BR112017010180B1 - Método para detectar a presença de norovírus, e, dispositivo de ensaio de fluxo contínuo para detecção de norovírus em uma amostra - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE NOROVÍRUS, E, DISPOSITIVO DE ENSAIO DE FLUXO CONTÍNUO PARA DETECÇÃO DE NOROVÍRUS EM UMA AMOSTRA. Tecnologias de ensaio de fluxo lateral e fluorescência com resolução temporal fornecem uma ferramenta sensível para a detecção de partículas de norovírus em uma amostra. Um dispositivo de ensaio de fluxo contínuo emprega norovírus e anticorpos G2 do norovírus. O ensaio de fluxo lateral inclui uma almofada conjugada tendo sondas conjugadas. As sondas conjugadas são partículas modificadas com um elemento de ligação que é configurado para se ligar a um norovírus. As partículas também têm um marcador fluorescente. Um método geral de detectar o vírus inclui (i) preparar uma amostra com contaminantes, (ii) processar a amostra e depositá-la no dispositivo de ensaio e (iii) medir o sinal de fluorescência.
Description
[001] A presente divulgação refere-se aos dispositivos e métodos para a detecção rápida de uma substância a analisar, em particular, dispositivos de ensaio que empregam marcadores fluorescentes para facilitar a detecção de certos micróbios, tais como norovírus.
[002] O norovírus é reconhecido como a principal causa de gastroenterite aguda não bacteriana. Geralmente, os genogrupos de norovírus GI e GII são responsáveis pela gastroenterite humana. Estudos sugerem que genogrupo GII, genótipo 4 (GII.4) é a principal causa de infecção de norovírus em todo o mundo.
[003] Os norovírus são altamente contagiosos, então doses muito baixas de partículas virais podem causar infecção. Partículas virais são excretadas nas fezes e vômito, e a transmissão ocorre pela ingestão de alimentos ou água contaminados e pelo contato com superfícies contaminadas. Estas características podem facilitar surtos em ambientes tais como escolas, creches, asilos, hospitais e configurações de hospitalidade, como hotéis e navios. Infecções por norovírus podem ser graves, especialmente para crianças e idosos. Cada ano nos Estados Unidos, estima-se que o norovírus causa de 570 a 800 mortes.
[004] A detecção rápida é importante na aplicação de medidas para reduzir a transmissão do vírus. A detecção do norovírus em superfícies duras é de particular interesse. Kits de ensaio comercialmente disponíveis com base em princípios imunocromatográficos (por exemplo, ensaios de RTqPCR) mostraram ser inconsistentes quando usados para testar superfícies duras, provavelmente porque a maioria das tecnologias existentes é projetada para testar a matéria fecal ou vômito, onde a carga particular é alta.
[005] Como tal, atualmente existe uma necessidade por um sistema rápido e eficaz para a detecção de baixas doses de norovírus em superfícies.
[006] É divulgado um método e dispositivo para detectar a presença de norovírus que reside em uma amostra de teste. O método inclui as seguintes etapas: i) fornecer um dispositivo de ensaio de fluxo contínuo que é composto por uma membrana porosa na comunicação fluida com uma almofada conjugada, a almofada conjugada incluindo sondas conjugadas compreendendo partículas modificadas com um elemento de ligação configurado para se ligar ao norovírus e contendo um marcador fluorescente, marcador fluorescente tendo um tempo de vida de emissão de fluorescência maior que cerca de 1 microssegundo, a membrana porosa definindo uma zona de detecção tendo uma linha de teste dentro da qual é imobilizado um anticorpo de norovírus configurado para se ligar ao norovírus, uma linha de controle posicionada a jusante da linha de teste, em que a linha de controle se imobilizou dentro de um anticorpo de norovírus G2 configurado para se ligar às sondas conjugadas; por em contato a almofada conjugada com a amostra de teste e permitir que as partículas fluam para a zona de detecção; sujeitar a linha de teste a pulsos de iluminação para gerar um sinal de detecção e, após um determinado período de tempo decorrido após pulso, medir a intensidade do sinal de detecção, em que um leitor de fluorescência é empregado para fornecer a iluminação e medir a intensidade do sinal de detecção, iv) submeter a linha de controle a pulsos de iluminação para gerar um sinal de calibração e após um determinado período de tempo decorrido após um pulso, medir a intensidade do sinal de calibração; e v) comparar a intensidade do sinal de detecção com a intensidade do sinal de calibração, em que a quantidade do norovírus dentro da amostra de teste é proporcional à intensidade do sinal de detecção conforme calibrado pelo sinal de calibração.
