ES2402916T3

ES2402916T3 - Método de ensayo con membrana y kit

Info

Publication number: ES2402916T3
Application number: ES10011767T
Authority: ES
Inventors: Hideharu Shimizu; Takeshi Watanabe; Kazuyuki Takizawa; Junji Matsuda; Toshinori Sato
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2013-05-10
Anticipated expiration: 2023-12-24
Also published as: EP1712917A1; EP1712917A4; US20090286226A1; EP2270508A1; AU2003296090A1; PT2270508E; US20070202611A1; WO2005062052A1; US7579195B2; US8404479B2; EP2270508B1

Abstract

Un método de ensayo con membrana para detectar o cuantificar un analito en una muestra de espécimenutilizando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana a la cual está fijada una sustancia de captura paracapturar el analito, que comprende las etapas de: filtrar la muestra de espécimen utilizando un filtro que está unido a la punta de un tubo de filtración,depositar el filtrado sobre la membrana, y detectar o cuantificar la presencia del analito en la muestra de espécimen, en donde la muestra de espécimen se ha recogido de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspiradode cavidad nasal, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro es de 0,2 a 8,0 μm.

Description

Método de ensayo con membrana y kit.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un método de ensayo para la detección o cuantificación de una sustancia determinada en una muestra de espécimen usando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana, específicamente a un método de ensayo de membrana simple que puede ser utilizado clínicamente y a un kit utilizado para este método.

Antecedentes de la técnica

Recientemente se han desarrollado reactivos o kits de ensayo simples en los que se pueden detectar o cuantificar en poco tiempo, de unos pocos minutos a varias decenas de minutos, distintos elementos de medición, que incluyen la infección con patógenos tales como virus y bacterias, la presencia de embarazo y la glucemia, con el uso de reacciones entre anticuerpo y antígeno, reacciones enzimáticas, y similares. Son objeto de detección o cuantificación las proteínas que forman parte de patógenos, la gonadotropina coriónica humana (GCh), la glucemia y similares. La mayoría de los reactivos de ensayo simples se caracterizan por no requerir ningún equipamiento especial, por ser fáciles de operar y por tener un precio económico. Por ejemplo, un reactivo de ensayo simple para el diagnóstico de embarazo se vende en las parafarmacias y en las farmacias sin estar sujeto a prescripción (OTC, por sus siglas en inglés). A diferencia de otros reactivos de ensayo, los reactivos de ensayo simples que miden la infección por patógenos se utilizan ampliamente también en los hospitales generales y en las consultas, además de en los hospitales grandes y en los centros de ensayos médicos. Estos lugares son a menudo las instituciones médicas a las que los pacientes acuden en primera instancia. Si la presencia de infección en los especímenes recogidos de los pacientes se pudiese dilucidar allí mismo y en ese momento, el tratamiento terapéutico se podría aplicar en las primeras etapas de los síntomas. Por consiguiente, la importancia de tales reactivos o kits de ensayo simples en el ámbito médico está creciendo cada día más.

En la actualidad, pertenecen al conocimiento general los métodos de ensayo con membrana, específicamente los métodos de ensayo que utilizan una membrana tal como una película o un filtro de nitrocelulosa y similares como métodos de ensayo simples, y se han clasificado a grandes rasgos en métodos de ensayo con membrana de tipo flujo continuo o de tipo flujo lateral. El primero es un método en donde una solución que contiene una sustancia o un analito a examinar se pasa verticalmente a través de una membrana revestida con una sustancia que detecta dicho analito, y el último es un método desarrollado en la dirección lateral. En ambos métodos existe un punto en común, que es que la detección o la cuantificación de un analito en una muestra se realiza mediante la formación de un complejo entre una sustancia inmovilizada en la membrana a la que se fija específicamente el analito, el analito y la sustancia marcada que se une específicamente al analito en una película, y luego con la detección o cuantificación de dicha sustancia marcada.

Sin embargo, cuando una muestra de espécimen recogida de un paciente en la práctica médica se analiza mediante tal método de ensayo con membrana simple utilizando membranas o filtros, se pueden producir lo que se denomina "positivos falsos" o "positividad falsa", que es una valoración positiva que se hace a pesar de que no existan analitos en la muestra de espécimen. La aparición de una reacción positiva falsa durante la medición de la infección con patógenos conduce a una información errónea sobre el paciente. Por consiguiente, no sólo se retrasaría la especificación de la causa, sino que también se puede llevar a cabo un tratamiento inapropiado que conduzca a una consecuencia grave que haga que el estado de una enfermedad empeore a más intensa. En consecuencia, la supresión de la reacción positiva falsa es un tema muy importante a tenor del propósito principal del uso de un método de ensayo simple.

Hasta ahora, para el denominado inmunoensayo se han descrito un método en donde se diluye la muestra con un tampón que contiene un tensioactivo (por ejemplo, la patente japonesa JP-A-9-501494), un método para absorber mediante un filtro absorbente que contiene un tensioactivo (por ejemplo, patente japonesa JP-A-2000-502452) y similares, pero no han sido suficientes (la terminología "JP-A" tal como se utiliza en la presente memoria significa una "solicitud de patente japonesa publicada sin examinar").

S.P. Tucker et al. describen un inmunoensayo óptico para la gripe (ThermoBioStar's FLU OIA) como herramienta de diagnóstico para un tratamiento mejorado de la gripe en Phil. Trans. R. Soc. Lond. B, vol. 356, 2001, páginas 19151924.

El documento US 5,202,267 describe un procedimiento de inmunoensayo para la detección de analitos en orina, en donde se lleva a cabo una reacción inmunológica en una fase acuosa que contiene la orina y, si el ensayo es positivo, se forma un material compuesto inmunológico filtrable que contiene una partícula sol de oro inherentemente coloreada. La partícula sol de oro coloreada que contiene el material compuesto inmunológico se recoge para observación visual directa en un elemento filtrante. Las lecturas falsamente positivas se reducen al mínimo por (1) eliminación de contaminantes de la orina para evitar la coagulación del elemento filtrante y la unión no específica de los reactivos que no han reaccionado al mismo poniendo en contacto la orina con un elemento de contacto poroso que tiene un material detergente dispersado sobre sus superficies externas e intersticiales; (2) evitar la unión no

específica de sustancias inmunorreactivas que no han reaccionado al elemento filtrante bloqueando este último con polivinil pirrolidona; y/o (3) incluir un material colorante verde en la fase de reacción acuosa para mejorar la discriminación óptica después del lavado del filtro de colección entre resultados positivos y negativos en el filtro.

En JP2000088851 se describe un método de medición específico. En este método, se acopla un miembro de retención de un filtro de pre-tratamiento a un contenedor y en dicho filtro se alimenta una solución de muestra que contiene un antígeno, es decir, una sustancia que se ha de medir. La solución de muestra filtrada a través del filtro de pretratamiento se hace pasar a través de una matriz de reacción que retiene un anticuerpo. El antígeno es capturado por la matriz de reacción y la solución de muestra que ha pasado a través de la matriz es absorbida por un material absorbente. El anticuerpo marcado se suministra a través del filtro de pretratamiento y se une al antígeno capturado por la matriz de reacción. Después de esto, se retira el miembro que retiene el filtro de pretratamiento y se suministra un líquido de lavado apropiado desde una abertura para lavar la matriz de reacción.

El documento WO 87/01393 se refiere a un ensayo específico de aglutinación-extracción de estreptococos con ácido nitroso en microtubos en forma seca.

En US 4,270,923, se describe un agente de pretratamiento específico para fluidos de un sujeto en un ensayo inmunológico de embarazo. El agente de pretratamiento consiste esencialmente en una fibra de resina de intercambio catiónico de tipo ácido carboxílico o una fibra de vidrio siliconizada, que sirve para eliminar los componentes que interfieren y los elementos de turbidez presentes en el fluido del sujeto.

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de ensayo simple para analizar una muestra de espécimen mediante un método de ensayo con membrana, en donde el método es capaz de inhibir la aparición de la positividad falsa y es capaz de detectar o cuantificar un analito con gran precisión, y un kit que utiliza tal método.

Al detectar y cuantificar un analito mediante un método de ensayo con membrana se ha encontrado que la aparición de la positividad falsa se puede inhibir enormemente filtrando a través de un filtro una posible muestra de espécimen que contiene el analito.

