteínas 120-400
de la matriz(M))
"NS1" (¿antígeno de fijación del complemento?) 400-600
"NS2" (función desconocida) 660-1050
"NS3" (¿proteasa?) 1050-1640
"NS4" (función desconocida) 1640-2000
"NS5" (polimerasa) 2000-? Final
Sin embargo, se debe señalar, que los perfiles de hidrofobicidad (descritos abajo), indican que el HCV diverge del modelo Flavivirus, particularmente con respecto a la región cadena arriba de NS2. Además, no se pretende que los límites indicados muestren una firme demarcación entre los polipéptidos putativos.
El Perfil Hidrófilo y Antigénico del Polipéptido
Se determinaron los perfiles de hidrofilicidad/hidrofobicidad y el índice antigénico de la poliproteína putativa codificada en la secuencia del ADNc del HCV que se muestra en la Fig. 16 mediante análisis por ordenador. El programa para determinar la hidrofilicidad/hidrofobicidad se realizó como se describe arriba. El índice antigénico resulta de un programa informático que se basa en los siguientes criterios: 1) probabilidad de la superficie, 2) predicción de la helicidad alfa por dos procedimientos diferentes; 3) predicción de las regiones de la hoja beta por dos procedimientos diferentes; 4) predicción de vueltas U mediante dos procedimientos diferentes; 5) hidrofilicidad/hidrofobicidad; y flexibilidad. Los trazos de los perfiles generados por el análisis informático se muestran en la Fig. 20. En el perfil de hidrofilicidad, la desviación sobre la abscisa indica hidrofilicidad, y debajo de la abscisa indica hidrofobicidad. Normalmente se considera que la probabilidad de que una región de un polipéptido sea antigénica aumenta cuando hay una desviación hacia arriba de la abscisa en el perfil hidrófilo y/o antigénico. Se debe señalar, sin embargo, que estos perfiles no son necesariamente indicadores de la fuerza de la inmunogenicidad de un
polipéptido.
Identificación de Péptidos Colineales en HCV y Flavivirus
La secuencia de aminoácidos de la poliproteína putativa codificada en la cadena de sentido del ADNc del HCV se comparó con las secuencias de aminoácidos conocidas de varios miembros de los Flavivirus. La comparación muestra que la homología es leve, pero debido a las regiones en las que se encuentra, probablemente es significativa. Las regiones colineales conservadas se muestran en la Fig. 21. Los números de aminoácidos enumerados debajo de las secuencias representan el número en la poliproteína putativa del HCV (Véase la Fig. 17).
El espaciado de estos motivos conservados es similar entre los Flavivirus y el HCV, e implica que hay cierta similitud entre el HCV y estos agentes flavivirales.
Los siguientes materiales enumerados están en depósito según los términos del Tratado de Budapest con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, y se les han asignado los siguientes Números de Registro.
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Lambda-gt11 ATCC Nº Fecha de Depósito
librería del ADNc del HCV 40394 1 Dic. 1987
clon 81 40388 17 Nov. 1987
clon 91 40389 17 Nov. 1987
clon 1-2 40390 17 Nov. 1987
clon 5-1-1 40391 18 Nov. 1987
clon 12f 40514 10 Nov. 1988
clon 35f 40511 10 Nov. 1988
clon 15e 40513 10 Nov. 1988
clon K9-1 40512 10 Nov. 1988
JSC 308 20879 5 Mayo 1988
ps356 67683 29 Abril 1988
Además, el 11 de mayo de 1989 se hicieron los siguientes depósitos.
Cadena Acoplador ATCC Nº
D1210 (Cf1/5-1-1) EF 67967
D1210 (Cf1/81) EF 67968
D1210 (Cf1/CA74a) EF 67969
D1210 (Cf1/35f) AB 67970
D1210 (Cf1/279a) EF 67971
D1210 (Cf1/C36) CD 67972
D1210 (Cf1/13i) AB 67973
D1210 (Cf1/C33b) EF 67974
D1210 (Cf1/CA290a) AB 67975
HB101 (AB24/C100 #3R) 67976
Los siguientes derivados de la cadena D1210 se depositaron el 3 de mayo de 1989.