[007] O dispositivo de ensaio de fluxo contínuo da presente divulgação inclui uma membrana porosa em comunicação de fluidos com uma almofada conjugada. A almofada conjugada tem sondas conjugadas que incluem partículas modificadas com um elemento de ligação configurado para se ligar ao norovírus. As sondas conjugadas contêm ainda um marcador fluorescente tendo um tempo de vida de emissão de fluorescência maior que cerca de 1 microssegundo. A membrana porosa define uma zona de detecção tendo uma linha de teste dentro da qual é imobilizado um anticorpo de norovírus configurado para se ligar ao norovírus. A zona de detecção também tem uma linha de controle posicionada a jusante da linha de teste, em que a linha de controle inclui um anticorpo do norovírus G2 imobilizado configurado para se ligar às sondas conjugadas.
[008] Uma divulgação completa e esclarecedora da presente divulgação, incluindo o melhor modo, direcionada às pessoas versadas na técnica, é estabelecida mais particularmente no restante do relatório descritivo, que faz referência às figuras anexas, nas quais: A Figura 1A é uma vista plana de uma modalidade de um dispositivo de ensaio baseado em membrana da presente divulgação; e A Figura 1 B é uma vista lateral do dispositivo de ensaio baseado em membrana da Figura 1A.
[009] O uso repetido de caracteres de referência no presente relatório descritivo e nas figuras tem como objetivo representar características ou elementos iguais ou análogos da presente divulgação
[0010] A referência agora será feita em detalhe às várias formas de realização da publicação, um ou mais exemplos dos quais são apresentados a seguir. Cada exemplo é fornecido a título de explicação da divulgação, sem limitação da divulgação. De fato, será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas na presente divulgação, sem se afastar do escopo ou o espírito da divulgação. Por exemplo, características ilustradas ou descritas como parte de uma modalidade, podem ser usadas em outra modalidade para produzir ainda outra modalidade. Assim, pretende-se que a presente descrição abranja tais modificações e variações que estão dentro do escopo das reivindicações anexas e suas equivalentes.
[0011] Como usado aqui, o termo "analito" geralmente se refere a norovírus a ser detectado. O norovírus usado nos métodos da invenção pode ser qualquer tipo de norovírus, por exemplo, qualquer cepa, sorotipo ou isolado de norovírus que infecta animais, como seres humanos. O norovírus pode ser de um genótipo geralmente encontrado em hospedeiros humanos, tais como genótipos GI, GII e GIV, ou qualquer outro genótipo (por exemplo, GIII ou GV). Cepas específicas de norovírus que infectam hospedeiros humanos e hospedeiros mamíferos incluem, mas não estão limitadas a, vírus Desert Shield (Hu/NLV/DSV395/1990/SR) (número de Adesão GenBank U04469), vírus Lordsdale (Hu/NLV/LD/1993/UK) (número de Adesão GenBank X86557), vírus México (Hu/NLV/MX/1989/MX) (número de Adesão GenBank U22498), vírus Norwalk (Hu/NLV/NV/1968/US) (número de Adesão GenBank M87661), vírus Hawaii (Hu/NLV/HV/1 971 /US) (número de Adesão GenBank U07611), vírus Snow Mountain (Hu/NLV/SMV/1976/US) (número de Adesão GenBank L23831), vírus Southampton (Hu/NLV/SHV/1991/UK) (número de Adesão GenBank L07418), Alphatron (número de Adesão GenBank AF195847), murino NoV 1 (número de Adesão GenBank AY228235), porcino NoV SW918 (número de Adesão GenBank AB074893), bovino NoV Jena (número de Adesão GenBank AJ01109), bovino NoV Newbury Agent (número de Adesão GenBank AF097917), bovino Newbury Agente 1 cepa (DQ013304) e cepa bovina Nebraska (número de Adesão GenBank NC_004064).
[0012] Como usado aqui, a termo "amostra de teste" geralmente se refere a um material suspeito de conter o analito. A amostra de teste pode ser usada diretamente conforme obtida a partir da fonte, ou após um pré-tratamento para modificar o caráter da amostra. A amostra de teste pode ser pré-tratada antes da utilização. Métodos de tratamento podem envolver filtração, precipitação, diluição, destilação, concentração, inativação dos componentes interferentes e a adição de reagentes. A amostra pode ser obtida de superfícies duras. Além disso, um material sólido suspeito de conter o analito pode ser usado como a amostra de teste. No entanto, será necessário modificar uma amostra de teste sólida para formar um meio líquido, ou para liberar o analito.