En otras palabras, un objeto de la presente invención se puede conseguir mediante un método de ensayo con membrana para detectar o cuantificar un analito en una muestra de espécimen usando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana a la que está fijada una sustancia de captura para capturar el analito, que comprende las etapas de:

filtrar la muestra de espécimen usando un filtro que está unido a la punta de un tubo de filtración;

depositar el filtrado sobre la membrana; y

detectar o cuantificar la presencia del analito en la muestra de espécimen,

en donde la muestra de espécimen se ha recogido de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspirado de la cavidad nasal, y

en donde el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas de dicho filtro es de 0,2 a 8,0 μm.

Además, un objeto de la presente invención se puede conseguir mediante un kit de ensayo con membrana para detectar o cuantificar la presencia de un analito en una muestra de espécimen, en donde la muestra de espécimen se va a recoger de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspirado de cavidad nasal, en donde el kit comprende:

(1): un filtro para filtrar al muestra de espécimen, en donde el filtro está unido a la punta de un tubo de filtración; y

(2): un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva unida una sustancia de captura para capturar el analito;

Otra realización se refiere al método o kit antes mencionado, caracterizado por que el material del filtro se selecciona entre el grupo que consiste en tela no tejida, papel, fibra de vidrio, fibra de sílice, nitrocelulosa, éster de celulosa, una mezcla de nitrocelulosa y de éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón, poliéster, algodón, fibra de acero inoxidable y una combinación de los mismos.

Una realización preferida es el método o kit antes mencionado, donde el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas de dicho filtro es de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm a tenor del efecto de la presente invención.

Además, otra realización preferente de acuerdo con la presente invención es el método o kit antes mencionado, en donde dicho filtro es un filtro de fibra de vidrio, un filtro de nitrocelulosa o una combinación de filtro de fibra de vidrio y de filtro de nitrocelulosa.

Es más, otra realización preferente de acuerdo con la presente invención es el método o kit antes mencionado en donde el material de dicha membrana se selecciona entre el grupo que consiste en tela no tejida, papel, nitrocelulosa, fibra de vidrio, fibra de sílice, éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón y una mezcla de éster de celulosa y de nitrocelulosa, y el tamaño de poro de la membrana o el tamaño de retención de partículas en dicha membrana no es menor que el tamaño del poro o el tamaño de retención de partículas de dicho filtro, y es de 0,3 a 15 μm.

Otra realización más preferente de acuerdo con la presente invención es el método o kit antes mencionado, en donde el material antes mencionado de la membrana es nitrocelulosa y su tamaño de poro es de 0,4 a 12 μm.

Además, otra realización preferente de acuerdo con la presente invención es el método o kit antes mencionado, en donde dicho analito en la muestra de espécimen es un virus de la gripe.

Además, una realización particularmente preferente de acuerdo con la presente invención es el método o kit antes mencionado concerniente a un método o kit de ensayo con membrana simple de tipo flujo continuo o de tipo flujo lateral.

En el caso de un método o kit de ensayo con membrana de tipo flujo continuo, el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm. En el caso de un método o kit de ensayo con membrana de tipo flujo lateral, el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm.

De acuerdo con el método de la presente invención, en un método de ensayo con membrana simple utilizando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva fijada una sustancia de captura para capturar un analito, podría disminuir enormemente la aparición de positividad falsa. Los fundamentos para el efecto se considerarían como viene a continuación, pero sin limitarse a ellos. En un método de ensayo con membrana simple utilizando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva fijada una sustancia de captura para capturar un analito, el espécimen se recoge mediante frotis del sitio donde se espera que esté el analito, es decir, cavidad faríngea o nasal de un paciente y el espécimen se suspende en un tampón, o una porción de secreción o de excreción que contiene el analito tal como una descarga nasal, se recoge y se diluye con un tampón para preparar una muestra para el ensayo con membrana. En este caso, además de los materiales a medir, las células despegadas del sitio de muestreo, o los componentes de la secreción o de la excreción pueden ser contaminantes de dicha muestra. Dado que diversos componentes biológicos, que incluyen sustancias viscosas tales como proteoglucano y glucolípido, están contenidos en tal contaminante, si dicha muestra se añade directamente sobre una membrana, algunos componentes se pueden adherir a la membrana. Cuando se añade un componente con un tamaño equivalente a tal tamaño de poro o al tamaño de retención de partículas, se considera que el componente puede bloquear los poros de la membrana y luego puede inhibir el movimiento de los ingredientes de la solución. Se considera que las reacciones inespecíficas se pueden producir debido a tal fenómeno y, por lo tanto, se puede producir la denominada positividad falsa, en donde se valora como positivo a pesar de la ausencia del analito en la muestra. Tal positividad falsa se podría inhibir con eficacia de acuerdo con el método de la presente invención y se podría establecer entonces un método de ensayo simple y muy fiable.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en planta de un dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo que es una realización de acuerdo con la presente invención.

La figura 2 es una vista posterior a través de un plano de corte por la línea I-I' de la figura 1.

La figura 3 muestra una realización de un tubo de filtración para muestra de espécimen utilizada en la presente invención.

La figura 4 muestra una perspectiva de la parte de punta del tubo de filtración para muestra de espécimen de la figura 3.

La figura 5 es una vista en planta de un dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo lateral que es una realización de acuerdo con la presente invención.

La figura 6 es una vista posterior a través de un plano de corte por la línea II-II' de la figura 5.

En cada figura, cada signo significa lo siguiente:

A: orificio; B: orificio, a: adaptador, b: membrana, c: guata absorbente de líquido, d: parte de punta del tubo de filtración, e: parte de cuerpo del tubo de filtración, f: filtro, g; guata que recibe la muestra, h: guata que recibe el

sustrato, i: guata de absorción, j: membrana de nitrocelulosa, k: línea recubierta con el anticuerpo monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo B, l: línea recubierta con el anticuerpo monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo A, m: hoja de apoyo.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se describe detalladamente a continuación.

Método de ensayo con membrana simple.

El método de acuerdo con la presente invención es un método de ensayo con membrana simple para detectar o cuantificar un analito en una muestra de espécimen usando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva fijada una sustancia de captura para capturar el analito, caracterizado porque la muestra de espécimen se filtra usando un filtro que está unido a la punta de un tubo de filtración sobre dicha membrana y después se detecta

: o cuantifica la presencia del analito en dicha muestra de espécimen. En este método la muestra de espécimen ha sido recogida de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspirado de cavidad nasal, y el tamaño de poro

: o tamaño de retención de partículas del filtro es de 0,2 a 8,0 μm.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un "método de ensayo con membrana simple" se refiere a un método en donde la presencia de un analito en una muestra de espécimen se ensaya simplemente en un breve espacio de tiempo mediante un dispositivo de ensayo que comprende una membrana en la que en la fase sólida está fijada una sustancia de captura que se une específicamente al analito. Típicamente, se trata de un método en donde un analito se hace reaccionar con dicha sustancia de captura y un reactivo de detección marcado para formar un complejo en sándwich sobre la membrana y entonces la presencia de este complejo se detecta mediante la detección de dicha marcación. Los ejemplos de reacción del analito con dicha sustancia de captura o reactivo de detección marcado incluyen reacción de anticuerpo con antígeno, otra reacción entre el aceptor y el receptor, reacción de unión específica entre la biotina y la avidina, reacción entre los ADN que tienen secuencias complementarias entre sí y similares. Además, el método de ensayo simple de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para cualquier clase del analito o puede utilizar cualquier clase de membrana o de sustancia marcada sin limitación conforme a lo que se utiliza en tal método.

El método de ensayo con membrana de acuerdo con la presente invención se selecciona preferentemente entre dos clases de métodos de ensayo con membrana, uno de los cuales es un método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo y el otro es un método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral, porque estos métodos son simples y rápidos. El método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo es un método en donde una solución que contiene un analito se pasa verticalmente a través de una membrana que tiene una sustancia de captura inmovilizada en ella, que se une específicamente al analito o a una sustancia con la que detectar el analito. En este método, la detección o cuantificación del analito se lleva a cabo formando un complejo entre la sustancia de captura que se une específicamente al analito, el analito y la sustancia marcada que se une específicamente al analito sobre la membrana, seguido de la detección o cuantificación de la marcación. El método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral se diferencia del método del ensayo con membrana de tipo flujo continuo en que utiliza una membrana similar para revelar la solución que contiene el analito en dirección lateral contra la membrana, pero su principio de detección es similar al del método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo.