Derivado de Cadena ATCC Nº
pCF1CS/C8f 67956
pCF1AB/C12f 67952
pCF1EF/14c 67949
pCF1EF/15e 67954
pCF1AB/C25c 67958
pCF1EF/C33c 67953
pCF1EF/C33f 67050
pCF1CD/33g 67951
pCF1CD/C39c 67955
pCF1EF/C40b 67957
pCF1EF/CA167b 67959
Las siguientes cadenas se depositaron el 12 de mayo de 1989.
Cadena ATCC Nº
Lambda gt11 (C35) 40603
Lambda gt10 (beta-5a) 40602
D1210 (C40b) 67980
D1210 (M16) 67981
Los materiales depositados mencionados en la presente memoria descriptiva sólo son por conveniencia, y no se necesitan para practicar la presente invención en vista de las descripciones de la presente memoria, y además estos materiales se incorporan aquí como referencia.
Aplicaciones industriales
La invención, en las diferentes manifestaciones aquí expuestas, tiene muchos usos industriales, algunos de los cuales son los siguientes. Los ADNc del HCV se pueden usar para el diseño de sondas para la detección de ácidos nucleicos del HCV en muestras. Las sondas derivadas de los ADNc se pueden usar para detectar ácidos nucleicos del HCV en, por ejemplo, reacciones químicas sintéticas. También se pueden usar en el examen de programas para agentes anti-virales, para determinar el efecto de los agentes en la inhibición de la replicación viral en sistemas de cultivo celular, y en sistemas de modelo animal. Las sondas de polinucleótidos del HCV también son útiles en la detección de ácidos nucleicos virales en humanos, y así, pueden servir de base para el diagnóstico de las infecciones por HCV en humanos.
Además de lo anterior, los ADNc aquí expuestos aportan información y un medio para sintetizar polipéptidos que contienen epitopos del HCV. Estos polipéptidos son útiles en la detección de anticuerpos para antígenos del HCV. En la presente memoria descriptiva se describen una serie de inmunoensayos para la infección por HCV, basados en polipéptidos recombinantes que contienen epitopos del HCV, y encontrarán un uso comercial en el diagnóstico de la NANBH inducida por HCV, en el examen de donantes de bancos de sangre para detectar hepatitis infecciosa causada por HCV, y también para detectar sangre contaminada de donantes de sangre infectados. Los antígenos virales también serán útiles en la monitorización de la eficacia de los agentes anti-virales en sistemas modelo animal. Además, los polipéptidos derivados de los ADNc del HCV aquí expuestos serán útiles como vacunas para el tratamiento de infecciones por HCV.
Los polipéptidos derivados de los ADNc del HCV, aparte de los usos indicados arriba, también son útiles para cultivar anticuerpos anti-HCV. Así, se pueden usar en vacunas anti-HCV. Sin embargo, los anticuerpos producidos como resultado de la inmunización con los polipéptidos del HCV también son útiles en la detección de la presencia de antígenos virales en muestras. Así, se pueden usar para ensayar la producción de polipéptidos del HCV en sistemas químicos. Los anticuerpos anti-HCV también se pueden usar para monitorizar la eficacia de agentes anti-virales en programas de examen en los que estos agentes se prueban en sistemas de cultivo tisulares. También se pueden usar en inmunoterapia pasiva, y para diagnosticar la NANBH causada por HCV al permitir la detección de antígenos virales tanto en donantes como en receptores de sangre. Otro uso importante para los anticuerpos anti-HCV está en la cromatografía de afinidad para la purificación de virus y polipéptidos virales. Las preparaciones de virus y polipéptidos virales purificados se pueden usar en vacunas. Sin embargo, el virus purificado también puede ser útil para el desarrollo de sistemas de cultivo celular en los que el HCV se replica.
Los polinucleótidos antisentido se pueden usar como inhibidores de la replicación viral.