[0013] Em geral, a presente divulgação é direcionada a um método de ensaio baseado em membrana e dispositivo para detectar a presença de um norovírus que reside em uma amostra de teste. O dispositivo utiliza fluorescência com resolução temporal para detectar os sinais gerados pelos marcadores fluorescentes excitados (fluoróforos). Em um aspecto possível da presente divulgação, o leitor fluorescente usado na presente divulgação utiliza um diodo emissor de luz pulsada (LED) e um fotodiodo de silício para excitar com precisão marcadores e detectar a fluorescência em um dispositivo de ensaio baseado em membrana sem exigir a utilização de componentes caros, tais como monocromadores ou filtros ópticos largura de banda de emissão estreita. Este tipo de leitor fluorescente é mostrado e descrito na Patente dos EUA 7.632.653, emitida para Song et al. e incorporada por referência aqui à extensão em que é consistente com a presente divulgação.
[0014] Uma variedade de dispositivos de ensaio de fluxo contínuo pode ser construída de acordo com a presente divulgação para uso em conjunto com um sistema de detecção de fluorescência com resolução temporal. Sobre este aspecto, diversas modalidades da presente divulgação agora serão descritas com mais detalhes. Deve ser compreendido, no entanto, que as modalidades discutidas abaixo só são exemplares e que outras modalidades também são contempladas pela presente divulgação. Por exemplo, referindo-se novamente à Figura 1A, um sistema para detectar a presença de um analito em uma amostra de teste é esquematicamente ilustrado. Inicialmente, uma amostra de teste que contém um analito é aplicada aa almofada de amostragem 14. Da almofada de amostragem 14, a amostra de teste pode então passar para a almofada conjugada 16, onde o analito se mistura com sondas (descritas abaixo) para formar complexos de analito. Em uma modalidade, por exemplo, as sondas são formadas a partir de micropartículas que são misturadas um composto de quelato de lantanídeos, como o descrito acima, e ligadas a um elemento de ligação específica para o analito de interesse. Além disso, como o conjugado 16 está em comunicação fluida com a membrana porosa 18, os complexos podem migrar do conjugado 16 para uma zona de detecção 23 presente na membrana porosa 18. A zona de detecção 23 contém um reagente de captura imobilizado que é geralmente capaz de formar uma ligação química e física com as sondas. Por exemplo, ligantes contêm um anticorpo capaz de ligar ao elemento de ligação específico presente nas micropartículas.
[0015] Mais especificamente, o dispositivo de imunoensaio de fluxo lateral 10 da presente divulgação é um dispositivo simples que pode detectar níveis relativamente baixos de partículas de norovírus. Referindo-se às Figuras 1A e 1B, em um aspecto da presente divulgação o dispositivo 10 pode ser configurado como segue. O dispositivo 10 tem uma extremidade inferior 30 e uma extremidade superior 32, separados por uma seção mestra
[0016] 34. Um apoio 12 na extremidade inferior pode ser um substrato de fibra de vidro. A seção mestra 34 de apoio 12 pode ser nitrocelulose. A extremidade superior de suporte 12 pode ser um material de filtro. Cada seção pode ser conectada à outra de modo que seja criada uma superfície substancialmente plena 36 seja criada.
[0017] A superfície 36 suporta vários componentes capilares: almofada de amostra 14, almofada conjugada 16, membrana 18 e almofada de absorção 24. Em um aspecto da presente divulgação, a almofada de amostra 14 não faz contato direto com a membrana 18. Em vez disso, a almofada conjugada faz uma ponte 16 no espaço entre elas. A almofada de amostra 14 fica em cima de uma porção da almofada conjugada 16, sobrepondo-se sobre uma área de 50 por cento da almofada conjugada 16. Uma área de cerca de 25% da almofada conjugada 16 é disposta em cima da membrana 18.
[0018] A membrana 18 se sobrepõe à seção mestra de nitrocelulose 34 de apoio 12 e estende-se por uma porção da extremidade superior 32 feita de um material de filtro. A almofada de absorção 24 cobre a extremidade superior 32 completamente, sobrepondo a membrana 18 com cerca de 60 por cento da área da almofada de absorção 24.
[0019] A membrana 18 tem duas listras laterais impressas nela, linha de teste 20 e linha de controle 22. A região da membrana 18 entre a almofada conjugada e a almofada de absorção define a zona de detecção 23. Uma terceira molécula foi imobilizada na linha de teste 20. Quando a mistura da amostra/conjugado atingiu a linha de teste 20, o analito foi ligado à partícula e a terceira molécula (molécula de captação) se liga ao complexo. Conforme mais e mais fluido passa a linha de teste 20 e 22 e a linha de controle, as partículas se acumulam e as linhas 20 e 22 mudam de cor. A linha de controle 22 captura qualquer partícula e demonstra que o teste funcionou. A linha de teste 20 que contém uma molécula específica de captura capta somente aquelas partículas para as quais a molécula de analito, que pode ser um norovírus, foi imobilizada. Após a mistura passar a linha de controle 22, ela atinge a almofada de absorção 24 como seu destino final. A almofada de absorção 24 atua meramente como um coletor de resíduos.