Un ejemplo de procedimientos concretos para el método de acuerdo con la presente invención se muestra a continuación para ilustrar la presente invención.

(1): Una muestra de espécimen recogida de cavidad faríngea o nasal de un paciente infectado por virus, bacterias o similar se suspende en una suspensión de espécimen como está descrito más abajo.

(2): La suspensión se coloca en un tubo de filtración para una muestra de espécimen equipado con un filtro en la punta del tubo de filtración y se filtra a través del filtro.

(3): El filtrado se deposita sobre la membrana que lleva fijada una sustancia de captura que se une específicamente al analito en un dispositivo de ensayo equipado con la membrana para capturar el analito, y entonces se permite la captura del analito sobre la membrana.

(4): Un reactivo de detección marcado que se une específicamente al analito se deposita sobre dicha membrana para formar sobre ella un complejo de sustancia de captura/analito/reactivo de detección marcado.

(5): La presencia del analito en la muestra de espécimen se determina mediante la detección de la presencia del complejo a través del reactivo de detección marcado en dicho complejo.

Filtro.

En el método de acuerdo con la presente invención, una muestra de espécimen recogida de un paciente se disuelve o se suspende en una solución para disolver o suspender un espécimen seguido por filtración de la suspensión o solución con un filtro. El tamaño de poro (diámetro) del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es

de 0,2 a 8,0 μm, preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm. Además, en el método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo y en el kit de ensayo con membrana de tipo flujo continuo, el tamaño de poro (diámetro) del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es particularmente preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm. Aún más, en el método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral y en el kit de ensayo con membrana de tipo flujo lateral, el tamaño de poro (diámetro) del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es de 0,2 a 8,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, incluso más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm.

El tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es importante para el efecto de la presente invención. Si el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es demasiado grande, en algunos casos se puede producir una unión inespecífica sobre la membrana que da lugar a una positividad falsa. Y al contrario, si es demasiado pequeño, el propio filtro se puede taponar debido a alguna sustancia viscosa o aglomerados presentes en la muestra, lo que impedirá realizar la filtración, o el área del filtro se deberá ampliar relativamente. Esto no es adecuado a tenor del propósito del filtro a utilizar en un método de ensayo simple.

Se puede utilizar no sólo una clase del filtro, sino también una combinación de filtros cuyos materiales y/o tamaño de poro o tamaño de retención de partículas son diferentes unos de los otros. En el caso de que se use un filtro combinado (es decir, varios filtros en una forma combinada), el tamaño de poro más pequeño o el tamaño más pequeño de las partículas retenidas entre los de los distintos filtros se considera que es el tamaño de poro del filtro combinado o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro. A continuación, si al menos un filtro de un filtro combinado tiene el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas dentro de 0,2 a 8,0 μm, preferentemente de 0,2 a 4,0 μm, más preferentemente de 0,2 a 2,0 μm, y lo más preferentemente de 0,2 a 0,6 μm, no hay problema incluso si el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en los otros filtros del filtro combinado están fuera de dicho intervalo.

Además, una combinación de dos o más filtros iguales proporciona cierta ventaja al ser capaz de obtener un cierto efecto incluso si se utilizan filtros cuyo tamaño de poro o tamaño de retención de partículas varía ampliamente. Además, cuando se utiliza algún filtro de solidez inadecuada, se pueden acumular dos o más filtros para incrementar la solidez del filtro resultante. No obstante, acumular varios filtros tiene también una desventaja en el hecho de que el filtro resultante es fácil de taponar, con el consiguiente incremento de la presión sobre el filtro, y se pierde entonces la simplicidad, según la clase de filtro.

El material del filtro incluye, pero sin limitarse a ellos, tela no tejida, papel, fibra de vidrio, fibra de sílice, nitrocelulosa, éster de celulosa, una mezcla de nitrocelulosa y de éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón, poliéster, algodón, fibra de acero inoxidable y similares. Son preferentes la fibra de vidrio y la nitrocelulosa.

Los filtros generalmente se dividen en filtro de profundidad y filtro de cribado según el mecanismo de recogida. El filtro de profundidad es el que recoge la materia sólida dentro de él, mientras que el filtro de cribado es el que recoge materia sólida sobre la superficie del filtro. Los filtros con ambos mecanismos serían de uso preferente.

Tubo de filtración.

El filtro anterior se acopla a la punta de un tubo de filtración para la muestra de espécimen a utilizar en el método o kit de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención. En otras palabras, es simple y preferente un método en donde una muestra de espécimen suspendida en una suspensión se coloca en el tubo de filtración, se filtra a través del filtro acoplado a la punta del tubo de filtración, y el filtrado se deposita entonces sobre la membrana en el dispositivo del ensayo con membrana. Los diagramas esquemáticos de una realización de este tubo de filtración se muestran en las figuras 3 y 4. El tubo de filtración tiene una forma que consiste en una parte de punta y una parte de cuerpo, por ejemplo, como se describe en la figura 3. El interior de la parte de punta se encuentra equipado con un filtro, como se muestra en la figura 4. En la parte de cuerpo se coloca una suspensión de muestra de espécimen y la parte de punta equipada con el filtro se acopla a la parte de cuerpo. La muestra de espécimen se filtra a través del filtro y, a continuación, el filtrado se deposita sobre el dispositivo de ensayo con membrana. La parte de cuerpo está hecha preferentemente de material flexible tal como polietileno y tereftalato de polietileno (PET, por su nombre en inglés) de modo que la muestra de espécimen se pueda filtrar fácilmente al aplicar presión con la mano o similar en el tubo acoplado al filtro.

Dispositivo de ensayo.

Un dispositivo de ensayo equipado con una membrana (también denominado dispositivo de ensayo con membrana), tal como se utiliza en la presente memoria, es un dispositivo que comprende una membrana que tiene una sustancia de captura inmovilizada sobre ésta o en fase sólida, que se une específicamente a un analito. Tal dispositivo de ensayo es preferentemente un dispositivo que utiliza un método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo o un método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral. El ejemplo del dispositivo de ensayo que utiliza un método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo es, por ejemplo, un dispositivo como el mostrado en las figuras 1 y 2.

La figura 1 es una vista en planta del dispositivo de tipo flujo continuo, y la figura 2 es una vista posterior a través de un plano de corte por la línea I-I' de la figura 1. "a" es un adaptador que tiene una apertura para depositar una muestra de espécimen preparada y que está equipado con orificios (orificio "A" y orificio "B") para pasar la muestra hasta el fondo. "b" es una membrana que lleva fijada una sustancia de captura a la que se une específicamente un analito. "c" es una guata para absorber líquidos.

El ejemplo del dispositivo de ensayo que utiliza un método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral es, por ejemplo, un dispositivo como se muestra en las figuras 5 y 6.

La figura 5 es una vista en planta del dispositivo de tipo flujo lateral, y la figura 6 es una vista posterior a través de un plano de corte por la línea II-II' de la figura 5. "g" es una guata que se ha instalado para recibir una muestra de espécimen preparada y que permite contener un reactivo de detección marcado en un estado seco. "h" es una guata que se instala para recibir un sustrato para la enzima, e "i" es una guata para absorber una solución que se deposite en ella. "j" es una membrana que lleva fijada una sustancia de captura que se une específicamente a un analito. "k" y "l" muestran la posición donde las sustancias de captura que se unen específicamente al analito se fijan sobre "j" en forma de línea. "m" es una hoja de apoyo de plástico para fijar los componentes del dispositivo para incrementar la solidez del dispositivo.

Membrana.