Por conveniencia, los anticuerpos anti-HCV y los polipéptidos del HCV, naturales o recombinantes, se pueden empaquetar en equipos.

Claims (61)

1. Un procedimiento para preparar polipéptidos de forma sustancialmente aislada, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia contigua de una poliproteína de un Virus de la Hepatitis C (HCV) de al menos 10 aminoácidos, en el que dicha secuencia contigua está dentro de los aminoácidos 1 a 449 de una poliproteína del HCV, en el que el HCV se caracteriza por:
un genoma de ARN de cadena positiva;
comprendiendo dicho genoma un marco de lectura libre (ORF) que codifica una poliproteína; y
teniendo la totalidad de dicha poliproteína codificada al menos un 40% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína según se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del cual se prepararon ADNc depositados en la librería de ADN lambda gt-11 con la Colección de Cultivos Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394, que se caracteriza porque el procedimiento se selecciona del grupo de procedimientos que comprenden la síntesis química, la expresión de un sistema de expresión recombinante y el aislamiento de un HCV mutante.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 70% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del cual se prepararon ADNc depositados en una librería lambda gt-11 de ADNc con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 80% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del cual se prepararon ADNc depositados en librerías de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicho polipéptido tiene al menos un 90% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc de lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicha secuencia contigua se selecciona de entre los aminoácidos 1-84 o de entre los aminoácidos 9-177 de una poliproteína del HCV.
6. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que dicha secuencia contigua está dentro de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las Figuras 4, 11, 12 y 17.
7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha secuencia contigua comprende al menos 15 aminoácidos.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicha secuencia contigua tiene la fórmula AAx-AAy donde x e y designan los números de aminoácidos mostrados en la Figura 17:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-AA90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150;
AA150-AA200; AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;
AA400-AA450; AA405-AA415; AA415-AA425; AA425-AA435; AA440-AA460; AA437-AA582.
9. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho polipéptido reacciona inmunológicamente con anticuerpos anti-BHCV.
10. Un procedimiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende la unión del polipéptido a un sustrato sólido.
11. Un procedimiento de inmunoensayo para detectar anticuerpos dirigido contra un polipéptido del virus de la hepatitis C (HCV) que comprende:
(a) la aportación de un primer polipéptido que es inmunológicamente reactivo con anticuerpos anti-HCV como se determina por competición en la unión con un segundo polipéptido que comprende una secuencia antigénica del HCV de al menos 10 aminoácidos contiguos de entre los aminoácidos número 1-449 de la poliproteína del HCV.
(b) la incubación de dicho primer polipéptido con una muestra biológica z en condiciones que permiten la formación de un complejo anticuerpo-polipéptido; y
(c) la detección de cualquier complejo anticuerpo/polipéptido que comprenda dicho polipéptido, en el que el HCV se caracteriza por:
un genoma de ARN de cadena positiva
comprendiendo dicho genoma un marco de lectura libre (ORF) que codifica una poliproteína; y
teniendo la totalidad de dicha poliproteína codificada al menos un 40% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del cual se prepararon ADNc depositados en la librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
12. Un procedimiento de inmunoensayo según la reivindicación 11 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 70% de homología con la proteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
13. Un procedimiento de inmunoensayo según la reivindicación 11 en el que dicha poliproteína tiene al menos el 80% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
14. Un procedimiento de inmunoensayo según la reivindicación 11 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 90% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
15. Un procedimiento de inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en el que dichos aminoácidos se seleccionan de entre los aminoácidos 1-449 de la poliproteína del HCV de la Figura 17.
16. Un procedimiento de inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que dicho primer polipéptido comprende una secuencia antigénica del HCV de entre los aminoácidos número 1-449 de la poliproteína del HCV de la Figura 17.
17. Un procedimiento de inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que la muestra biológica es sangre, suero o plasma humano.