[0020] Em geral, uma variedade de dispositivos de ensaio de fluxo contínuo pode ser construída de acordo com a presente divulgação para uso em conjunto com um sistema de detecção de fluorescência com resolução temporal. Sobre este aspecto, diversas modalidades da presente divulgação agora serão descritas com mais detalhes. Deve ser compreendido, no entanto, que as modalidades discutidas abaixo só são exemplares e que outras modalidades também são contempladas pela presente divulgação. Segue a descrição dos vários componentes do dispositivo de ensaio 10.
[0021] Almofada de amostra: Para iniciar a detecção de um analito dentro da amostra de teste, o usuário pode aplicar diretamente a amostra de teste a uma parte da membrana porosa 18, através da qual ela pode então passar. Opcionalmente, a amostra de teste pode primeiro ser aplicada a uma almofada de amostragem 14 que está em comunicação de fluidos com a membrana porosa 18. Alguns materiais apropriados que podem ser utilizados para formar a almofada de amostragem incluem, mas não estão limitados a nitrocelulose, celulose, coxins de polietileno poroso, celulose e papel de filtro de fibra de vidro. Se desejado, a almofada de amostragem também pode conter um ou mais reagentes pré-tratamento de ensaio, fixado a ela, de forma difusa ou não.
[0022] Almofada conjugada: Conforme observado, a amostra de teste passa da almofada de amostragem 14 para a almofada conjugada 16, que é colocada em comunicação de fluidos com uma das extremidades da almofada de amostragem 14. A almofada conjugada 16 é formada a partir de um material através do qual a amostra de teste seja capaz de passar. Por exemplo, em uma modalidade, a almofada conjugada 16 é formada a partir de fibras de vidro. Embora apenas uma almofada conjugada 16 seja mostrada, deve-se entender que outras almofadas conjugadas também podem ser utilizadas na presente divulgação.
[0023] Membrana: A membrana porosa 18 pode ser feita a partir de uma variedade de materiais, através dos quais a amostra de teste é capaz de passar. Por exemplo, os materiais utilizados para formar a membrana porosa 18 podem incluir, mas não estão limitados a, materiais naturais, sintéticos, ou naturais que são modificados sinteticamente, tais como polissacarídeos (por exemplo, materiais celulósicos, como papel, e derivados de celulose, como acetato de celulose e nitrocelulose); sulfona de poliéter; membranas de nylon; sílica; materiais inorgânicos, tais como alumina desativada, terra diatomácea, MgSO4, ou outro material inorgânico finamente dividido uniformemente dispersado em uma matriz de polímero poroso, com polímeros tais como cloreto de vinil, copolímero de cloreto de vinil-propileno e copolímero de cloreto de vinil-vinil acetato; pano, ambos de ocorrência natural (por exemplo, algodão) e sintético (por exemplo, nylon ou rayon); géis porosos, tais como sílica gel, agarose, dextrano e gelatina; filmes poliméricos, como poliacrilamida; e similares. Em uma modalidade específica, a membrana porosa 18 é formada a partir de materiais de nitrocelulose e/ou sulfona de poliéster. Deve-se entender que o termo "nitrocelulose" refere-se aos ésteres de ácido nítrico da celulose, que podem ser somente nitrocelulose ou um misto de éster do ácido nítrico e outros ácidos, tais como ácidos carboxílicos alifáticos, tendo de 1 a 7 átomos de carbono.
[0024] Em uma modalidade, uma membrana de nitrocelulose adequada pode ter uma taxa de fluxo de cerca de 90 a cerca de 200 segundos/40 mm. Em alternativa, a taxa de fluxo pode ser de cerca de 110 a cerca de 165 segundos/40 mm, cerca de 140 a cerca de 200 segundos/40 mm, ou mais apropriadamente, de 90 a 150 segundos/40 mm. O tamanho do poro pode variar de cerca de 5 a cerca de 10 micrômetros, ou 7 a 9 micrômetros ou, mais apropriadamente, cerca de 8 micrômetros. A espessura pode variar de cerca de 125 a cerca de 200 micrômetros, cerca de 155 a 200 micrômetros, ou mais apropriadamente, cerca de 200 micrômetros. Por exemplo, uma membrana de nitrocelulose adequada pode ser obtida de Starious, Alemanha, vendida como UNISTART 95: tem uma taxa de fluxo de 135 segundos/40 mm, um tamanho de poro de 200 micrômetros e uma espessura de 150 micrômetros.
[0025] A almofada de absorção (transpirável): A almofada de absorção 24 geralmente recebe o fluido que migrou através da membrana porosa inteira 18. Como é bem conhecido na técnica, a almofada de absorção 24 pode ajudar na promoção da capilaridade e fluxo de fluido através da membrana 18.