El material de la membrana en el dispositivo de ensayo con membrana incluye un material seleccionado del grupo que consiste en tela no tejida, papel, nitrocelulosa, fibra de vidrio, fibra de sílice, éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón, así como una mezcla de nitrocelulosa y de éster de celulosa. La sustancia microporosa derivada de la nitrocelulosa es particularmente preferente. Además, dicha mezcla de éster de celulosa y nitrocelulosa es de uso preferente. El tamaño del poro de la membrana o el tamaño de retención de partículas de dicha membrana no es inferior al tamaño del poro del filtro ni al tamaño de retención de partículas del filtro antes mencionado, y preferiblemente es de 0,3 a 15 μm, preferentemente de 0,4 a 12 μm. Además, el grosor de la membrana no está particularmente limitado, pero por lo general está dentro del orden de 100 a 200 μm.

Analito.

Un analito, tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye, pero sin limitarse a ellos, antígenos de virus tales como virus de la gripe, adenovirus, virus del sarcoma de Rous, VHA, HBc, VHC, VIH, VEB, virus de tipo Norwalk, etc., antígenos de bacterias tales como Chlamydia trachomatis, estreptococo hemolítico, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidium, Toxoplasma gondii, Borrelia, Bacillus anthracis, MRSA, etc., antígeno lipídico de Mycoplasma, hormonas peptídicas tal como gonadotropina coriónica humana (GCh), etc., esteroideas como la hormona esteroidea, etc., aminas biológicamente activas tales como epinefrina, morfina, etc., vitaminas tales como vitaminas B, etc., prostaglandinas, antibióticos tales como tetraciclina, etc., toxina producida por las bacterias y similares, distintos marcadores tumorales, sustancias químicas agrícolas, anticuerpo contra Escherichia coli, anticuerpo contra Salmonella, anticuerpo contra Staphylococcus, anticuerpo contra Campylobacter, anticuerpo contra Clostridium perfringens, anticuerpo contra Vibrio parahemolytica, anticuerpo antiverotoxina, anticuerpo antitransferrina humana, anticuerpo antialbúmina humana, anticuerpo antiinmunoglobulina humana, anticuerpo antimicroglobulina, anticuerpo anti-CRP, anticuerpo antitroponina, anticuerpo anti-GCh, anticuerpo contra Chlamydia trachomatis, anticuerpo antiestreptolisina O, anticuerpo contra Helicobacter pylori, anticuerpo antiglucano β, anticuerpo anti-HBe, anticuerpo anti-HBs, anticuerpo antiadenovirus, anticuerpo contra el VIH, anticuerpo antirotavirus, anticuerpo contra el virus de la gripe, anticuerpo antiparvovirus, anticuerpo contra el virus del sarcoma de Rous, anticuerpo anti-RF, nucleótido complementario a un componente de ácido nucleico obtenido de microorganismo patógeno y similares.

La muestra de espécimen a analizar mediante el método de la presente invención es como se ha definido anteriormente e incluye, pero sin limitarse a ellas, un líquido recogido mediante frotis de cavidad faríngea o nasal, suspendida en un tampón adecuado, aspirado de cavidad nasal y una solución de los mismos diluida en un tampón adecuado. Además, dicho tampón puede contener de 0,01 a 20% en peso de tensioactivo. El tensioactivo que se puede utilizar en la presente memoria incluye, pero no se limita a ellos, Triton X-100: mono-p-isooctilfeniléter de polietilenglicol (Nacalai Tesuque Inc.), Tween 20: monolaurato de sorbitano y polioxietileno (Nacalai Tesuque Inc), Tween 80: monooleato de sorbitano y polioxietileno (Nacalai Tesuque Inc.), NP-40: Nonidet P-40 (Nacalai Tesuque Inc.), Zwittergent: Zwittergent 3-14 (Calbiochem Co. Ltd), SDS: dodecilsulfato de sodio (Nacalai Tesuque Inc.), CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]propanosulfonato (DOJINDO Inc.), y similares, o una mezcla de dos o más de los mismos.

Sustancia de captura.

Una sustancia de captura para capturar un analito es una sustancia que se fija al analito a través de una reacción específica, tal como reacción entre anticuerpo y antígeno, para formar un complejo. Por lo tanto, es natural que la sustancia de captura a utilizar varíe según la clase del analito. Pero, en general, cuando el analito es una bacteria, virus, hormona, otro marcador clínico y similares, se puede utilizar como sustancia de captura cualquier anticuerpo

policlonal, anticuerpo monoclonal y similares que reaccionen específicamente con el analito. Ejemplos de otras sustancias de captura incluyen antígeno de virus, partícula similar a virus, una proteína expresada en E. coli con un gen recombinante, una proteína expresada en levadura con un gen recombinante y similares. El método que permite que tal sustancia de captura se fije a la superficie de la membrana antes mencionada puede ser mediante una absorción física o mediante un enlace químico. Una membrana que lleva fijada una sustancia de captura se prepara, por ejemplo, mediante la absorción de una solución de la sustancia de captura diluida en un tampón o similar sobre la membrana y luego secando la membrana.

Kit de ensayo con membrana simple.

El kit de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención es un kit que se utiliza en el método de ensayo con membrana simple antes mencionado de acuerdo con la presente invención. El kit de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención se define mediante las reivindicaciones y comprende al menos (1) y (2):

(1): un filtro, en donde el filtro está unido a la punta de un tubo de filtración; y

(2): un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva fijada una sustancia de captura para capturar un analito.

El tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro es de 0,2 a 8,0 μm.

El filtro antes mencionado se acopla al tubo de filtración para la muestra de espécimen antes mencionado.

El kit puede comprender además, si es necesario, una suspensión de espécimen, una composición de lavado, y/o un reactivo de detección marcado. Además, cuando la marca del reactivo de detección marcado es una marcación enzimática, el kit puede comprender un sustrato para la enzima, una solución de terminación de la reacción y similares como está descrito más adelante.

Además, cuando sea necesario, el kit puede además comprender una solución de control negativo que consiste en sólo un tampón para examinar la actividad del kit y un control positivo que consiste en un tampón que contiene un analito tal como una sustancia antigénica. Además, el kit puede comprender un instrumento de recogida de especímenes tal como una torunda de algodón estéril.

Suspensión de espécimen.

Un espécimen se recoge de la cavidad faríngea o nasal de un paciente, por ejemplo, utilizando un instrumento de recogida de especímenes tal como una torunda de algodón estéril, o se puede utilizar como espécimen un aspirado de seno nasal. El espécimen obtenido así generalmente se suspende en una suspensión de espécimen para realizar el ensayo. Se pueden utilizar como suspensión de espécimen los tampones y similares que generalmente se utilizan en la detección o cuantificación de la muestra mediante una técnica inmunológica, tal como método de inmunodifusión, inmunoensayo enzimático y método de aglutinación.

Más específicamente, los ejemplos de la suspensión de espécimen incluyen, pero sin limitarse a ellos, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS), PBS con gelatina, PBS con seroalbúmina bovina (SAB), tampón de Good, caldo de infusión de ternera (VIB), caldo de infusión de corazón, medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), EMEM con SAB y similares. Además, se puede utilizar una combinación de dos o más de los tampones anteriores.

Por otra parte, además de la composición anterior, se pueden añadir aminoácidos básicos, sales inorgánicas y/o tensioactivos. Es preferente el uso de una suspensión de espécimen que contiene al menos dos entre aminoácidos básicos, sales inorgánicas y tensioactivos, porque así se disminuye el hecho de que componentes en la muestra de espécimen que no sean el analito se fijen a la propia membrana y se unan inespecíficamente a la sustancia de captura sobre la membrana.

Reactivo de detección.

Un reactivo de detección, tal y como se utiliza en la presente memoria, es cualquier cosa que sea capaz de fijarse específicamente a un analito para formar un complejo con el analito. Además, un reactivo de detección marcado se refiere a un reactivo de detección que se ha marcado y es detectable de alguna manera después de formar un complejo con el analito. Por ejemplo, cuando el analito es una sustancia antigénica tal como un virus, se puede incluir un anticuerpo contra el virus que esté marcado con una enzima o similares. Si el reactivo de detección se ha marcado con una enzima de esta manera, la detección del complejo se puede realizar añadiendo un sustrato de tal enzima que produce una sustancia que se puede detectar mediante el método colorimétrico o el método de fluorescencia a través de una reacción catalizada por tal enzima. El reactivo de detección antes de la marcación incluye las mismas sustancias que las descritas más arriba para la sustancia de captura. Además, la marcación incluye enzima, marcación fluorescente, marcación magnética, isótopo radiactivo, coloide de oro, látex coloreado y similares.