18. Un procedimiento para preparar un polinucleótido en forma sustancialmente aislada de dicho polinucleótido que comprende una secuencia genómica del HCV o el complemento del mismo que es hibridable selectivamente a un polinucleótido encontrado entre los nucleótidos -319 a 1348 de una genoma del HCV o el complemento del mismo, en el que el HCV se caracteriza por:
un genoma de ARN de cadena positiva;
comprendiendo dicho genoma un marco de lectura libre (ORF) que codifica una poliproteína; y
teniendo la totalidad de dicha poliproteína codificada al menos un 40% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394, caracterizada porque el procedimiento se selecciona de un grupo de procedimientos que comprenden la síntesis química, la replicación de ADN, la transcripción inversa y la transcripción.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 70% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 80% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
21. Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 90% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
22. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que dicha secuencia genómica del HCV o el complemento de la misma se encuentra entre los nucleótidos -319 a 1348 o entre los nucleótidos -319 a -1 del genoma del HCV.
23. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en el que dicha secuencia genómica del HCV o el complemento de la misma se selecciona de un grupo de secuencias encontradas en las Figuras 11, 12 y 17.
24. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23 en el que el polinucleótido es ADN.
25. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 en el que el polinucleótido es una sonda o un iniciador para la síntesis de ADN.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25 en el que la sonda está marcada.
27. Un procedimiento para detectar ácidos nucleicos del HCV en una muestra que comprende:
a. la aportación de un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26;
b. la reacción de dicho polinucleótido con dicha muestra en condiciones que permiten la formación selectiva de dúplex de polinucleótidos entre dicho polinucleótido y cualquier ácido nucleico del HCV o ADNc del HCV en dicha muestra; y
c. la detección de cualquier dúplex de polinucleótido que contenga dicho polinucleótido.
28. Un procedimiento para amplificar un polinucleótido del HCV en una muestra que comprende:
a. la amplificación del polinucleótido del HCV usando 2 polimerasas de ADN y al menos un polinucleótido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25; y
b. la detección del polinucleótido amplificado.
29. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 27 ó 28 en el que dicha muestra es sangre, suero, o plasma humano.
30. Un procedimiento para preparar un vector recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicha secuencia que codifica dicho polipéptido está unida de forma operativa a una secuencia de control capaz de expresar el polipéptido que se caracteriza por que dicho procedimiento comprende la obtención de fragmentos que codifican el polipéptido deseado de clones de ADNc mediante digestión restrictiva o síntesis química de dicha secuencia de polinucleótidos y la unión de dicha secuencia de polinucleótidos a un vector.
31. Un procedimiento según la reivindicación 30 en el que dicho polinucleótido es ADN.
32. Un procedimiento para preparar una célula huésped transformada con un vector recombinante como se preparó en la reivindicación 30 ó 31 que comprende:
a. la aportación de una célula huésped capaz de transformarse;
b. la aportación del vector recombinante; y
c. la incubación de (a) con (b) en condiciones que permiten la transformación de la célula huésped con el vector.
33. Un procedimiento para fabricar un polipéptido del HCV que comprende la incubación de una célula huésped preparada según la reivindicación 32 en condiciones que permiten la expresión de dicha secuencia que codifica un polipéptido, y la recuperación del polipéptido.
34. Un procedimiento para producir una sonda de polinucleótidos que comprende la síntesis química de un polinucleótido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26.
35. Un procedimiento para preparar un suministro de muestras biológicas humanas previo al uso de dicho procedimiento que comprende:
(a) el suministro de muestras biológicas humanas; y
(b) la retirada de dicho suministro de muestras biológicas humanas de aquellas muestras que contengan:
(i)
polinucleótidos capaces de detección en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28; o
(ii)
anticuerpos capaces de producir complejos de anticuerpos polipéptidos detectables en un procedimiento de inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17.