[0026] Suporte: O apoio 12, descrito acima, é suficientemente rígido para evitar a flexão durante a utilização do dispositivo 10, conforme descrito aqui. Um apoio adequado 12 é MILLIPORE HF000MC100; Lote n° 065170-01, disponível a partir de EMD Millipore, Billerica, MA.
[0027] Amostra: Em um aspecto da divulgação, um tampão contínuo é feito pela seguinte fórmula: tampão 10 mM HEPES + 3% surfactante S9 + 1% albumina de soro bovino "BSA". O surfactante S9 é TRITON X 100, disponível por Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA. O tampão HEPES é ácido 2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil]etanossulfônico. Em um aspecto da divulgação, o norovírus na amostra está presente no tampão contínuo em cerca de 105 a 109partículas por amostra, ou pelo menos cerca de 2,5 x 105 de partículas de vírus por amostra. A amostra norovírus-positiva pode ser de qualquer volume adequado, por exemplo, 100 microlitros. Qualquer faixa de volume de amostra entre cerca de 90-110 microlitros pode ser usada.
[0028] Conjugado (marcadores): Para facilitar a detecção precisa da presença ou ausência de um analito dentro da amostra de teste, marcadores são aplicados em vários locais do dispositivo 20. Os marcadores podem ser usados para detecção do analito e calibração. Pelo menos uma parte dos marcadores usados no dispositivo 20 contém um composto fluorescente. Em geral, esses compostos fluorescentes podem ser moléculas fluorescentes, polímeros, dendrímeros, partículas e similares.
[0029] Em conformidade com a presente divulgação, os marcadores fluorescentes são configurados para permitir a "detecção de fluorescência com resolução temporal". Fluorescência com resolução temporal envolve excitar o marcador fluorescente com um curto pulso de luz, então normalmente esperar um certo tempo (por exemplo, entre cerca de 100 a 200 microssegundos) após a excitação, antes de medir o sinal fluorescente de longa duração restante. Desta forma, são eliminados quaisquer sinais de fundo de fluorescência de curta duração e radiação de excitação dispersa. A detecção da fluorescência com resolução temporal é projetada para reduzir os sinais de fundo da fonte de emissão ou de processos de dispersão (resultantes do espalhamento da radiação de excitação), aproveitando as características de fluorescência de determinados materiais fluorescentes.
[0030] Os critérios de seleção dos marcadores particularmente desejados para fluorescência com resolução temporal incluem um tempo de vida de emissões relativamente longo. Isto é desejado para que o marcador emita seu sinal bem depois de se dissiparem quaisquer sinais de fundo de curta duração. Além disso, um tempo de vida de fluorescência longo torna possível usar circuitos de baixo custo para medições de fluorescência tempo-dependentes. Por exemplo, marcadores fluorescentes utilizados na presente divulgação podem ter um tempo de vida de fluorescência maior que cerca de 1 microssegundo, em algumas modalidades, maior que cerca de 10 microssegundos, em algumas modalidades, maior que cerca de 50 microssegundos e, em algumas modalidades, de cerca de 100 microssegundos a cerca de 1000 microssegundos. Além disso, o marcador fluorescente também pode ter um "desvio de Stokes" relativamente grande. O termo "desvio de Stokes" é geralmente definido como o deslocamento das linhas espectrais ou bandas de radiação luminescente para um comprimento de onda de emissão maior do que as linhas de excitação ou bandas. Um desvio de Stokes relativamente grande permite que o comprimento de onda de excitação do marcador fluorescente permaneça longe de seus comprimentos de onda de emissão e é desejável, porque uma grande diferença entre excitação e emissão de comprimentos de onda torna mais fácil eliminar a radiação de excitação refletida do sinal emitido. Além disso, um grande desvio de Stokes também minimiza a interferência de moléculas fluorescentes na amostra e/ou espalhamento de luz devido a proteínas ou coloides, que estão presentes com alguns fluidos corporais (por exemplo, sangue). Além disso, um grande desvio de Stokes também minimiza a necessidade de filtros caros e de alta precisão para eliminar a interferência de fundo. Por exemplo, em algumas modalidades, os marcadores fluorescentes têm um desvio de Stokes maior que cerca de 50 nanômetros, em algumas modalidades, maior que cerca de 100 nanômetros e, em algumas modalidades, de cerca de 250 a cerca de 350 nanômetros.