Cuando se utiliza una marcación enzimática, la marcación enzimática utilizada incluye, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y similares.

Sustrato.

Cuando se utiliza una marcación enzimática como forma de marcación de un reactivo de detección marcado, generalmente se añade un sustrato de tal enzima que produce una sustancia que se puede detectar mediante método colorimétrico o método de fluorescencia gracias a una reacción catalizada mediante tal enzima. Los ejemplos operativos incluyen el ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfórico (BCIP)/azul de nitrotetrazolio (NBT), tetrametilbenzidina (TMB) y glucosa-6-fosfato NAD+.

Solución de terminación de la reacción.

El kit de acuerdo con la presente invención puede comprender además, si fuera necesario, una solución de terminación de la reacción para terminar una reacción, tal como una reacción entre una enzima y un sustrato. Tal solución de terminación de la reacción incluye, por ejemplo, ácido cítrico, ácido sulfúrico y similares.

Ejemplos

Ejemplo 1.

Detección del virus de la gripe mediante el método de ensayo inmunocromatográfico de tipo flujo continuo.

1. Preparación del anticuerpo monoclonal.

(1) Preparación del anticuerpo (de ratón) monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo A

Se extirpó el bazo de un ratón BALB/c que había estado inmunizado con el antígeno del virus de la gripe de tipo A purificado y se mantuvo durante cierto tiempo, y se fusionó con células de mieloma de ratón (P3 x 63) mediante el método de Kohler et al., (Kohler et al., Nature, vol. 256, páginas 495-497 (1975)).

La célula fusionada obtenida (hibridoma) se mantuvo en una incubadora a 37 ºC y se purificó la célula (monoclonación) mientras se confirmaba la actividad del anticuerpo del sobrenadante mediante ELISA con una placa cuya fase sólida lleva el antígeno NP del virus de la gripe de tipo A.

Dos de las células obtenidas se administraron por vía intraperitoneal a un ratón BALB/c tratado con pristano, y después de unas 2 semanas se recogió cada ascitis que contenía un anticuerpo. Se purificó la IgG de cada una de las ascitis obtenidas mediante fraccionamiento con sulfato de amonio para producir dos clases de anticuerpos monoclonales purificados anti-NP del virus de la gripe de tipo A.

(2) Preparación del anticuerpo (de ratón) monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo B

Se extirpó el bazo de un ratón BALB/c que había sido inmunizado con el antígeno del virus de la gripe de tipo B purificado y se mantuvo durante cierto tiempo, y se fusionó con células de mieloma de ratón (P3 x 63) mediante el método de Kohler et al. (Kohler et al., Nature, vol. 256, páginas. 495-497 (1975)).

La célula fusionada obtenida (hibridoma) se mantuvo en una incubadora a 37 ºC y se purificó la célula (monoclonación) mientras se confirmaba la actividad del anticuerpo del sobrenadante mediante ELISA con una placa cuya fase sólida lleva el antígeno NP del virus de la gripe de tipo B.

Dos de las células obtenidas se administraron por vía intraperitoneal a un ratón BALB/c tratado con pristano, y después de unas 2 semanas se recogió cada ascitis que contenía un anticuerpo. Se purificó la IgG de cada una de las ascitis obtenidas por fraccionamiento con sulfato de amonio para producir dos clases de anticuerpos monoclonales purificados anti-NP del virus de la gripe de tipo B.

2. Preparación de la solución del anticuerpo marcado anti-gripe.

(1) Preparación de la solución del anticuerpo marcado anti-gripe de tipo A

Se dializaron 20 mg de una clase de anticuerpo monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo A purificado frente a tampón de acetato a 0,1 M (pH 3,8) seguido de la adición de 10 mg de pepsina y se digirió el Fab' durante una hora a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir una fracción purificada del F(ab')2 anti-gripe de tipo A. La fracción obtenida así se concentró hasta unos 10 mg/ml y luego se mezcló con mercaptoetilamina a 0,1 M a una proporción en volumen de 10:1 y se realizó el tratamiento de reducción durante 90 minutos a 37 ºC. Se fraccionó la solución tratada a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir una fracción purificada de Fab' anti-gripe de tipo A y después se concentraron las fracciones hasta aproximadamente 1 ml.

Se dializaron 1,5 ml de fosfatasa alcalina (10 mg/ml) con tampón de borato a 50 mM (ácido bórico a 50 mM (pH 7,6), cloruro de magnesio a 1 mM, cloruro de zinc a 0,1 mM) y luego se añadieron 0,7 mg de N-(6

maleimidacaproiloxi)succinimida (EMCS; DOJINDO Inc.) y a continuación se dejó reposar la mezcla durante una hora a 30 ºC. Se fraccionó la solución tratada por una columna Sephadex G-25 y se recuperó el primer pico para producir maleimida-fosfatasa alcalina, y después se concentraron las fracciones hasta aproximadamente 1 ml.

El Fab' concentrado contra la gripe de tipo A se mezcló con maleimida-fosfatasa alcalina en la proporción de proteínas de 1:2,3, se agitó suavemente la mezcla resultante durante 20 horas a 4 ºC y se hizo reaccionar para producir Fab' contra la gripe de tipo A marcado con fosfatasa alcalina. La solución de la reacción se fraccionó por una columna AcA44 y se retiraron los materiales sin reaccionar para dar el Fab' purificado marcado con fosfatasa alcalina.

El Fab' purificado marcado con la fosfatasa alcalina se diluyó hasta 1,0 μg/ml con una solución para diluir el anticuerpo marcado que comprende seroalbúmina bovina al 4,5% (p/v), polietilenglicol 6000 al 5,25% (p/v), tampón de Tris-ácido clorhídrico a 10 mM (pH 7,4), cloruro de sodio a 150 mM, Triton X-100 al 1,5% (p/v), cloruro de magnesio a 1,5 mM y cloruro de zinc a 0,15 mM, y a continuación se filtró la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm para producir la solución del anticuerpo contra la gripe de tipo A marcado.

(2) Preparación de la solución de anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B

Se dializaron 20 mg de una clase de anticuerpo monoclonal purificado anti-NP del virus de la gripe de tipo B frente a tampón de acetato a 0,1 M (pH 3,8), y luego se añadieron 10 mg de pepsina y se digirió el Fab' durante una hora a 37ºC. Se fraccionó la solución tratada a través de la columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción purificada del F(ab')2 contra la gripe de tipo B. La fracción obtenida así se concentró hasta unos 10 mg/ml y luego se mezcló con mercaptoetilamina a 0,1 M en una proporción de volumen de 10:1 y se realizó el tratamiento de reducción durante 90 minutos a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción purificada de Fab' contra la gripe de tipo B, y luego se concentró la fracción a aproximadamente 1 ml.

El Fab' concentrado contra la gripe de tipo B se mezcló con maleimida-fosfatasa alcalina preparada en el párrafo "2.(1)" más arriba en la proporción de proteínas de 1:2,3, la mezcla resultante se agitó suavemente durante 20 horas a 4 ºC y se hizo reaccionar para producir el Fab' contra la gripe de tipo B marcado con fosfatasa alcalina. La solución de la reacción se fraccionó a través de una columna AcA44 y los materiales sin reaccionar se retiraron para dar el Fab' marcado con fosfatasa alcalina purificado.

El Fab' purificado marcado con fosfatasa alcalina se diluyó hasta 1,0 μg/ml con una solución para diluir el anticuerpo marcado que comprende seroalbúmina bovina al 4,5% (p/v), polietilenglicol 6000 al 5,25% (p/v), tampón de Trisácido clorhídrico a 10 mM (pH 7,4), cloruro de sodio a 150 mM, Triton X-100 al 1,5% (p/v), cloruro de magnesio a 1,5 mM y cloruro de zinc a 0,15 mM, y a continuación se filtró la solución a través del filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm para producir la solución del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B.

3. Preparación del dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo para la detección del virus de la gripe.

Se utilizó el dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo para la detección del virus de la gripe cuya constitución es la misma que se muestra en las figuras 1 y 2. Se utilizó como membrana una membrana de nitrocelulosa que tiene un tamaño de poro de 3 μm (Immunopore fabricado por Whatman Corporation, tamaño de 2 x 3 cm, grosor de 125 μm).