36. Un procedimiento según la reivindicación 35 en el que dichas muestras biológicas humanas son sangre, plasma o suero.
37. Un polipéptido en forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia contigua de una poliproteína de un Virus de la Hepatitis C (HCV) de al menos 10 aminoácidos, en el que dicha secuencia contigua está entre los aminoácidos 1 a 449 de una poliproteína del HCV, en la que el HCV se caracteriza por:
un genoma de ARN de cadena positiva;
comprendiendo dicho genoma un marco de lectura abierta (ORF) que codifica una poliproteína; y
teniendo la totalidad de dicha poliproteína codificada al menos un 40% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
38. Un polipéptido según la reivindicación 37 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 70% de homología con la proteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
39. Un polipéptido según la reivindicación 37 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 80% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
40. Un polipéptido según la reivindicación 37 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 90% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
41. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40 en el que dicha secuencia contigua se selecciona de entre los aminoácidos 1-84 o de entre los aminoácidos 9-177 de una poliproteína del HCV.
42. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41 en el que dicha secuencia contigua está en las secuencias seleccionadas del grupo consistente en la Figura 4, 11, 12 y 17.
43. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42 en el que dicha secuencia contigua comprende al menos 15 aminoácidos.
44. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43 en el que dicha secuencia contigua tiene la fórmula AAx-AAy donde x e y designan números de aminoácidos mostrados en la Figura 17:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20; AA35-AA45; AA50-AA100; AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-AA90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150;
AA150-AA200; AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA220-AA240; AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395; AA405-AA495;
AA400-AA450; AA405-AA415; AA415-AA425; AA425-AA435; AA440-AA460; AA437-AA582.
45. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44 en el que dicho polipéptido reacciona inmunológicamente con anticuerpos anti-HCV.
46. Un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 45 ligado a un sustrato sólido.
47. Un equipo de inmunoensayo que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 46 en un contenedor apropiado.
48. Un polipéptido polinucleótido en forma sustancialmente aislada que comprende una secuencia genómica de HCV o el complemento de la misma que es hibiridable selectivamente a un polinucleótido encontrado entre los nucleótidos -319 a 1348 de un genoma de HCV o el complemento del mismo, en el que el HCV se caracteriza por:
un genoma de ARN de cadena positiva;
comprendiendo dicho genoma un marco de lectura libre (ORF) que codifica una poliproteína; y
teniendo la totalidad de dicha poliproteína codificada al menos un 40% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
49. Un polinucleótido según la reivindicación 48 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 70% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
50. Un polinucleótido según la reivindicación 48 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 80% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
51. Un polinucleótido según la reivindicación 48 en el que dicha poliproteína tiene al menos un 90% de homología con la poliproteína completa seleccionada de (i) la poliproteína como se muestra en la Figura 17, o (ii) la poliproteína de un aislado viral del genoma del que se prepararon ADNc depositados en una librería de ADNc lambda gt-11 con la Colección de Cultivos de Tipo Estadounidense (ATCC) según el Registro Nº 40394.
52. Un polinucleótido según las reivindicaciones 48 a 51 en el que dicha secuencia genómica de HCV o el complemento del mismo se encuentra entre los nucleótidos -275319 a 1348 o entre los nucleótidos -319 a -1 de un genoma de HCV.
53. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 52 en el que dicha secuencia genómica de HCV o el complemento del mismo se selecciona de un grupo de secuencias que se encuentran en las Figuras 11, 12
y 17.
54. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 53 que es ADN.
55. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 54 que es una sonda o un iniciador para la síntesis de ADN.
56. Un polinucleótido según la reivindicación 55 en el que la sonda está marcada.
57. Un equipo para analizar muestras biológicas para detectar la presencia de polinucleótidos de HCV que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 56 en un recipiente apropiado.
58. Un vector recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 45 en el que dicha secuencia que codifica dicho polipéptido está unida de forma operativa a una secuencia de control capaz de expresar el polipéptido.
59. Un vector recombinante según la reivindicación 58 en el que dicho polinucleótido es ADN.
60. Una célula huésped transformada con el vector según cualquiera de las reivindicaciones 58 ó 59.
61. Una composición farmacéutica que comprende:
a. un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 48 a 54; o
b. un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 45; y
c. un portador farmacéutico aceptable.
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