[0031] [32] Os marcadores fluorescentes podem ser usados em uma variedade de maneiras para formar uma sonda. Por exemplo, os marcadores fluorescentes podem ser usados sozinhos para formar sondas. Alternativamente, os marcadores fluorescentes podem ser usados em conjunto com polímeros, lipossomas, dendrímeros e outras estruturas em micro ou nanoescala para formar sondas. Além disso, os marcadores podem ser usados em conjunto com micropartículas (por vezes referidas como "grânulos" ou "micro-grânulos") para formar sondas. Por exemplo, micropartículas naturais, como núcleos, microplasma, plasmídeos, plastídeos, células de mamíferos (por exemplo, fantasmas de eritrócitos), microrganismos unicelulares (por exemplo, bactérias), polissacarídeos (por exemplo, agarose), etc. podem ser utilizadas. Além disso, micropartículas sintéticas também podem ser utilizadas. Por exemplo, em uma modalidade, micropartículas de látex que são marcadas com um corante fluorescente ou colorido são utilizadas. Embora qualquer micropartícula de látex possa ser utilizada na presente divulgação, as micropartículas de látex normalmente são formadas de poliestireno, estirenos de butadieno, terpolímero estireneacrílico-vinil, poli meti lmetacrilato, polietilmetacrilato, copolímero de estireno-maleico anidrido, acetato de polivinil, polivinilpiridina, polidivinilbenzeno, polibutilenetereftalato, acrilonitrila, acrilatos de vinil e similares, ou um aldeído, carboxil, amino, hidroxil ou derivados de hidrazida dos mesmos. Outras micropartículas apropriadas podem ser descritas na Pat. dos EUA Nos. 5.670.381 para Jou, et al. e Pat. dos EUA N° 5.252.459 para Tarcha, et al, que são incorporadas aqui em sua totalidade por referência aos mesmos, na medida em que sejam consistentes com isto.
[0032] [33] As sondas são modificadas para que sejam mais facilmente capazes de se ligar ao analito. Em tais casos, as sondas são modificadas com certos elementos de ligação específica que são aderidos aos mesmos para formar sondas conjugadas. Elementos de ligação específica geralmente se referem a um elemento de um par de ligação específica, ou seja, duas moléculas diferentes, em que uma das moléculas se liga quimicamente e/ou fisicamente à segunda molécula. Por exemplo, elementos imunorreativos de ligação específica podem incluir um anticorpo monoclonal ou policlonal, uma proteína recombinante, ou mistura(s) ou fragmento(s) dos mesmos, bem como uma mistura de um anticorpo e outros elementos de ligação específica. Em um aspecto da divulgação, o elemento de ligação é anticorpo 1513F. Outros pares de ligação específica comuns incluem, mas não estão limitados a, biotina e avidina, biotina e estreptavidina, proteínas de ligação a anticorpos (como proteína A ou G) e anticorpos, carboidratos e lectinas, sequências de nucleotídeos complementares (incluindo sequências de ácidos nucleicos de marcação e captura utilizadas em ensaios de hibridização de DNA para detectar uma sequência do ácido nucleico alvo), sequências peptídicas complementares, incluindo aquelas formadas por métodos recombinantes, moléculas efetoras e receptoras, hormônio e proteína de ligação do hormônio, cofatores da enzima e enzimas, inibidores de enzima e enzimas e similares. Além disso, pares de ligação específica podem incluir elementos que são análogos do elemento original de ligação específica. Por exemplo, um derivado ou fragmento do analito, ou seja, um analito-análogo, pode ser usado, desde que tenha pelo menos um epítopo em comum com o analito.
[0033] O acoplamento do anticorpo com microesferas fluorescentes pode ser realizado da seguinte forma. É usado um método de imunofluorescência indireta. Imunofluorescência (IF) ou (IFA) é uma técnica comum de laboratório. É uma forma de microscopia de luz usada principalmente em amostras microbiológicas utilizando a especificidade de um anticorpo para sua proteína-alvo ou epítopo para ligar uma molécula do corante fluorescente a um alvo específico dentro de uma solução. Após a bem-sucedida imunofluorescência de uma amostra, torna-se possível visualizar a molécula-alvo usando um microscópio de fluorescência ou leitor automatizado. O anticorpo primário específico para a molécula de norovírus não é marcado, e um segundo anticorpo anti-imunoglobulina direcionado ao anticorpo secundário é marcado com o corante fluorescente.