La inmovilización de un anticuerpo a la membrana se realizó depositando puntos de dos clases de soluciones de anticuerpo sobre la membrana de nitrocelulosa. Los 12 μl de la solución que contiene 0,2 mg/ml del anticuerpo monoclonal purificado anti-NP del virus de la gripe de tipo A que no se utilizó en la "preparación del anticuerpo contra la gripe de tipo A" se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm para depositarlo como punto en el orificio A del dispositivo. Los 12 μl de la solución que contiene el anticuerpo monoclonal purificado anti-NP del virus de la gripe de tipo B a 1 mg/ml que no se utilizó en la "preparación del anticuerpo contra la gripe de tipo B marcado" se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm para depositarlo como punto en el orificio B del dispositivo. Se utilizó tampón de citrato a 10 mM (pH 4,0) para diluir los anticuerpos. Entonces, los anticuerpos depositados en puntos se secaron en una cámara de secado a 45 ºC durante 40 minutos para preparar un dispositivo de ensayo con membrana para la detección del virus de la gripe.

4. Detección del virus de la gripe.

(1) Detección mediante el método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo

Se recogieron los líquidos mediante frotis con una torunda de algodón estéril de cada seno nasal de 115 pacientes de los que había sospecha clínica de una infección con el virus de la gripe y luego se suspendieron en 1,5 ml de una solución que tiene una composición de tampón de fosfato a 50 mM (pH 7,0), cloruro de sodio a 1,5 M, Triton X-100 al 1% (p/v) y seroalbúmina bovina al 0,5% (p/v) para preparar una muestra para el ensayo. La muestra también se suspendió y entonces se dividió en tres alícuotas de 40 μl en tres tubos de filtración para la muestra de espécimen. A continuación se montó la siguiente boquilla en la punta de cada tubo, respectivamente; la boquilla 1 comprende un filtro de una membrana de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,45 μm emparedada entre dos fibras de vidrio

con un tamaño de poro de 0,67 μm (tamaño de las partículas retenidas); la boquilla 2 comprende un filtro que es una pila de tres fibras de vidrio con un tamaño de poro de 0,67 μm (tamaño de las partículas retenidas); y la boquilla 3 no comprende ningún filtro (comparativo).

Cada una de las muestras de espécimen se filtró a través de cada boquilla. A continuación se añadieron 150 μl del filtrado a cada uno de los orificios A y B del dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo preparado en el párrafo "3" de más arriba y se dejó reposar hasta que la muestra se absorbió completamente en un componente de absorción de líquidos equipado por debajo de la membrana de nitrocelulosa. Después se añadió gota a gota en el orificio A una alícuota de 180 μl de la solución del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo A, en el orificio B se añadió una alícuota de 180 μl de la solución del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B y entonces se dejó reposar hasta que cada una de las soluciones de anticuerpo se absorbió completamente en el componente de absorción de líquidos. A continuación se retiró el adaptador, se añadió gota a gota en cada uno de los orificios A y B hasta 150 μl de una solución de lavado que tiene una composición de tampón de fosfato a 20 mM (pH 7,0), cloruro de sodio a 0,5 M, hidrocloruro de arginina al 5% (p/v) y Triton X-100 al 1% (p/v) y entonces se dejó reposar hasta que cada una de dichas disoluciones de lavado se absorbieron completamente en el componente de absorción de líquidos. Posteriormente se añadieron gota a gota 250 μl de la solución de sustrato BCIP/NBT (fabricado por Sigma Corporation) a cada uno de los orificios A y B para iniciar una reacción de coloración. Después de 10 minutos se añadieron gota a gota 150 μl de tampón de citrato a 100 mM (pH 3,0) a cada uno de los orificios A y B para detener la reacción. Inmediatamente después de finalizar la reacción, se observaron los orificios A y B desde una posición ortogonal superior. Si la coloración se observaba sólo en el orificio A, entonces se consideraba positivo para el virus de la gripe de tipo A, si la coloración aparecía sólo en el orificio B, entonces se consideraba positivo para el virus de la gripe de tipo B, si la coloración se observaba en los orificios A y B, entonces se consideraba positivo para los virus de la gripe de tipo A y B, y si la coloración no se observaba en ninguno de los orificios, entonces se consideraba negativo para los dos virus de la gripe de tipo A y B.

(2): Detección mediante el método de RT-PCR

El resto de las muestras para ensayo preparadas en el párrafo "4.(1)" de más arriba se utilizaron para determinar la presencia de los genes del virus de la gripe en el espécimen mediante el método de RT-PCR. El método de RT-PCR se realizó mediante el método de Shimizu ("Kansensho-gaku Zasshi" (The journal of the Japanese Association for Infectious Diseases), vol. 71, n.º 6, págs. 522-526).

(3): Comparación entre el método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo y el método de RT-PCR

La comparación de los resultados entre el método de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención y el método de RT-PCR mencionado más arriba se muestra en las tablas 1 a 3. Se sabe que el método de RT-PCR es un método de medición cuya sensibilidad y especificidad son muy elevadas, por lo que si la valoración fuera diferente de la obtenida por el método de RT-PCR, entonces se consideraría como positivo falso o negativo falso.

Tabla 1

Comparación cuando se utiliza la boquilla 1

Método de RT-PCR

Positivo para tipo A: Positivo para tipo B Positivo para tipos A y B Negativo Total

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 32 0 0 0 32

Positivo para tipo B: 0 18 0 0 18

Positivo para tipos A y B: 0 0 0 0 0

Negativo: 0 0 0 65 65

Total: 32 18 0 65 115

*: El valor numérico en la tabla se refiere al número de especímenes.

*: Los valores numéricos de la tabla se refieren al número de especímenes. Además, el valor numérico entre corchetes se refiere a positivos falsos.

Tabla 3 Comparación cuando se utiliza la boquilla 3

Tabla 2 Comparación cuando se utiliza la boquilla 2

Método de RT-PCR

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 30 0 0 0 30

Positivo para el tipo B: 0 15 0 [3] 18

Positivo para tipos A y B: [2] [3] 0 0 5

Negativo: 0 0 0 62 62

Total: 32 18 0 65 115

Método de RT-PCR

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 5 0 0 0 5

Positivo para tipo B: 0 2 0 [18] 20

Positivo para tipos A y B: [27] [16] 0 [35] 78

Negativo: 0 0 0 12 12

Total: 32 18 0 65 115

Cuando se utilizó la boquilla 1, los resultados del método de ensayo con membrana fueron completamente idénticos

10 a los resultados del método de RT-PCR y no hubo ningún resultado positivo falso. Cuando se utilizó la boquilla 2, la incidencia de positividad falsa fue del 7% (8 especímenes entre 115 [el número total de especímenes positivos falsos está entre corchetes en la tabla 2]) pero el resto de resultados concordaban con los resultados del método de RT-PCR. Por otra parte, en el caso de utilizar la boquilla 3, la incidencia de la positividad falsa fue del 83% (96 entre 115 especímenes [el número total de especímenes positivos falsos está entre corchetes en la tabla 3]).

15 Ejemplo 2.

Detección del virus de la gripe mediante el método de ensayo inmunocromatográfico de tipo flujo lateral.

1. Preparación del anticuerpo monoclonal.

(1) Preparación del anticuerpo (de ratón) monoclonal anti-NP del virus de la gripe A Este anticuerpo se preparó de la misma manera que en el método descrito en el ejemplo 1, párrafo 1.(1).

20 (2) Preparación del anticuerpo (de ratón) monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo B Este anticuerpo se preparó de la misma manera que en el método descrito en el ejemplo 1, párrafo 1.(2).

2. Preparación del anticuerpo marcado contra la gripe.

(1) Preparación del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo A

Se dializaron 20 mg de una clase de los anticuerpos monoclonales purificados anti-NP del virus de la gripe de tipo A frente a tampón de acetato a 0,1 M (pH 3,8), después se añadieron 10 mg de pepsina y se digirió el Fab' durante una hora a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción purificada del F(ab')2 contra la gripe de tipo A. La fracción obtenida así se concentró hasta unos 10 mg/ml, luego se mezcló con mercaptoetilamina a 0,1 M en una proporción en volumen de 10:1 y se realizó el tratamiento de reducción durante 90 minutos a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción purificada de Fab' contra la gripe de tipo A y luego se concentró la fracción hasta aproximadamente 1 ml.

Se dializaron 1,5 ml de fosfatasa alcalina (10 mg/ml) frente a tampón de borato a 50 mM (ácido bórico a 50 mM (pH 7,6), cloruro de magnesio a 1 mM, cloruro de zinc a 0,1 mM), luego se añadieron 0,7 mg de N-(6maleimidacaproiloxi)succinimida (EMCS; DOJINDO Inc.) y se dejó reposar la mezcla durante una hora a 30 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna Sephadex G-25 y se recuperó el primer pico para producir maleimida-fosfatasa alcalina seguido de la concentración de la fracción hasta aproximadamente 1 ml.

El Fab' concentrado contra la gripe de tipo A se mezcló con maleimida-fosfatasa alcalina en la proporción de proteínas de 1:2,3, la mezcla resultante se agitó con suavidad durante 20 horas a 4 ºC y se hizo reaccionar para producir el Fab' contra la gripe de tipo A marcado con fosfatasa alcalina. La solución de la reacción se fraccionó a través de una columna AcA44 y los materiales sin reaccionar se retiraron para dar el Fab' purificado marcado con la fosfatasa alcalina.

(2) Preparación del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B

Se dializaron 20 mg de una clase de los anticuerpos purificados contra el virus de la gripe de tipo B frente a tampón de acetato a 0,1 M (pH 3,8), después se añadieron 10 mg de pepsina y se digirió el Fab' durante una hora a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción purificada de F(ab')2 contra la gripe de tipo B. La fracción obtenida así se concentró hasta unos 10 mg/ml, luego se mezcló con mercatoetilamina a 0,1 M en una proporción de volumen de 10:1 y se realizó el tratamiento de reducción durante 90 minutos a 37 ºC. La solución tratada se fraccionó a través de una columna AcA44 de ultrogel para producir la fracción de Fab' contra la gripe de tipo B y luego se concentró la fracción a aproximadamente 1 ml.

El Fab' contra la gripe de tipo B concentrado se mezcló con maleimida-fosfatasa alcalina preparada en 2.(1) en la proporción de proteínas de 1:2,3, la mezcla resultante se agitó con suavidad durante 20 horas a 4ºC y se hizo reaccionar para producir el Fab' contra la gripe de tipo B marcado con fosfatasa alcalina. La solución de la reacción se fraccionó a través de una columna AcA44 y los materiales sin reaccionar se retiraron para dar el Fab' purificado marcado con fosfatasa alcalina.

3. Preparación del dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo lateral para la detección del virus de la gripe.

Se utilizó el dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo lateral para la detección del virus de la gripe cuya constitución es la misma que se muestra en las figuras 5 y 6. La membrana "j" consiste en una membrana de nitrocelulosa que tiene un tamaño de poro de 5 μm (PuraBind fabricado por Whatman Corporation, tamaño de 5 x 50 mm, grosor de 200 μm). Con 2,0 μl de la solución que contiene 1 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo B purificado que no se utilizó en la "preparación del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B" se revistió un patrón de línea (anchura de 1,0 mm) sobre la posición "k" a 15 mm de un extremo de la membrana "j" (de aquí en adelante este extremo se denominará "extremo flujo abajo"), y con 2,0 μl de la solución que contiene 0,2 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-NP del virus de la gripe de tipo A purificado que no se utilizó en la "preparación del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo A" se revistió un patrón de línea (anchura de 1,0 mm) sobre la posición "l" a 18 mm de dicho extremo flujo abajo. En estas etapas de revestimiento se utilizó el tampón de citrato a 10 mM (pH 4,0) para diluir los anticuerpos de la fase sólida y se filtró la solución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 μm inmediatamente antes de la inmovilización. Después de que la solución se depositara sobre la membrana, se secó en una cámara de secado a 45 ºC durante 40 minutos.

A continuación, se fijaron los componentes y la hoja de plástico de apoyo "m" (fabricada por BioDot Corporation) se ajustó para incrementar la resistencia sobre el lado opuesto a la superficie de la membrana revestida con el anticuerpo.

Luego se depositaron 12 μl, tanto del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo A como del anticuerpo marcado contra la gripe de tipo B preparados en el párrafo "2." de más arriba (cada concentración era de 2 μg/ml), sobre una guata de celulosa/fibra de vidrio (WF 1,5 fabricado por Whatman Corporation, 7 mm x 10 mm, grosor de 1,4 mm) y se secó durante 40 minutos en una cámara de secado a 45 ºC. Esta guata se fijó en una posición a 23 mm del extremo corriente abajo para conformar la guata "g" receptora de la muestra. La guata de celulosa/fibra de vidrio (WF 1,5 fabricado por Whatman Corporation, 7 mm x 15 mm, grosor de 1,4 mm) se fijó en una posición donde se solapaba con 2 mm del extremo corriente arriba de la membrana para conformar la guata "h" receptora del sustrato.

Entonces, la guata de celulosa/fibra de vidrio (WF 1,5 fabricado por Whatman Corporation, 10 mm x 20 mm, grosor de 1,5 mm) se fijó sobre una posición donde se solapaba con 5 mm del extremo corriente abajo de la membrana para conformar la guata "i" de absorción.

4. Detección del virus de la gripe.

(1) Detección mediante el método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral

Se recogieron los líquidos mediante frotis con una torunda de algodón estéril de cada seno nasal de 92 pacientes que se sospechaba, desde el punto de vista clínico, que tenían una infección por el virus de la gripe, y luego se suspendieron en 0,8 ml de solución que tiene una composición de tampón Tris-HCl a 20 mM (pH 8,0), cloruro de sodio a 0,6 M, Triton x-100 al 1% (p/v), hidrocloruro de L-arginina al 2,0% (p/v) y seroalbúmina bovina al 1,0% (p/v) para preparar una muestra a analizar. La muestra se suspendió bien y entonces se dividió en tres alícuotas de 200 μl en cada uno de tres tubos de filtración para la muestra de espécimen. A continuación, se montó la siguiente boquilla en la punta de cada tubo, respectivamente; la boquilla 1 comprende un filtro de una membrana de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,45 μm emparedado entre dos fibras de vidrio con un tamaño de poro de 0,67 μm (tamaño de las partículas retenidas); la boquilla 4 comprende un filtro que es una pila de tres fibras de vidrio con un tamaño de poro de 1,0 μm (tamaño de las partículas retenidas); y la boquilla 3 no comprende ningún filtro (comparativo).

Cada una de las muestras de espécimen se filtró a través de cada boquilla y después se añadió una alícuota de 60 μl a la guata receptora de la muestra del dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo lateral preparado en el párrafo "3." de más arriba, y se dejó reposar durante 3 minutos. Entonces se añadieron gota a gota 60 μl de la solución del sustrato BCIP/NBT (fabricado por Sigma Corporation) para iniciar la reacción de coloración. Después de 10 minutos, se observaron la posición de "e" y "f" en las figuras 5 y 6 desde la dirección ortogonal superior. Si la coloración se observaba sólo en la posición "e", entonces se consideraba positivo para el virus de la gripe de tipo B, si la coloración se observaba sólo en la posición "f", entonces se consideraba positivo para el virus de la gripe de tipo A, si la coloración se observaba en las posiciones "e" y "f", entonces se consideraba positivo para los virus de la gripe de tipo A y B, y si no se observaba ninguna coloración en ninguna de las posiciones, entonces se consideraba negativo para los dos virus de la gripe de tipo A y B.

(2): Detección mediante el método de RT-PCR

El resto de las muestras para ensayo preparadas en el párrafo "4.(1)" se utilizaron para determinar la presencia de los genes del virus de la gripe en los especímenes mediante el método de RT-PCR. El método de RT-PCR se realizó mediante el método de Shimizu (The Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases, vol. 71, n.º 6, págs. 522-526).

(3): Comparación entre el método de ensayo con membrana de tipo flujo lateral y el método de RT-PCR

La comparación de los resultados entre el método de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención y el método de RT-PCR mencionado más arriba se muestra en las tablas 4 a 6. El método de RT-PCR se sabe es que un método de medición que tiene una sensibilidad y especificidad muy elevadas, por lo que si el resultado fuera diferente con el uso del método de RT-PCR, entonces se consideraría como positivo falso o negativo falso.

Tabla 4

Comparación cuando se utiliza la boquilla 1

Método de RT-PCR

Positivo para tipo A: Positivo para tipo B Positivo para tipo A y B Negativo Total

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 26 0 0 0 26

Positivo para tipo B: 0 11 0 0 11

Positivo para tipo A y B: 0 0 0 0 0

Negativo: 0 0 0 55 55

Total: 26 11 0 55 92

*: El valor numérico en la tabla se refiere al número de especímenes.

*: El valor numérico en la tabla se refiere al número de especímenes. Además, el valor numérico entre corchetes se refiere a positivos falsos.

Tabla 6 Comparación cuando se utiliza la boquilla 3

Tabla 5 Comparación cuando se utiliza la boquilla 4

Método de RT-PCR

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 25 0 0 0 30

Positivo para tipo B: 0 9 0 [2] 11

Positivo para tipo A y B: [1] [2] 0 0 3

Negativo: 0 0 0 53 53

Total: 26 11 0 55 92

Método de RT-PCR

Método de ensayo con membrana: Positivo para tipo A 18 0 0 0 18

Positivo para tipo B: 0 7 0 [10] 17

Positivo para tipo A y B: [8] [4] 0 [7] 19

Negativo: 0 0 0 38 38

Total: 26 11 0 55 92

Cuando se utiliza la boquilla 1, los resultados mediante el método de ensayo con membrana fueron completamente

10 idénticos a los resultados mediante el método de RT-PCR y no hubo ningún resultado positivo falso. Cuando se utilizó la boquilla 4, la incidencia de la positividad falsa fue del 5% (5 de los 92 especímenes [número total de especímenes positivos falsos entre corchetes en la tabla 5]) y los resultados restantes concordaban con los resultados mediante el método de RT-PCR. Por otra parte, cuando se utilizó la boquilla 3, la incidencia de la positividad falsa fue del 32% (29 de los 92 especímenes [número total de especímenes positivos falsos entre

15 corchetes en la tabla 6]).

El efecto de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, se ha establecido un método de ensayo con membrana simple muy fiable que es capaz de evitar la aparición de positividad falsa.

Aplicabilidad industrial

20 El método de ensayo con membrana simple o el kit de ensayo con membrana simple de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para una prueba simple en la cual se puede detectar o cuantificar in situ con rapidez y precisión un analito tal como patógeno y anticuerpo en un espécimen recogido en una consulta médica o por un individuo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de ensayo con membrana para detectar o cuantificar un analito en una muestra de espécimen utilizando un dispositivo de ensayo equipado con una membrana a la cual está fijada una sustancia de captura para capturar el analito, que comprende las etapas de:

filtrar la muestra de espécimen utilizando un filtro que está unido a la punta de un tubo de filtración, depositar el filtrado sobre la membrana, y detectar o cuantificar la presencia del analito en la muestra de espécimen,

en donde la muestra de espécimen se ha recogido de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspirado de cavidad nasal, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro es de 0,2 a 8,0 μm.
2.

El método según la reivindicación 1, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas de la membrana no es menor que el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro.
3.

El método según la reivindicación 1 o 2, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas de la membrana es de 0,3 a 15 μm.
4.

El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tubo de filtración consiste en una parte de cuerpo y una parte de punta, en donde la parte de cuerpo del tubo de filtración está hecha de un material flexible, en donde el método comprende las etapas de:

(i)

poner una suspensión de muestra de espécimen en la parte de cuerpo del tubo de filtración;

(ii)

unir la parte de punta equipada con el filtro a la parte de cuerpo;

(iii) filtrar la muestra de espécimen a través del filtro por aplicación de presión en el tubo de filtración manualmente;

(iv)

después depositar el filtrado sobre la membrana; y

(v)

detectar o cuantificar la presencia del analito en la muestra de espécimen,

en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas de la membrana no es menor que el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro y es de 0,3 a 15 μm.
5.

El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el material flexible se selecciona entre polietileno y tereftalato de polietileno.
6.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el material de la membrana se selecciona entre el grupo que consiste en tela no tejida, papel, nitrocelulosa, fibra de vidrio, fibra de sílice, éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón y una mezcla de éster de celulosa y de nitrocelulosa.
7.

El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el material de la membrana es nitrocelulosa y su tamaño de poro es de 0,4 a 12 μm.
8.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el analito es un virus de la gripe.
9.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el filtro es una combinación de dos o más filtros.
10.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el material del filtro se selecciona entre el grupo que consiste en tela no tejida, papel, fibra de vidrio, fibra de sílice, nitrocelulosa, éster de celulosa, una mezcla de nitrocelulosa y de éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón, poliéster, algodón, fibra de acero inoxidable y una combinación de los mismos.
11.

El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el filtro es un filtro de fibra de vidrio, un filtro de nitrocelulosa o una combinación de filtro de fibra de vidrio y filtro de nitrocelulosa.
12.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un método de ensayo con membrana de tipo flujo continuo o de tipo flujo lateral.
13.

El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo y el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho

filtro es de 0,2 a 4,0 μm.
14. Kit de ensayo con membrana para detectar o cuantificar la presencia de un analito en una muestra de espécimen, en donde la muestra de espécimen se recoge de la cavidad faríngea o nasal de un paciente o es un aspirado de cavidad nasal, donde dicho kit comprende:

(1)

un filtro para filtrar la muestra de espécimen, en donde el filtro está unido a la punta de un tubo de filtración; y

(2)

un dispositivo de ensayo equipado con una membrana que lleva fijada una sustancia de captura para capturar el analito;

en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro es de 0,2 a 8,0 μm.
15.

El kit de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partícula de la membrana no es menor que el tamaño de poro el tamaño de retención de partícula del filtro.
16.

El kit de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas de la membrana es de 0,3 a 15 μm.
17.

El kit de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el tubo de filtración consiste en una parte de cuerpo y una parte de punta, en donde la parte de cuerpo está hecha de material flexible y en donde el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas de la membrana no es menor que el tamaño de poro o el tamaño de retención de partículas del filtro y es de 0,3 a 15 μm.
18.

El kit de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el material flexible se selecciona entre polietileno y tereftalato de polietileno.
19.

El kit de acuerdo con la reivindicación 14 a 18, que además comprende:

(3)

una suspensión de espécimen;

(4)

una composición de lavado;

(5)

un reactivo de detección marcado;

(6)

un instrumento de recogida de especímenes; y/o

(7)

una solución de control.
20.

El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en donde el material de la membrana se selecciona del grupo que consiste en tela no tejida, papel, nitrocelulosa, fibra de vidrio, fibra de sílice, éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón y una mezcla de éster de celulosa y de nitrocelulosa.
21.

El kit según la reivindicación 20, en donde el material de la membrana es nitrocelulosa y su tamaño de poro es de 0,4 a 12 μm.
22.

El kit de acuerdo con una cualquiera de klas reivindicaciones 14 a 21, en donde el analito es un virus de la gripe.
23.

El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en donde el filtro es una combinación de dos o más filtros.
24.

El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 23, en donde el material del filtro se selecciona entre el grupo que consiste en tela no tejida, papel, fibra de vidrio, fibra de sílice, nitrocelulosa, éster de celulosa, una mezcla de nitrocelulosa y de éster de celulosa, polietersulfona, polisulfona, tetrafluoruro de polietileno, fluoruro de polivinilideno, policarbonato, polipropileno, poliamida, 6,6-nilón, poliéster, algodón, fibra de acero inoxidable y una combinación de los mismos.
25.

El kit de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el filtro es un filtro de fibra de vidrio, un filtro de nitrocelulosa

o una combinación de filtro de fibra de vidrio y filtro de nitrocelulosa.
26.

El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, que es un kit de ensayo con membrana de tipo flujo continuo o de tipo flujo lateral.
27.

El kit de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el dispositivo de ensayo es un dispositivo de ensayo con membrana de tipo flujo continuo y el tamaño de poro del filtro o el tamaño de retención de partículas en dicho filtro es de 0,2 a 4,0 μm