[0034] Em um aspecto da divulgação, anticorpos do norovírus foram acoplados às microesferas fluorescentes (d=110 nm, Lumigenex, Suzhou, China). Microesferas fluorescentes foram lavadas com etanol 80% uma vez, e tampão de lavagem MES 20 mM (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico) três vezes. Microesferas lavadas foram ativadas por 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida ("EDC") à temperatura ambiente por 15 min. e lavadas novamente três vezes com o mesmo tampão de lavagem. (EDC é um reticulador de carbodiimida heterobifuncional, solúvel em água, de comprimento zero que é usado para acoplar grupos carboxil a aminas primárias). As microesferas fluorescentes foram acopladas ao anticorpo do norovírus de Fitzgerald Industry International, MA, EUA, 10-1513 e deixadas para incubar à temperatura de 4°C, durante a noite. Os sítios desacoplados são bloqueados com um tampão de bloqueio (10mm PBS com 5% BSA). Depois de lavar três vezes com o tampão de lavagem, as microesferas conjugadas foram ressuspensas em um tampão de armazenamento (10mm PBS, pH 7,4) a uma concentração final de 1% de sólidos e armazenadas a 4°C.
[0035] Linhas de Teste e Controle: Para a detecção de um vírus como o norovírus, o anticorpo da linha de teste pode ser um anticorpo do norovírus, como anticorpo monoclonal 4901-RAb2, disponível por Virostat, Inc., Portland, ME ("VIROSTAT"). Outros anticorpos adequados podem ser obtidos por outros vírus, como desejado.
[0036] Para a detecção de um vírus como o norovírus, o anticorpo da linha de controle pode ser um anticorpo de norovírus G2, como anticorpo monoclonal 10-1513, disponível por Fitzgerald Industries International, Acton, MA ("Fitzgerald"). Outros anticorpos adequados podem ser obtidos por outros vírus, como desejado.
[0037] A linha de teste 20 e a linha de controle 22 são espaçadas a uma distância de cerca de 4 a cerca de 15 mm, ou em alternativa, cerca de 5 a cerca de 10 mm, ou em alternativa, cerca de 6mm.
[0038] Embora várias modalidades de configurações do dispositivo tenham sido descritas acima, deve ser entendido que um dispositivo da presente divulgação geralmente pode ter qualquer configuração desejada e não precisa conter todos os componentes descritos acima.
[0039] Geralmente, o método da presente divulgação usa ensaio de fluxo lateral e tecnologias de fluorescência com resolução temporal para fornecer uma ferramenta sensível para detecção de partículas de norovírus em uma amostra. O método de uso combina (i) preparar uma amostra com contaminantes, (ii) processar a amostra e depositá-la na faixa de ensaio, como descrito acima e (iii) medir o sinal de fluorescência.
[0040] Em um aspecto, a amostragem é feita limpando-se uma superfície suspeita de abrigar um contaminante viral (analito) com um swab (não mostrado). A área de superfície amostrada pode ser de cerca de 25cm2. O material do swab é tal que pode levantar uma quantidade adequada de amostras virais da superfície e posteriormente liberar a amostra viral sobre a placa de amostragem 14. Qualquer tipo de amostra pode ser usado enquanto o material do swab não reage de forma cruzada com o analito. Um exemplo de um swab pode ser uma vareta de plástico com ponta de algodão. O swab é inserido em um tubo de coleta de amostra e rodado no diluente de ensaio pelo menos 10 vezes. O swab pode ser processado por vórtice em um tampão PBS pH 7,4 para liberar o analito.
[0041] A amostra contendo teanalito é aplicada à almofada de amostragem 14. Da almofada de amostragem 14, a amostra de teste passa para a almofada conjugada 16, onde o analito se mistura com sondas (descritas acima) para formar complexos de analito. Como a almofada conjugada 16 está em comunicação de fluidos com a membrana porosa 18, então os complexos de analito migram da almofada conjugada 16 para uma zona de detecção 23 presente na membrana porosa 18. A zona de detecção 23 contém um reagente de captura imobilizado / anticorpo na linha de teste 20, que é geralmente capaz de formar uma ligação química ou física com as sondas. Os reagentes de captura/anticorpo são capazes de ligar o presente anticorpo de escolha às micropartículas, que é em uma modalidade, um anticorpo de norovírus. O anticorpo secundário se liga ao anticorpo primário que é conjugado na superfície das micropartículas através de uma ligação covalente.
[0042] [43] Em uma modalidade, um método de ensaio de imunofluorescência com resolução temporal para detectar a presença ou quantidade de um analito em uma amostra inclui as seguintes etapas: colocar um leitor de fluorescência com resolução temporal (não mostrado) próximo à zona de detecção 23, o leitor de fluorescência compreendendo uma fonte de excitação pulsada e um detector tempo-dependente; excitar o marcador fluorescente na zona de detecção 23 com a fonte de excitação pulsante, em que a excitação faz com que o marcador fluorescente emita um sinal de detecção; e medir a intensidade do sinal de detecção com o detector tempo-dependente.
[0043] [44] Uma vez capturado, o sinal de fluorescência das sondas nas zonas de detecção pode ser medido usando um leitor de fluorescência com resolução temporal. O leitor de fluorescência pode ser construído para emitir sucessivamente luz pulsada para a zona de detecção, conforme divulgado na Patente dos EUA número 7.632.653, incorporada aqui por referência, na medida em que é consistente com isto.
[0044] [45] Ao introduzir os elementos da presente divulgação ou suas aplicações preferíveis, os artigos “um/uma”, “a/o” e “referido(a)” têm a intenção de indicar que há um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" estão destinados a serem inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais que não sejam os elementos listados. Muitas modificações e variações da presente divulgação podem ser feitas sem abandonar o espírito e o escopo dos mesmos. Portanto, as modalidades exemplares descritas acima não devem ser usadas para limitar o escopo da divulgação.
Claims (15)
1. Método para detectar a presença de norovírus residindo em uma amostra de teste, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: i) fornecer um dispositivo de ensaio de fluxo contínuo que compreende uma membrana porosa em comunicação fluida com uma almofada conjugada, a almofada conjugada compreendendo sondas conjugadas tendo partículas modificadas com um elemento de ligação configurado para se ligar ao norovírus e contendo um marcador fluorescente, em que o marcador fluorescente tem um tempo de vida de emissão de fluorescência superior a 1 microssegundo; e em que a membrana porosa define uma zona de detecção compreendendo uma linha de teste dentro da qual é imobilizado um anticorpo de norovírus configurado para se ligar ao norovírus, e uma linha de controle posicionada a jusante da linha de teste, em que a linha de controle imobilizou dentro de um anticorpo norovírus G2 configurado para se ligar às sondas conjugadas; ii) contatar a almofada conjugada com a amostra de teste e permitir que as partículas fluam para a zona de detecção; iii) sujeitar a linha de teste a pulsos de iluminação para gerar um sinal de detecção e, após um determinado período de tempo decorrido depois do pulso, medir a intensidade do sinal de detecção, em que um leitor de fluorescência é empregado para fornecer a iluminação e medir a intensidade do sinal de detecção, iv) submeter a linha de controle a pulsos de iluminação para gerar um sinal de calibração e após um determinado período de tempo decorrido depois do pulso, medir a intensidade do sinal de calibração; e v) comparar a intensidade do sinal de detecção com a intensidade do sinal de calibração, em que a quantidade do norovírus dentro da amostra de teste é proporcional à intensidade do sinal de detecção conforme calibrado pelo sinal de calibração.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende pelo menos 105 a 109 partículas de norovírus em um tampão de execução.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende pelo menos 2,5 x 105 partículas de norovírus em um tampão de execução.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tampão de execução compreende: 10mM de ácido 2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinil] etanossulfônico; 5. em peso de surfactante S9; e 1 % em peso de albumina de soro bovino.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação é selecionado do grupo consistindo de biotina e avidina; biotina e estreptavidina; proteína A de ligação a anticorpo e anticorpos, carboidratos e lectinas; proteína G de ligação a anticorpo e anticorpos, carboidratos e lectinas; sequências de nucleotídeos complementares; e sequências peptídicas complementares.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação compreende um anticorpo monoclonal.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação é um análogo tendo pelo menos um epítopo em comum com o norovírus.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador fluorescente compreende um quelato de lantanídeo de samário, disprósio, európio, térbio, ou suas combinações.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador fluorescente é quelato de európio.
10. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo para detecção de norovírus em uma amostra, o dispositivo caracterizado pelo fato de que compreende: uma membrana porosa em comunicação fluida com uma almofada conjugada, a almofada conjugada compreendendo sondas conjugadas tendo partículas modificadas com um elemento de ligação configurado para se ligar ao norovírus e contendo um marcador fluorescente, em que o marcador fluorescente tem um tempo de vida de emissão de fluorescência maior que 1 microssegundo; e em que a membrana porosa define uma zona de detecção tendo uma linha de teste dentro do qual é imobilizado um anticorpo de norovírus configurado para se ligar ao norovírus e uma linha de controle posicionada a jusante da linha de teste, em que a linha de controle imobilizou dentro de um anticorpo de norovírus G2 configurado para se ligar às sondas conjugadas.
11. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação compreende um anticorpo monoclonal.
12. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as partículas são misturadas com um composto de quelato de lantanídeo.
13. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a membrana porosa é uma membrana de nitrocelulose tendo uma taxa de fluxo de 90 a 200 segundos por 40 mm de amostra de teste.
14. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a membrana porosa é uma membrana de nitrocelulose tendo um tamanho de poro variando de 5 a 10 micrômetros.
15. Dispositivo de ensaio de fluxo contínuo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a membrana porosa é uma membrana de nitrocelulose tendo uma espessura de 125 a 200 micrômetros.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 27/11/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |