PT93480B - Diagnosticos e vacinas nanbv - Google Patents

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Description

Campo do invento invento diz respeito a materiais e metodologias para o controlo da disseminação da infecção pelo virus da hepatite não-A, não-B (NANBV). Mais especificamente, ele diz respeito a polinucleótidos derivados do genoma de um agente etiológico da NANBH, o virus da hepatite C (HCV), a polipéptidos por ele codificados, e a anticorpos dirigidos contra os polipéptidos. Estes reagentes são úteis como agentes de despiste para o HCV e a sua infecção, e como agentes de protecção contra a doença.
J
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Patentes citadas
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Patente norte-americana no 4.341.761
Patente norte-americana no 4.399.121
Patente norte-americana no 4.427.783
Patente norte-americana no 4.444.887
Patente norte-americana no 4.466.917
Patente norte-americana no 4.472.500
Patente norte-americana no 4.491.632
Patente norte-americana no 4.493.890
Antecedentes do invento
A hepatite não-A, não-B (NANBH) é uma doença, (ou família de doenças), transmissível, que se crê ser induzida por virus, e que se distingue de outras formas de doenças do figado associadas a virus, incluindo as causadas por virus de hepatite conhecidos, i.e., virus da hepatite A (HAV), virus da hepatite B (HBV), e virus da hepatite delta (HDV), bem como das hepatites induzidas por citomegalovirus (CMV), ou virus de Epstein-Barr (EBV). A NANBH foi primeiro identificada em indivíduos submetidos a transfusões. A transmissão do Homem para o chimpanzé e a passagem em série nos chimpanzés evidenciou que a NANBH se deve a um agente, ou agentes, infecciosos, e transmissíveis.
As características epidemiológicas sugerem que podem existir três tipos diferentes de NANBH: o tipo epidémico, provocado pelo consumo de água infectada; o tipo associado a sangue ou agulhas; e o tipo de ocorrência espontânea
Ρ (adquirido pela comunidade). Contudo, é desconhecido o número de agentes que podem causar a NANBH.
diagnóstico clinico e a identificação da NANBH têm sido conseguidos principalmente por exclusão de outros marcadores virais. Entre os métodos usados para detectar antigénios e anticorpos atribuíveis à NANBH estão a difusão em gel de agar, a contraimunoelectroforese, microscopia de imunofluorescência, imunocitoquimica para microscopia electrónica, radioimunoensaio, e ELISA. Contudo, nenhum destes ensaios provou ser suficientemente sensível, especifico, e reprodutível para ser usado como teste de diagnóstico para a
NANBH.
Anteriormente não havia clareza nem acordo quanto à identidade ou especificidade dos sistemas antigénio-anticorpo associados aos agentes da NANBH. Isto era devido, pelo menos em parte, à infecção prévia ou co-infecção de HBV e NANBV em indivíduos, e à conhecida complexidade dos antigénios solúveis e particulados associados com o HBV, bem como â integração do DNA do HBV no genoma das células do figado. Adicionalmente, existe a possibilidade da NANBH ser causada por mais que um agente infeccioso, bem como a possibilidade da NANBH ter sido diagnosticada incorrectamente. Para além disto, não é claro o que os ensaios serológicos detectam no soro de pacientes com NANBH. Foi postulado que a difusão em gel de agar e os ensaios de contraimunoelectroforese detectam respostas auto-imunes ou interacções nâo-especificas de proteínas que ocorrem por vezes entre amostras de soros, e que não representam reacções especificas de antigénios-anticorpos de NANBV. Os ensaios de imunofluorescência, ELISA, e radioimunoensaios parecem detectar niveis baixos de um material semelhante ao factor reumatóide, que está frequentemente presente no soro de pacientes com NANBH, bem como em pacientes com outras doenças hepáticas e não-hepáticas. Alguma desta reactividade detectada pode representar anticorpos para determinados antigénios citoplásmicos do hospedeiro.
Tem havido um certo número de NANBV candidatos Veja-se, por exemplo, os artigos de revisão de Prince (1983), Feinstone e Hoofnagle (1984), e Overby (1985, 1986, 1987) e o artigo de Iwarson (1987). Contudo, não existe prova de que qualquer destes candidatos represente o agente etiológico da
NANBH.
A procura de métodos específicos e sensíveis para o despiste e identificação de portadores do NANBV e de sangue, ou produtos do sangue, contaminados com o NANBV, é significativa. A hepatite pós-transfusionai (PTH) ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes submetidos a transfusões, e a NANBH é responsável por mais de 90% destes casos. 0 problema principal inerente a esta doença é a sua frequente evolução para a lesão crónica do figado (25-55%).
A assistência aos pacientes, assim como a prevenção da transmissão da NANBH pelo sangue ou produtos do sangue, ou por contacto pessoal intimo, requerem técnicas fiáveis de despiste, de diagnóstico e de prognóstico, para a detecção de ácidos nucleicos, antigénios e anticorpos relacionados com o NANBV. Adicionalmente, existe também a necessidade de encontrar vacinas e agentes imunoterapêuticos eficazes na prevenção e/ou tratamento da doença.
A requerente descobriu um novo virus, o virus da Hepatite C (HCV), que provou ser o principal agente etiológico da NANBH transmitida pelo sangue (BB-NANBH). 0 trabalho inicial da requerente, incluindo uma sequência genómica parcial do isolado-protótipo do HCV, CDC/HCV1 (também denominado HCV1), está descrito na publicação EPO no 318.216 (publicada em 31 de Maio de 1989), e na publicação PCT no WO 89/04669 (publicada em 1 de Junho de 1989). As exposições destes pedidos de patente, juntamente com quaisquer pedidos de patente norte-americanos correspondentes, são aqui incorporados para referência. Estes pedidos de patente ensinam, entre outros, métodos de DNA recombinante para clonagem e expressão de sequências do HCV, polipéptidos do HCV, técnicas de imunodiagnóstico do HCV, técnicas de diagnóstico por sonda do HCV, anticorpos anti-HCV, e métodos de isolamento de novas sequências do HCV, incluindo sequências de novos isolados do HCV.
Descrição do invento presente invento é baseado, em parte, em novas sequências e polipéptidos de HCV que não são expostos na publicação EPO no 318.216, ou na publicação PCT no WO 89/04669. Neste invento é incluida a aplicação destas novas sequências e polipéptidos em, entre outros, imunodiagnósticos, diagnósticos por sonda, produção de anticorpos anti-HCV, tecnologia de PCR e tecnologia do DNA recombinante. Estão igualmente incluídos neste invento novos imunoensaios baseados na imunogenicidade dos polipéptidos de HCV aqui expostos. 0 ο
novo assunto aqui reivindicado, embora desenvolvido através do uso dos métodos descritos em, por exemplo, a publicação EPO no
318.216, tem uma data de prioridade que antecede essa publicação, ou qualquer sua parte componente. Assim, o invento proporciona novas composições e métodos úteis para o despiste de amostras quanto aos antigénios e anticorpos de HCV, e úteis para o tratamento de infecções pelo HCV.
Assim, um aspecto do invento consiste num polinucleótido recombinante compreendendo uma sequência derivada do cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV se encontra no clone 13i, ou no clone 26 j, ou no clone 59a, ou no clone 84a, ou no clone CA156e, ou no clone 167b, ou no clone pil4a, ou no clone CA216a, ou no clone CA290a, ou no clone ag30a, ou no clone 205a, ou no clone 18g, ou no clone 16jh, ou em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Figura 17.
Outro aspecto do invento consiste num polipéptido purificado compreendendo um epitopo codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17.
Ainda outro aspecto do invento consiste num polipéptido imunogénico produzido por uma célula transformada por um vector recombinante de expressão, compreendendo um ORF de DNA derivado do cDNA de HCV, em que o cDNA do HCV é composto por uma sequência derivada da sequência do cDNA de HCV do clone CA279a, ou clone CA74a, ou clone 13i, ou clone CA290a, ou clone 33c ou clone 40b, ou clone 33b, ou clone 25c, ou clone 14c, ou clone 8f, ou clone 33f, ou clone 33g, ou clone 39c, ou clone 15e, e em que o ORF está ligado de forma operável a uma sequência de controlo compatível com um hospedeiro desejado.
Outro aspecto do invento consiste num péptido compreendendo um epitopo do HCV, em que o péptido possui a fórmula:
AAjç — AAy , em que x e y designam números de aminoácidos mostrados na Fig. 17, e em que o péptido é seleccionado a partir do grupo consistindo em
AA1-AA25, AA1-AA50, AA1-AA84, AA9-AA177,
AAl-AAl0, AA5-AA20, AA20-AA25, AA35-AA45, AA50-AA100, AA40-AA90, AA45-AA65, AA65-AA75, AA80-90, AA99-AA120, AA95-AA110, AA105-AA120, AA100-AA150, AA150-AA200, AA155-AA17Q, AA190-AA210, AA200-AA250, AA220-AA240, AA245-AA265, AA250-AA300, AA290-AA330, AA290-305, AA300-AA350, AA310-AA330, AA350-AA400, AA380-AA395, AA405-AA495, AA400-AA450, AA405-AA415, AA415-AA425, AA425-AA435, AA437-AA582, AA450-AA500, AA440-AA460, AA460-AA470, AA475-AA495, AA500-AA550, AA511-AA690, AA515AA550, AA550-AA600, AA550-AA625, AA575-AA605, AA585-AA600, AA600-AA650, AA600-AA625, AA635-AA665, AA650-AA700, AA645-AA680, AA700-AA750, AA700-AA725, AA700-AA750, AA725-AA775, AA770-AA790, AA750-AA800, AA800-AA815, AA825-AA850, AA850-AA875, AA800-AA850, AA920-AA990, AA850-AA900, AA920-AA945, AA940-AA965, AA970-AA990, AA950-AA1000, AA1000-AA1060, AA1000-AA1025, AA1000-AA1050, AA1025--AA1040, AA1040-AA1055 , AA1075-AA1175,
AA1050-AA1200, AA1070-AA1100, AAl100-AA1130,
AA1140-AA1165, AA1192-AA1457, AA1195-AA1250,
Ir
AA1200
AA1260
AA1300
AA1405
AA1380
AA1460
AA1500
AA1550
AA1570
AA1610
AA1689
AA1720
AA1775
AA1900
AA1920
AA1950
AA2005
AA2045
AA2100
AA2200
AA2265
AA2300
AA2330
AA2345
AA2371
AA2415·
AA2470·
AA2535·
AA2600AA2640·
AA2670·
AA2750AA2780M2810-AA1225,
-AA1310,
-AA1350, , AA1345·
-AA1405,
-AA1475,
-AA1550,
-AA1600,
-AA1590,
-AA1645,
-AA1805,
-AA1745,
-AA1810,
-AA1950,
-AA1940,
-AA1985,
-ΑΑ2025,
-ΑΑ2070,
-ΑΑ2150,
-ΑΑ2325,
-ΑΑ2280,
-ΑΑ2350,
-ΑΑ2350,
-ΑΑ2415,
-ΑΑ2502,
-ΑΑ2450,
-ΑΑ2490,
-ΑΑ2560,
-ΑΑ2650,
-ΑΑ2660,
-ΑΑ2700,
-ΑΑ2800,
-ΑΑ2830,
-ΑΑ2825,
ΑΑ1225
ΑΑ1260
ΑΑ1290
-ΑΑ1365
ΑΑ1400
ΑΑ1475
ΑΑ1500
ΑΑ1545
ΑΑ1595
ΑΑ1650
ΑΑ1690
ΑΑ1745
ΑΑ1795
ΑΑ1900
ΑΑ1949
ΑΑ1980
ΑΑ2020
ΑΑ2054
ΑΑ2150
ΑΑ2250
ΑΑ2280
ΑΑ2290
ΑΑ2350
ΑΑ2345
ΑΑ2400
ΑΑ2445
ΑΑ2500
ΑΑ2550
ΑΑ2605'
ΑΑ2650
ΑΑ2700·
ΑΑ2755·
ΑΑ2785·
ΑΑ2800·
-ΑΑ1250,
-ΑΑ1280,
-ΑΑ1310, , ΑΑ1350
-ΑΑ1450,
-ΑΑ1515,
-ΑΑ1515,
-AA156Q,
-ΑΑ1610,
-ΑΑ1690,
-ΑΑ1720,
-ΑΑ1770,
-ΑΑ1850,
-ΑΑ1920,
-ΑΑ2124,
-ΑΑ2000,
-ΑΑ2045,
-ΑΑ2223,
-ΑΑ2200,
-ΑΑ2330,
-ΑΑ2290,
-ΑΑ2310,
-ΑΑ2400,
-ΑΑ2375,
-ΑΑ2450,
-ΑΑ2500,
-ΑΑ2550,
-ΑΑ2600,
-ΑΑ2620,
-ΑΑ2700,
-ΑΑ2750,
-ΑΑ2780,
-ΑΑ2810,
-ΑΑ2850,
ΑΑ1250-ΑΑ1300, ΑΑ1266-ΑΑ1428, ΑΑ1310-ΑΑ1340, ΑΑ1345-ΑΑ1400, ΑΑ1365-ΑΑ1380, ΑΑ1450-ΑΑ1500, ΑΑ1475-ΑΑ1500, ΑΑ1515-ΑΑ1550, ΑΑ1569-ΑΑ1931, ΑΑ1590-ΑΑ1650, ΑΑ1685-ΑΑ1770, ΑΑ1694-ΑΑ1735, ΑΑ1750-ΑΑ1800, ΑΑ1850-ΑΑ1900, ΑΑ1916-ΑΑ2021, ΑΑ1950-ΑΑ2000, ΑΑ2000-ΑΑ2050 , ΑΑ2045-ΑΑ2100, ΑΑ2070-ΑΑ2100, ΑΑ2200-ΑΑ2250, ΑΑ2255-ΑΑ2270, ΑΑ2287-ΑΑ2385, ΑΑ2310-ΑΑ2330, ΑΑ2348-ΑΑ2464, ΑΑ2370-ΑΑ2410, ΑΑ2400-ΑΑ2425, ΑΑ2445-ΆΑ2475, ΑΑ2505-ΑΑ2540, ΑΑ2560-ΑΑ2580, ΑΑ2620-ΑΑ2650, ΑΑ2655-ΑΑ2670 ,
ΑΑ2740-ΑΑ276Q,
ΑΑ2796-ΑΑ2886, ΑΑ2850-ΑΑ2900,
ΑΑ2850-ΑΑ2865, ΑΑ2885-ΑΑ2905, ΑΑ2900-ΑΑ2950,
AA2910-AA293Q, ΑΑ2925-ΑΑ2950, ΑΑ2945-extremidade (C' terminal).
Ainda outro aspecto do invento consiste num anticorpo monoclonal dirigido contra um epitopo codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos do -319 a 1348 ou do 8659 ao 8866 na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone 13i, ou clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CAl56e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh.
Ainda outro aspecto do invento consiste na preparação de anticorpos policlonais purificados dirigidos contra um polipéptido composto por um epitopo codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866 na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone 13i, ou clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CA 156e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh.
Ainda outro aspecto do invento consiste numa sonda polinucleotidica para o HCV, em que a sonda é composta por uma sequência de HCV derivada de uma sequência de cDNA do HCV indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866 na Fig. 17, ou derivada da sequência complementar à do cDNA do HCV.
Ainda outro aspecto do invento consiste num kit para a análise de amostras quanto à presença de polinucleótidos do HCV, compreendendo uma sonda polinucleotidica que contém uma sequência nucleotidica de cerca de 8, ou mais, nucleótidos, em que a sequência nucleotidica é derivada do cDNA do HCV que possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866 na Fig. 17, em que a sonda polinucleotidica se encontra num recipiente adequado.
Outro aspecto do invento consiste num kit para a análise de amostras quanto à presença de um antigénio do HCV, compreendendo um anticorpo que reage imunologicamente com um antigénio do HCV, em que o antigénio contém um epitopo codificado no cDNA do HCV que possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na
Fig. 17, ou em que o cDNA do HCV se encontra no clone 13i, ou ι
clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CAl56e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh.
Ainda outro aspecto do invento consiste num kit para a análise de amostras quanto à presença de um anticorpo do HCV, compreendendo um polipéptido antigénico contendo um epitopo do HCV codificado no cDNA do HCV que possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, ou se encontra no clone 13i, ou clone ) 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CA156e, ou clone
167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh.
Outro aspecto do invento consiste num kit para a análise de amostras quanto à presença de um anticorpo do HCV, compreendendo um polipéptido antigénico expresso a partir do cDNA do HCV que se encontra no clone CA279a, ou clone CA74a, ou clone 13i, ou clone Ca290a, ou clone 33c ou clone 40b, ou clone 33b, ou clone 25c, ou clone 14c, ou clone 8f, ou clone em que o
33f, ou clone 33g, ou clone 39c, ou clone 15e, polipéptido antigênico está presente num recipiente adequado.
Ainda outro aspecto do invento é um método para detectar ácidos nucleicos do HCV numa amostra, compreendendo:
(a) a reacção dos ácidos nucleicos da amostra com uma sonda polinucleotidica para o HCV, em que a sonda é composta por uma sequência de HCV derivada de um cDNA do HCV com uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, e em que a reacção se passa sob condições que permitem a formação de um duplex polinucleotidico entre a sonda e o ácido nucleico do HCV proveniente da amostra; e (b) a detecção de um duplex polinucleotidico que contém a sonda, formado no passo (a).
Ainda outro aspecto do invento consiste num imunoensaio para a detecção de um antigénio do HCV, compreendendo:
(a) a incubação de uma amostra suspeita de conter um antigénio do HCV com um anticorpo dirigido contra um epitopo do HCV, codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone 13i, ou no clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CA156e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh, e em que a incubação decorre sob condições que permitem a formação de um complexo antigénio-anticorpo; e (b) a detecção de um complexo antigénio-anticorpo formado no passo (a), que contém o anticorpo.
Ainda outro aspecto do invento consiste num imunoensaio para a detecção de anticorpos dirigidos contra um antigénio do HCV, compreendendo:
(a) a incubação de uma amostra suspeita de conter anticorpos anti-HCV com um polipéptido antigénico contendo um epitopo codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone 13i, ou clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CA156e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16 jh, e em que a incubação decorre sob condições que permitem a formação de um complexo antigénio-anticorpo; e a detecção de um complexo antigénio-anticorpo, formado no passo (a), que contém o polipéptido antigénico.
Outro aspecto do invento consiste numa vacina para o tratamento da infecçâo por HCV, compreendendo um polipéptido imunogénico contendo um epitopo do HCV codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone 13i, ou clone 26j, ou clone 59a, ou clone 84a, ou clone CA156e, ou clone 167b, ou clone pil4a, ou clone CA216a, ou clone CA290a, ou clone ag30a, ou clone 205a, ou clone 18g, ou clone 16jh, e em que o polipéptido imunogénico está presente numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.
Ainda outro aspecto do invento é um método para a
produção de anticorpos contra o HCV, compreendendo a administração, a um individuo, de um polipéptido imunogénico isolado contendo um epitopo do HCV codificado no cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV possui uma sequência indicada pelos números de nucleótidos -319 a 1348 ou 8659 a 8866, na Fig. 17, ou a sequência está presente no clone CA279a, ou clone CA74a, ou clone 13i, ou clone CA290a, ou clone 33c ou clone 40b, ou clone 33b, ou clone 25c, ou clone 14c, ou clone 8f, ou clone 33f, ou clone 33g, ou clone 39c, ou clone 15e, e em que o polipéptido imunogénico está presente numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.
Ainda outro aspecto do invento consiste num polinucleótido anti-sentido derivado do cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é o mostrado na Fig. 17.
Ainda outro aspecto do invento consiste num método para a preparação do polipéptido de fusão C100-3, purificado, compreendendo:
(a) a obtenção de um lisado de células, não tratado, contendo o polipéptido C100-3, (b) o tratamento do lisado de células, não tratado, com uma quantidade de acetona que causa a precipitação do polipéptido, (c) o isolamento e solubilização do material precipitado, (d) cromatografia (e) o isolamento do polipéptido C100-3 por de troca aniónica, e o isolamento mais completo do polipéptido C100-3 fí obtido no passo (d), por filtração em gel.
Breve descrição das figuras
A Figura 1 mostra a sequência do cDNA do HCV no clone 12f, e os aminoácidos ai codificados.
A Figura 2 mostra a sequência do cDNA do HCV no clone k9-l, e os aminoácidos ai codificados.
A Figura 3 mostra a sequência do clone 15e, e os aminoácidos ai codificados.
A Figura 4 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone 13i, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem ao clone 12f.
A Figura 5 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone 26j , a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem ao clone 13i.
A Figura 6 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA59a, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem aos clones 26j e
K9-1.
A Figura 7 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA84a, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem ao clone CA59a.
A Figura 8 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA156e, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem ao clone CA84a.
A Figura 9 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CAI67b, a sequência de aminoácidos ai codificada, e as sequências que se sobrepõem ao clone CAl56e.
A Figura 10 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA216a, os aminoácidos ai codificados, e a sobreposição com o clone CAl67b.
A Figura 11 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA290a, os aminoácidos ai codificados, e a sobreposição com o clone CA216a.
A Figura 12 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone ag30a, e a sobreposição com o clone CA290a.
A Figura 13 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone CA205a, e a sobreposição com a sequência de cDNA do HCV no clone CA290a.
A Figura 14 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone 18g, e a sobreposição com a sequência de cDNA do HCV no clone ag30a.
A Figura 15 mostra a sequência nucleotídica do cDNA do HCV no clone 16 jh, os aminoácidos ai codificados, e a sobreposição dos nucleôtidos com a sequência de cDNA do HCV no clone 15e.
A Figura 16 mostra o ORF do cDNA do HCV derivado dos clones pil4a, CAl67b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, e 15e.
A Figura 17 mostra a cadeia com sentido da sequência de cDNA de HCV, derivada dos clones acima descritos, e a sequência compilada de cDNA de HCV publicada na publicação da EPO no 318.216. Os clones a partir dos quais a sequência foi derivada são bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (também designado k9-l),
26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a, e 16jh. Na figura, os três traços horizontais por cima da sequência indicam a posição do suposto codâo iniciador de metionina; os dois traços verticais indicam o primeiro e último nucleõtidos da sequência publicada. Também se encontra mostrada na figura a sequência de aminoácidos da suposta poliproteina codificada no cDNA do HCV.
A Figura 18 é um diagrama do método de pesquisa imunológica de colónias utilizado em estudos de mapeamento antigénico.
A Figura 19 mostra os perfis de hidrofobicidade de poliproteinas codificadas no HCV e no virus West Nile.
A Figura 20 é uma representação do perfil de hidrofilicidade/hidrofobicidade e do indice antigénico da suposta poliproteina de HCV.
A Figura 21 mostra os péptidos co-lineares conservados no HCV e Flavivirus.
Modos de realização do invento
I. Definições termo virus da hepatite C foi reservado por técnicos no campo para um agente etiológico, desconhecido até à data, da NANBH. Assim, o termo virus da hepatite C (HCV), tal como aqui é usado, refere-se a um agente causador da NANBH, que foi primeiramente referido como NANBV e/ou BBNANBV. Os termos HCV, NANBV, e BB-NANBV são aqui usados indiferentemente. Como extensão desta terminologia, a doença causada por HCV, primeiramente designada hepatite NANB (NANBH), é designada hepatite C. Os termos NANBH e hepatite C podem ser aqui usados indiferentemente.
termo HCV, tal como aqui é usado, designa uma espécie virai da qual estirpes patogénicas causam a NANBH, e designa estirpes atenuadas e partículas defectivas interferentes dela derivadas. Tal como a seguir se mostra, o genoma do HCV consiste em RNA. Sabe-se que os RNA contendo virus têm taxas de mutação espontânea relativamente elevadas,
-3 -4
i.e., referidos como na ordem dos 10 a 10 , por nucleótido incorporado, (Fields e Knipe (1986). Portanto, existem múltiplas estirpes, dentro da espécie HCV a seguir descrita, que podem ser virulentas ou não-virulentas. As composições e métodos aqui descritas, permitem a propagação, identificação, detecção e isolamento das várias estirpes, ou isolados, de HCV. Para além disso, a descrição aqui feita permite a preparação de métodos de diagnóstico e vacinas para as diversas estirpes, bem como composições e métodos que têm utilidade em procedimentos de pesquisa para identificação de agentes anti-virais, para uso farmacológico, tal como agentes que inibem a replicação do HCV.
A informação aqui fornecida, apesar de derivada de uma espécie, ou isolado, protótipo do HCV, daqui em diante referida como CDC/HCV1 (também designada HCV1), é suficiente para permitir a um taxonomista virai identificar outras estirpes que pertençam a esta espécie. A informação aqui fornecida permite crer que o HCV é um virus semelhante aos
II
Flavivirus. Α morfologia e composição de partículas de Flavivirus são conhecidas, e estão discutidas em Brinton (1986). Geralmente, no que respeita à morfologia, os Flavivirus contém uma nucleocápside central circundada por uma bicamada lipidica. Os viriões são esféricos e têm um diâmetro de cerca de 40-50 nm. Os seus cores têm um diâmetro de cerca de 25-30 nm. Ao longo da superfície exterior do invólucro do viriâo existem projecções com um comprimento de cerca de 5-10 nm, com proeminências terminais com um diâmetro de cerca de nm.
Espera-se que diferentes estirpes ou isolados de HCV contenham variações nas sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos, comparadas com o protótipo isolado, HCV1. Espera-se que muitos isolados apresentem uma homologia elevada (i.e., mais do que cerca de 40%) na sequência total de aminoácidos, comparados com o HCV1. Contudo, também podem ser encontrados isolados menos homólogos de HCV. Estes seriam definidos como estirpes de HCV, de acordo com vários critérios, tal como um ORF de aproximadamente 9.000 nucleótidos a aproximadamente 12.000 nucleótidos, codificando para uma poliproteina com tamanho semelhante à do HCV1, uma poliproteina codificada com carácter hidrofóbico e antigénico semelhante ao HCV1, e a presença de sequências co-lineares de péptidos que são conservadas no HCV1. Adicionalmente, o genoma seria um RNA de cadeia positiva.
HCV codifica pelo menos um epitopo que é imunologicamente identificável com um epitopo no genoma do HCV a partir do qual os cDNAs aqui descritos são derivados; de preferência, o epitopo está contido numa sequência de aminoácidos aqui incluida. 0 epitopo é exclusivo do HCV, quando comparado com outros Flavivirus conhecidos. A exclusividade do epitopo pode ser determinada através da sua reactividade imunológica a anticorpos anti-HCV e ausência de reactividade imunológica a anticorpos de outras espécies de Flavivirus. Os métodos para determinar a reactividade imunológica são conhecidos dos especialistas, por exemplo, através de radioimunoensaio, ELISA, hemaglutinação, e diversos exemplos de técnicas adequadas para ensaios são aqui descritas.
Adicionalmente, são aplicáveis, em conjunto ou isoladamente, os seguintes parâmetros de homologia de ácidos nucleicos e homologia de aminoácidos, para identificar uma cadeia ou isolado como HCV. Como as cadeias e isolados de HCV estão relacionados evolutivamente, espera-se que a homologia global dos genomas, ao nivel nucleotidico, seja provavelmente cerca de 40% ou superior, provavelmente cerca de 60% ou superior, e ainda mais provavelmente, cerca de 80% ou superior; adicionalmente, espera-se que existam sequências contíguas correspondentes, com pelo menos cerca de 13 nucleótidos. As correspondências entre a suposta sequência genómica de cadeia de HCV e a sequência de cDNA de CDC/HCV1 podem ser determinada por técnicas conhecidas pelos peritos. Por exemplo, podem ser determinadas por comparação directa da sequência de informação do polinucleótido do suposto HCV, com as sequências de cDNA de HCV aqui descritas. Também podem ser deeterminadas, por exemplo, através da hibridizaçõ dos polinucleótidos em condiçOes tais que formem duplexes estáveis entre regiões homólogas (por exemplo, as que seriam usadas antes da digestão S^), seguidas por digestão com nuclease(s) especifica(s) de cadeia simples, e seguida por determinação do tamanho dos fragmentos digeridos.
Devido à relação evolucionária das cadeias ou isolados de HCV, as supostas cadeias ou isolados de HCV podem ser identificadas pela sua homologia no nivel polipeptidico. Geralmente, espera-se que as cadeias ou isolados de HCV sejam mais do que cerca de 40% homólogos, provavelmente mais do que 70% homólogos, e ainda mais do que 80% homólogos, e alguns podem ainda ser mais do que 90% homólogos, no nivel polipeptidico. As técnicas para determinar a homologia da sequência de aminoácidos são conhecidas pelos especialistas. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser determinada directamente e comparada com as sequências aqui fornecidas. Alternativamente, a sequência de nucleótidos do material genómico do suposto HCV pode ser determinada (usualmente através de um cDNA intermediário), a sequência de aminoácidos ai codificada pode ser determinada, e as regiões correspondentes podem ser comparadas.
Tal como aqui usado, o termo polinucleótido derivado de uma designada sequência refere-se a uma sequência polinucleotidica que é compreendida por uma sequência de aproximadamente pelo menos 6 nucleótidos, preferivelmente pelo menos cerca de 8 nucleótidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 a 12 nucleótidos, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 15 a 20 nucleótidos correspondendo a uma região da sequência nucleótídica designada. 0 termo correspondendo tem o significado de homólogo, ou complementar, da sequência designada. De preferência, a sequência da região a partir da qual o polinucleótido é derivado é homóloga ou complementar de uma sequência que é exclusiva para um genoma do HCV. 0 facto da sequência ser ou não exclusiva do genoma do HCV pode ser determinada por técnicas conhecidas pelos especialistas. Por exemplo, a sequência pode ser comparada com sequências em bancos de dados, por ex., Genebank, para determinar se está presente no hospedeiro não infectado ou outros organismos. A sequência também pode ser comparada com sequências conhecidas de outros agentes virais, incluindo os que são conhecidos como indutores da hepatite, por ex. , HAV, HBV, e HDV, e comparada com outros membros da familia Flaviviridae. A correspondência ou não-correspondência da sequência derivada com outras sequências também pode ser determinada por hibridização sob condições restringentes apropriadas. As técnicas de hibridização para determinar a complementaridade das sequências de ácidos nucleicos são conhecidas pelos especialistas, e serão adiante discutidas. Veja-se, por exemplo, Maniatis et al. (1982). Adicionalmente, as zonas de homologia imperfeita nos polinucleótidos duplex formados por hibridização podem ser determinadas por técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo, digestão com uma nuclease como a S^, que digere especificamente áreas de cadeia simples em polinucleótidos duplex. Regiões a partir das quais podem ser derivadas sequências tipicas de DNA incluem, de forma não limitativa, por exemplo, regiões codificando para epitopos específicos, bem como regiões não-transcritas e nâotraduzidas.
polinucleótido derivado não é necessariamente derivado fisicamente da sequência nucleotidica mostrada, podendo ser gerado de qualquer forma, incluindo, por exemplo, síntese quimica, ou replicação de DNA, ou transcrição reversa ou transcrição. Adicionalmente, combinações de regiões correspondentes à região da sequência designada podem ser modificadas de formas conhecidas pelos especialistas como sendo consistentes com uma utilização pretendida.
Do mesmo modo, uma sequência de polipéptidos ou aminoácidos derivada de uma designada sequência de ácidos nucleicos refere-se a um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos idêntica à do polipéptido codificado na sequência, ou a uma sua porção, em que a porção consiste de pelo menos 3 a 5 aminoácidos, e mais preferivelmente pelo menos 8 a 10 aminoácidos, e ainda mais preferivelmente pelo menos 11 a 15 aminoácidos, ou refere-se a um polipéptido que é imunologicamente identificável com um polipéptido codificado na sequência.
Um polipéptido recombinante ou derivado não é necessariamente traduzido de uma designada sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, as sequências de cDNA do HCV aqui descritas, ou de um genoma de HCV; pode ser gerado por qualquer forma, incluindo, por exemplo, sintese quimica, ou expressão de um sistema de expressão recombinante, ou isolamento a partir de um mutante de HCV. Um polipéptido recombinante ou derivado pode incluir na sua sequência um ou mais análogos de aminoácidos, ou aminoácidos não-naturais. Métodos de inserção de análogos de aminoácidos numa sequência são conhecidos dos especialistas. Também pode incluir um ou mais marcadores que são conhecidos pelos especialistas.
O termo polinucleótido recombinante, tal como aqui usado, significa um polinucleótido de origem genómica, cDNA, semi-sintética, ou sintética, o qual, devido à sua origem ou manipulação, que: (1) não está associado, total ou parcialmente, com um polinucleótido com o qual esteja associado na natureza, (2) está ligado a um polinucleótido distinto do que está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza.
termo polinucleótido, tal como aqui usado, refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos, com qualquer tamanho, quer de ribonucleótidos, quer de desoxiribonucleótidos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui DNA de cadeia dupla e de cadeia simples, bem como RNA de cadeia dupla e de cadeia simples. Também inclui tipos conhecidos de modificações, por exemplo, marcadores, que são conhecidos pelos especialistas, metilaçâo, caps, substituição de um. ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter-nucleótidos, tal como, por exemplo, as com ligações não carregadas (por ex., fosfonatos de metil, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por ex., fosfotioatos, fosfoditioatos, etc.), as que contêm porções destacadas da molécula tal como, por exemplo, proteínas (incluindo, por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-lisina, etc.), as com substâncias intercaladoras (por ex., acridina, psoralen, etc.), as que contêm quelantes (e.g., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), as contendo alquiladores, as com ligações modificadas (por ex., ácidos nucleicos alfa anomêricos, etc.), bem como formas não modificadas do polinucleótido.
termo polinucleótido virai purificado refere-se a um genoma de HCV, ou fragmento deste, que é essencialmente livre, i.e., contém menos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 70% e, ainda mais preferencialmente, menos de cerca de 90% de polipéptidos com os quais o polinucleótido virai está naturalmente associado. Técnicas para purificação de polinucleótidos virais, a partir de partículas virais são conhecidas pelos especialistas, e incluem, por exemplo, ruptura da partícula com um agente caotrópico , extracção diferencial e separação do(s) polinucleótido(s) e polipéptidos por cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade, e sedimentação de acordo com a densidade.
termo polipéptido virai purificado refere-se a um polipéptido de HCV, ou fragmento deste, que é essencialmente livre, i.e., que contém menos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 70% e, ainda mais preferencialmente, menos de cerca de 90% de componentes celulares com os quais o polipéptido virai está naturalmente associado. Técnicas para purificar polipéptidos virais são conhecidas pelos especialistas, e exemplos destas técnicas serão adiante discutidos. 0 termo polinucleótido virai purificado refere-se a um genoma de HCV, ou fragmento deste, que é essencialmente livre, i.e., contém menos de cerca de 20%, preferencialmente menos de cerca de 50% e, ainda mais preferencialmente, menos de cerca de 70% de polipéptidos com os quais o polinucleótido virai está naturalmente associado. Técnicas para purificar, a partir de partículas virais, polinucleótidos virais são conhecidas pelos especialistas, e incluem, por exemplo, ruptura da partícula com um agente caotrópico, e separação do(s) polinucleótido(s) e polipéptidos por cromatografia de permuta de iões, cromatografia de afinidade, e sedimentação de acordo com a densidade.
Os termos células hospedeiras recombinantes, células hospedeiras, células, linhas celulares, cultura de células, e outros termos que denotem microorganismos ou linhagens superiores de células eucariótidas cultivadas como entidades unicelulares, referem-se a células que podem ser, ou ter sido, usadas como receptoras para vectores recombinantes ou outros DNA de transferência, e incluem a descendência da célula original que foi transfectada. Entende-se ainda que a descendência de uma única célula progenitora pode não necessariamente ser completamente idêntica, em morfologia ou em complemento genómico ou DNA total, ao progenitor original, devido a mutação natural, acidental ou deliberada.
Um replicon ê qualquer elemento genético, e.g., um plasmídeo, um cromossoma, um virus, um cosmideo, etc. que se comporta como uma unidade autónoma de uma replicação de polinucleótido dentro duma célula; i.e., capaz de replicação sob o seu próprio controlo.
Um vector é um replicon ao qual está ligado outro segmento polinucleotidico, de modo a conseguir a replicação e/ou expressão do segmento ligado.
termo sequência de controlo refere-se a sequências polinucleotidicas que são necessárias para efectuar a expressão de sequências de codificação às quais estão ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere, dependendo do organismo hospedeiro; em procarióticos, tais sequências de controlo incluem geralmente um promotor, local de ligação ao ribossoma, e terminadores; em eucarióticos, tais sequências de controlo incluem geralmente promotores, terminadores e, em alguns casos, efectores positivos. 0 termo sequências de controlo pretende incluir, num minimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e pode também incluir componentes adicionais, cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências leader.
termo ligado operavelmente refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. Uma sequência de controlo, ligada operavelmente a uma sequência codificante, está ligada numa forma tal que a expressão da sequência codificante é conseguida sob condições compatíveis com as sequências de controlo.
Um molde aberto de leitura (ORF) é uma região de uma sequência polinucleotidica que codifica para um polipéptido; esta região pode representar uma porção, ou o total, de uma região codificante.
Uma sequência codificante é uma sequência polinucleotidica que é transcrita para mRNA e/ou traduzida num polipéptido, quando colocada sob controlo de regiões reguladoras apropriadas. Os limites da região codificante são determinados por um codão de inicio de tradução na extremidade 5' e um codão de fim de tradução na extremidade 3’. Uma sequência codificante pode incluir, de forma não limitativa, mRNA, cDNA, e sequências polinucleotidicas recombinantes.
termo imunologicamente identificável com/como refere-se à presença de epitopo(s) e polipétido(s) que estão também presentes nos polipéptidos designados, usualmente proteínas de HCV. A identidade imunológica pode ser determinada por ligação com anticorpos e/ou competição na ligação; estas técnicas são conhecidas pelo especialista médio, e encontram-se também a seguir descritas.
Tal como aqui usado, epitopo refere-se a um determinante antigénico de um polipéptido. Um epitopo pode compreender 3 aminoácidos numa conformação espacial que é única para o epitopo; geralmente, um epitopo consiste em pelo menos 5 desses aminoácidos, e mais usualmente, consiste em pelo menos 8 a 10 desses aminoácidos. Métodos para determinar a conformação espacial dos aminoácidos são conhecidos pelos especialistas, e incluem, por exemplo, cristalografia por raios-X, e ressonância magnética nuclear a duas dimensões.
Um polipéptido é imunologicamente reactivo com um anticorpo, quando se liga a um anticorpo em consequência do reconhecimento, por parte desse anticorpo, de um epitopo especifico contido no polipéptido. A reactividade imunológica mais pode ser determinada por ligação de anticorpo, particularmente pela cinética de ligação do anticorpo, e/ou por ligação competitiva, usando como competidor(es) um (uns) polipéptido(s) conhecido(s) contendo um epitopo contra o qual é dirigido o anticorpo. As técnicas usadas para determinar se um polipéptido é imunologicamente reactivo com um anticorpo são conhecidas da técnica.
Como aqui é usado, o termo polipéptido imunogénico corresponde a um polipéptido que provoca uma resposta celular e/ou humoral, quer isolado quer ligado a um veiculo na presença ou ausência de um adjuvante.
termo polipéptido refere-se a um polimero de aminoácidos e não se refere a um comprimento especifico do produto; assim, péptidos, oligopéptidos, e proteínas estão incluídos na definição de polipéptido. Este termo também não se refere, ou exclui, as modificações que o péptido sofre após a expressão, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e semelhantes. Incluidos nesta definição estão, por exemplo, polipéptidos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), polipéptidos com ligações substituídas, e outras modificações conhecidas da técnica, de ocorrência natural ou não natural.
No sentido em que é aqui usado, o termo transformação refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, introdução directa, transdução, inserção mediada pelo factor F, ou electroporaçâo.
polinucleótido exógeno pode ser mantido como um vector não integrado por exemplo, um plasmídeo, ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
termo tratamento, como aqui é usado, refere-se a profilaxia e/ou terapia.
Um individuo, como aqui é usado, refere-se a vertebrados, particularmente de espécies de mamíferos, e inclui, mas não está limitado a, animais domésticos, animais de desporto, e primatas, incluindo o homem.
Como aqui é usado, a cadeia de sentido de um ácido nucleico contém a sequência que tem homologia sequencial com a do mRNA. A cadeia anti-sentido contém uma sequência que é complementar da da cadeia de sentido.
Como aqui é usado, um genoma de cadeia positiva de um virus corresponde a um genoma, quer de RNA quer de DNA, de cadeia simples e codificando para um (uns) polipéptido(s) do virus. Exemplos de virus RNA de cadeia positiva incluem os Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, e Caliciviridae. Estão igualmente incluídos os Flaviviridae, que foram inicialmente classificados como Togaviridae (ver Fields & Knipe, 1986).
Como aqui é usado, o componente corporal contendo anticorpos refere-se a um componente do organismo de um individuo que constitui uma fonte dos anticorpos de interesse. Os componentes corporais contendo anticorpos são conhecidos da técnica, e incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, plasma, soro, liquido cefalo-raquidiano, linfa, as secções externas dos tractos respiratório, intestinal e
J genitourinário, lágrimas, saliva, leite, glóbulos brancos sanguíneos, e mielomas.
Como aqui é usado, o termo HCV purificado referese a uma preparação de HCV que foi isolada por separação dos constituintes celulares aos quais o virus se encontra normalmente associado, e de outros tipos de virus que podem estar presentes no tecido infectado. As técnicas de isolamento de virus são conhecidas dos peritos na técnica, e incluem, por exemplo, a centrifugação e a cromatografia de afinidade; é discutido mais adiante um método para a preparação de HCV purificado.
termo partículas de HCV, como aqui é usado, inclui o virião completo, assim como partículas que são intermediárias na formação do virião. As partículas de HCV possuem geralmemte uma ou mais proteínas do HCV associadas ao ácido nucleico do HCV.
Como aqui é usado, o termo sonda refere-se a um polinucleótido que forma uma estrutura hibrida com uma sequência numa região alvo, devido à complementaridade de, pelo menos, uma sequência da sonda com uma sequência na região alvo. A sonda não contém, no entanto, uma sequência complementar à(s) sequência(s) usada(s) para iniciar a reacção em cadeia por polimerase.
Como aqui é usado, o termo região alvo refere-se a uma região do ácido nucleico que se destina a ser amplificada e/ou detectada.
Como aqui é usado, o termo RNA virai, que inclui o
RNA do HCV, refere-se a RNA do genoma virai, seus fragmentos, seus produtos de transcrição, e sequências mutantes dele derivadas.
Como aqui é usado, uma amostra biológica refere-se a uma amostra de tecido ou fluido, isolado a partir de um indivíduo, incluindo mas não estando limitado a, por exemplo, plasma, soro, liquido cefalo-raquidiano, linfa, as secções externas da pele e dos tractos respiratório, intestinal e genitourinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, orgãos, e também amostras de constituintes de culturas celulares in vitro (incluindo, mas não estando limitado a, meio condicionado resultando do crescimento de células em meio de cultura celular, células supostamente infectadas por virus, células recombinantes, e componentes celulares).
II. Descrição do invento
A aplicação prática do presente invento empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais da biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que são conhecidas da técnica. Tais técnicas estão extensamente descritas na literatura. Ver, por ex., Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, volumes I e II (ed. D.N. Glover, 1985); OLYGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (ed. M.J. Gait, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (eds. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (eds. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); ANIMAL CELL CULTURE (ed. R.I. Freshney, 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A
PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); as séries, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (eds. J.H. Miller e M.P. Calos, 1987, Laboratório de Cold Spring Harbor), Methods in Enzymology, Vol. 154 e Vol. 155 (eds. Wu e Grossman, e Wu, respectivamente), eds. Mayer e Walker (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Segunda Edição (Springer-Verlag, N.Y.), e HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes I a IV (eds. D.M. Weir e C.C. Blackwell, 1986). Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações aqui mencionadas, tanto anteriormente como a seguir, são aqui incorporados para referência.
Os materiais e processos úteis do presente invento são viabilizados pelo fornecimento de uma familia de sequências nucleotidicas isoladas a partir de patrimónios (libraries) de cDNA que contêm sequências de cDNA do HCV. Estes patrimónios de cDNA derivaram de sequências de ácidos nucleicos que estão presentes no plasma de um chimpanzé infectado por HCV. A construção de um destes patrimónios, o património c (ATCC no 40394), foi referido na publicação EPO no 318.216. Vários dos clones contendo cDNA do HCV, aqui referidos, foram obtidos a partir do património c. Apesar de outros clones aqui referidos terem sido obtidos a partir de outros patrimónios de cDNA do HCV, foi confirmada a presença de clones contendo as sequências presentes no património ”c. Tal como discutido na publicação EPO no 318.216, a familia de sequências de cDNA do HCV, isoladas a partir do património *’tj= ® c, não é de origem humana ou de chimpanzé, e não evidencia uma homologia significativa relativamente a sequências contidas no genoma do HBV.
A disponibilidade dos cDNAs do HCV aqui descritos permite a construção de sondas polinucleotidicas que são reagentes úteis para a detecção de polinucleótidos virais em amostras biológicas, incluindo o sangue de dadores. Por exemplo, a partir destas sequências é possivel sintetizar oligómeros de DNA de cerca de 8 a 10 nucleótidos, ou maiores, que são úteis como sondas de hibridização para detectar a presença de RNA do HCV em, por exemplo, sangue de dadores, soros de indivíduos supostamente portadores do virus, ou sistemas de culturas celulares nos quais o virus se encontra em replicação. Adicionalmente, as sequências de cDNA permitem igualmente a concepção e a produção de polipéptidos específicos do HCV que são úteis como reagentes de diagnóstico da presença de anticorpos produzidos durante uma infecção por HCV. Podem também ser usados anticorpos dirigidos contra polipéptidos purificados derivados dos cDNAs, para detectar antigénios virais em amostras biológicas, incluindo, por exemplo, amostras de sangue de dadores, soros de doentes com NANBH, e em sistemas de cultura de tecidos que são usados na replicação do HCV. Adicionalmente, os polipéptidos imunogénicos aqui apresentados, que se encontram codificados em porções do ORF do cDNA do HCV que é apresentado da Fig. 17, são também úteis para despiste, diagnóstico e tratamento do HCV e para a produção de anticorpos que são igualmente úteis para estes fins.
Adicionalmente, os novas sequências de cDNA aqui descritas permitem uma caracterização mais completa do genoma do HCV. Podem usar-se sondas polinucleotidicas e iniciadores (primers) derivados destas sequências para a amplificação de sequências presentes em patrimónios de cDNA, e/ou para o despiste de patrimónios de cDNA quanto a sequências adicionais sobreponiveis de cDNA, que, por seu turno, podem ser usadas para obter mais sequências sobreponiveis. Como é indicado a seguir, e na publicação EPO no 318.216, o genoma do HCV parece corresponder a RNA compreendendo primariamente de um grande molde aberto de leitura (ORF), que codifica para uma grande poliproteina.
As sequências de cDNA do HCV aqui proporcionadas, os polipéptidos derivados destas sequências, e os polipéptidos imunogénicos aqui descritos, assim como anticorpos dirigidos contra estes polipéptidos, são também úteis no isolamento e identificação do(s) agente(s) do NANBV transmitido pelo sangue (BB-NANBV). Por exemplo, podem usar-se anticorpos dirigidos contra epitopos do HCV contidos em polipéptidos derivados dos cDNAs, em processos de isolamento do virus baseados em cromatografia de afinidade. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para identificar partículas virais isoladas por outras técnicas. Os antigénios virais e o material genómico, contidos nas partículas virais isoladas, podem então ser caracterizados mais profundamente.
Em adição ao acima descrito, a informação abaixo proporcionada permite a identificação de estirpes ou isolados adicionais do HCV. 0 isolamento e caracterização das estirpes ou isolados adicionais do HCV pode ser conseguida através do isolamento dos ácidos nucleicos a partir de componentes corporais que contêm partículas virais e/ou RNA virai, criando patrimónios de cDNA pelo uso de sondas polinucleotidicas baseadas nas sondas de cDNA do HCV abaixo descritas, fazendo a pesquisa, nos patrimónios, de clones contendo as sequências de cDNA do HCV abaixo descritas, e comparando os cDNA do HCV destes novos isolados com os cDNAs abaixo descritos. Os polipéptidos ai codificados, ou codificados no genoma virai, podem ser analisados quanto às reacções imunológicas cruzadas, utilizando os polipéptidos e anticorpos acima descritos. Estirpes ou isolados que se encontrem dentro dos parâmetros do HCV, como descrito na secção das Definições, supra, são facilmente identificáveis. Outros métodos de identificação de estirpes de HCV tornar-se-ão óbvios para os peritos na técnica, quando baseados na informação aqui proporcionada.
Isolamento de sequências de cDNA do HCV
As novas sequências de cDNA do HCV acima descritas estendem a sequência de cDNA do genoma do HCV descrita na publicação número 318.216 da EPO. As sequências que estão presentes nos clones bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, e CA59a estão a montante da sequência descrita e, quando compiladas, fornecem os nucleótidos números -319 a 1348 da sequência composta de cDNA do HCV. (0 número negativo num nucleótido indica a sua distância a jusante do nucleótido que inicia o suposto codão de iniciação MET). As sequências que estão presentes nos clones b5a e 16jh estão a jusante da sequência descrita, e fornecem os nucleótidos números 8659 a 8866 da sequência composta. A sequência composta de cDNA do HCV que inclui as sequências nos clones acima mencionados é mostrada na Figura
17.
Os novos cDNAs do HCV aqui descritos foram isolados de um número de patrimónios de cDNA de HCV, incluindo o património c presente no lambda gtll (ATCC no 40.394). Os patrimónios de cDNA do HCV foram construídos usando uma reserva de soros de um chimpanzé com infecção crónica por HCV £ e contendo um titulo elevado do virus, i.e., pelo menos 10 doses infecciosas de chimpanzé por ml (CID/ml) . 0 soro recolhido foi usado para isolar partículas virais; ácidos nucleicos isolados destas partículas foram usados como molde na construção de patrimónios de cDNA do genoma virai. Os procedimentos para isolar partículas do suposto HCV e para construir o património c do cDNA do HCV estão descritos na publicação número 318.216 da EPO. Outros métodos para construir patrimónios de cDNA do HCV são conhecidos da técnica, e alguns destes métodos serão a seguir descritos, nos Exemplos. 0 isolamento das sequências foi realizado por despiste dos patrimónios usando sondas polinucleotidicas sintéticas, cujas sequências foram derivadas da região 5' e da região 3' da sequência conhecida do cDNA do HCV. A descrição do método para reconstituir as sequências de cDNA tem sobretudo interesse histórico. As sequências resultantes (e seus complementos) são aqui fornecidas, e as sequências, ou qualquer porção destas, podem ser preparadas usando métodos de sintese, ou através de uma combinação de métodos de sintese, com recuperação de sequências parciais, usando métodos semelhantes aos métodos aqui descritos.
Preparação de polipéptidos e fragmentos virais
A disponibilidade de sequências de cDNA do HCV, ou de sequências dele derivadas, (incluindo segmentos e modificações da sequência), permite a construção de vectores de expressão que codificam regiões antigénicamente activas do polipéptido codificado em qualquer das cadeias. Estas regiões antigénicamente activas podem ser derivadas de antigénios do invólucro ou cápsula, ou de antigénios do core, ou de antigénios que são não-estruturais, incluindo, por exemplo, proteínas de ligação a polinucleótidos, polimerase(s) de polinucleótidos, e outras proteínas virais requeridas para a replicação e/ou estruturação da partícula virai. Os fragmentos codificando os polipéptidos desejados derivam dos clones de cDNA pelo uso de digestão convencional por enzimas de restrição ou por métodos sintéticos, e são ligados a vectores os quais podem, por exemplo, conter porções de sequências de fusão, como a beta-galactosidase ou superóxido dismutase (SOD), de preferência à SOD. Métodos e vectores que são úteis para a produção de polipéptidos que contêm sequências de fusão da SOD são descritos na publicação da European Patent Office no 0196056, publicada em 1 de Outubro de 1986. Os vectores para a expressão de polipéptidos de fusão da SOD e polipéptidos do HCV codificados em diversos clones de HCV são abaixo descritos, nos Exemplos. Qualquer porção desejada do cDNA do HCV contendo um molde aberto de leitura, numa cadeia de qualquer sentido, pode ser obtida na forma de um polipéptido recombinante, como uma proteina madura ou de fusão; alternativamente, um polipéptido codificado no cDNA pode ser fornecido por sintese quimica.
DNA codificando o polipéptido desejado, quer na forma de produto de fusão quer na forma madura, e contendo ou não uma sequência de sinal para permitir a secreção, pode ser ligado a vectores de expressão adequados a qualquer hospedeiro conveniente. Diversos sistemas de hospedeiros procarióticos e eucarióticos são actualmente usados na formação de polipéptidos recombinantes, e é abaixo fornecido um resumo de alguns dos mais comuns sistemas de controlo e linhas celulares hospedeiras. 0 polipéptido é, então, isolado a partir das células lisadas ou do meio de cultura e é purificado até ao grau requerido para o uso pretendido. A purificação pode ser feita por técnicas bem conhecidas, como por exemplo, extracção diferencial, fraccionamento salino, cromatografia em resinas de troca iónica, cromatografia de afinidade, centrifugação, e semelhantes. Ver, por exemplo, Methods in Enzymology para obter uma variedade de métodos de purificação de proteínas. Tais polipéptidos podem ser usados como meios de diagnóstico, ou aqueles que dão origem à produção de anticorpos neutralizantes podem ser formulados em vacinas. Os anticorpos produzidos contra estes polipéptidos podem ser igualmente usados como meios de diagnóstico, ou em imunoterapia passiva. Adicionalmente, como abaixo discutido, os anticorpos dirigidos contra estes polipéptidos são úteis no isolamento e identificação de partículas de HCV.
Preparação de polipéptidos antigénicos e conjugação com o veiculo
Uma região antigénica de um polipéptido é, de maneira geral, relativamente pequena - tipicamente de 8 a 10 aminoãcidos, ou menos, em comprimento. Uma região antigénica pode ser caracterizada por fragmentos de apenas 5 aminoãcidos. Estes segmentos podem corresponder a regiões de antigénio do HCV. Assim, usando os cDNAs de HCV como base, DNAs codificando para pequenos segmentos de polipéptidos do HCV podem ser recombinantemente expressos, tanto na forma de proteínas de fusão como na de polipéptidos isolados. Adicionalmente, pequenas sequências de aminoãcidos podem ser convenientemente obtidas por sintese quimica. Em casos nos quais o polipéptido sintetizado está correctamente configurado, de forma a proporcionar o epitopo correcto, mas é demasiado pequeno para ser imunogénico, o polipéptido pode ser ligado a um veiculo adequado.
São conhecidas da técnica diversas técnicas de obtenção de uma tal ligação, incluindo a formação de pontes dissulfito usando o N-succinimidil-3-(2-piridil-tio)propionato (SPDP) e o succinimidil-4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-lcarboxilato (SMCC), obtidos através da Pierce Company, Rockford, Illinois (se o péptido não possui um grupo sulfidrilo, este pode ser fornecido pela adição de um residuo de cisteina). Estes reagentes criam uma ligação dissulfito entre eles próprios e os residuos peptídicos de cisteina, numa das proteínas, e uma ligação amida, através do grupo amina em posição epsilon numa lisina (ou de outro grupo amina livre), na outra proteina. São conhecidos diversos destes agentes formadores de ligações dissulfito/amida. Ver, por exemplo, Immun. Rev. (1982) £2:185. Outros agentes bifuncionais de acoplamento formam uma ligação tioéter, no lugar de uma ligação dissulfito. Muitos destes agentes formadores de ligações tioéter estão comercialmente disponíveis e incluem ésteres reactivos do ácido 6-maleimidocapróico, ácido 2bromoacético, ácido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilico, e semelhantes. Os grupos carboxilo podem ser activados através da sua combinação com succinimida ou ácido l-hidroxil-2-nitro-4-sulfónico na forma de sal. Métodos adicionais de acoplamento de antigénios empregam o sistema rotavirus/péptido de ligação, descrito na publicação EPO no 259.149, cuja divulgação é aqui incorporada para referência. A lista que se segue não tenciona ser exaustiva, e podem ser claramente usadas modificações dos compostos citados.
Pode ser usado qualquer veiculo que não induza, por si só, a produção de anticorpos prejudiciais ao hospedeiro. Os veiculos adequados são usualmente macromoléculas grandes e lentamente metabolizadas, tais como proteínas; polissacáridos, tais como sefarose funcionalizada com látex, agarose, celulose, esferas de celulose e semelhantes; aminoácidos poliméricos, como o ácido poliglutâmico, polilisina, e semelhantes; copolímeros de aminoácidos; e partículas virais inactivas. Substratos proteicos particularmente úteis são as albuminas séricas, hemocianina de uma lapa da espécie Diodora italica, moléculas de imunoglobulinas, tiroglobulina, ovalbumina, toxóide tetânico, e outras proteínas bem conhecidas dos técnicos.
Em adição às proteínas virais completas, os polipéptidos compreendendo sequências truncadas de aminoácidos do HCV, que codificam pelo menos um epitopo virai, são reagentes imunológicos úteis. Por exemplo, os polipéptidos compreendendo tais sequências truncadas podem ser usados como reagentes num imunoensaio. Estes polipéptidos são também possíveis antigênios de subunidade para composições usadas na produção de antisoros ou vacinas. Se bem que estas sequências truncadas possam ser produzidas por diversos tratamentos conhecidos da proteina virai nativa, prefere-se geralmente fabricar polipéptidos sintéticos ou recombinantes compreendendo uma sequência do HCV. Os polipéptidos compreendendo estas sequências truncadas do HCV podem ser inteiramente compostos de sequências do HCV (um ou mais epitopos, contíguos ou não contíguos), ou de sequências do HCV reunidas a sequências heterólogas numa proteina de fusão. Sequências heterólogas úteis incluem sequências que proporcionam a secreção a partir de um hospedeiro recombinante, aumentam a reactividade imunológica do(s) epitopo(s) do HCV, ou facilitam o acoplamento do polipéptido a um suporte de imunoensaio ou a um veiculo de vacina. Ver, e.g., a publicação EPO no 116.201; a patente norte-americana no 4.722.840; a publicação EPO no 259.149; a patente norteamericana no 4.629.783, as quais são aqui incorporadas para referência.
tamanho dos polipéptidos compreendendo as sequências truncadas de HCV pode variar largamente, correspondendo o tamanho minimo a uma sequência de tamanho suficiente para proporcionar um epitopo do HCV, enquanto que o tamanho máximo não é critico. Por conveniência, o tamanho máximo nâo é, de maneira geral, substancialmente maior do que o requerido para proporcionar os epitopos do HCV, e a(s) função (funções) da sequência heteróloga (se esta existir), desejados. Tipicamente, a sequência truncada de aminoácidos do HCV terá um comprimento de desde cerca de 5 a cerca de 100 aminoácidos. Mais caracteristicamente, no entanto, a sequência de HCV terá um comprimento máximo de cerca de 50 aminoácidos, de preferência um máximo de cerca de 30 aminoácidos. E geralmente desejável seleccionar sequências de HCV de pelo menos cerca de 10, 12 ou 15 aminoácidos, até um máximo de cerca de 20 ou 25 aminoácidos.
As sequências truncadas de aminoácidos do HCV compreendendo epitopos podem ser identificadas por diversos meios. Por exemplo, pode ser pesquisada a sequência completa da proteina virai através da preparação de uma série de pequenos péptidos que abarcam, quando reunidos, a sequência proteica completa. Um exemplo de pesquisa antigénica das regiões da poliproteina do HCV é abaixo mostrada. Adicionalmente, começando por, por exemplo, polipéptidos de 100 aminoácidos, será uma questão de rotina a pesquisa, em cada polipéptido, da presença de epitopo(s) evidenciando uma reactividade desejada, e, de seguida, a pesquisa de fragmentos
sobreponiveis e progressivamente mais pequenos, pertencentes a um polipéptido de 100 aminoácidos, para fazer o mapeamento do epitopo de interesse. A pesquisa de tais péptidos num imunoensaio é conhecida da técnica. E também conhecida a análise por computador de uma sequência proteica de forma a identificar potenciais epitopos, e a preparação de oligopéptidos compreendendo as regiões identificadas através desta análise. Uma de tais análises por computador da sequência de aminoácidos do HCV é mostrada na Fig. 20, em que o carácter hidrofilico/hidrofóbico é apresentado acima do Índice antigénico. Os aminoácidos são numerados a partir do aminoácido inicial MET (posição 1), como mostra a Fig. 17. Será notado pelos técnicos que tal análise computadorizada da antigenicidade não identificará sempre um epitopo que exista na realidade, e poderá igualmente identificar incorrectamente uma região da proteina como contendo um epitopo.
Exemplos das sequências de aminoácidos do HCV que podem ser úteis, que são expressas através de vectores de expressão que consistem nos clones 5-1-1, 81, CA74a, 35f, 279a, C36, C33b, CA290a, C8f, C12f, 14c, 15e, C25c, C33c, C33f, 33g, C39c, C40b, CA167b são abaixo descritas. Outros exemplos de sequências de aminoácidos do HCV que podem ser úteis, como aqui descrito, são abaixo apresentadas. Deve compreender-se que estes péptidos não fazem necessariamente um mapeamento preciso de um epitopo, e podem, igualmente, conter uma sequência do HCV que não é imunogénica. Estas porções não imunogénicas da sequência podem ser definidas como descrito acima, usando técnicas convencionais, e ser retiradas das
sequências descritas. Além disto, sequências truncadas adicionais de aminoácidos do HCV que compreendam um epitopo, ou sejam imunogénicas, podem ser identificadas como acima descrito. As seguintes sequências são apresentadas segundo o número do aminoácido (i.e., AAn), em que n é o número do aminoácido, como mostra a Fig. 17:
AA1-AA25; AA1-AA50; AA1-AA84; AA9-AA177; AA1-AA10; AA5-AA20? AA20-AA25; AA35-AA45; AA50-AA100;
AA40-AA90; AA45-AA65; AA65-AA75; AA80-90; AA99-AA120; AA95-AA110; AA105-AA120; AA100-AA150? AA150-AA200? AA155-AA170; AA190-AA210; AA200-AA250; AA220-AA240;
AA245-AA265; AA250-AA300; AA290-AA330; AA290-305; AA300-AA350; AA310-AA330; AA350-AA400; AA380-AA395? AA405-AA495; AA400-AA450; AA405-AA415? AA415-AA425; AA425-AA435; AA437-AA582; AA450-AA5Q0; AA440-AA460; AA460-AA470; AA475-AA495; AA500-AA550; AA511-AA690; AA515-AA550; AA550-AA600; AA550-AA625; AA575-AA605; AA585-AA600; AA600-AA650; AA600-AA625; AA635-AA665; AA650-AA700; AA645-AA680; AA700-AA750; AA700-AA725; AA700-AA750; AA725-AA775? AA770-AA790; AA750-AA800; AA80Q-AA815; AA825-AA850; AA850-AA875; AA800-AA850; AA920-AA990? AA850-AA900; AA920-AA945; AA940-AA965; AA970-AA990? AA950-AA1000; AA1000-AA1060;
AA1000-AA1025; AA1000-AA1050; AA1025-AA1040; AA1040-AA1055; AA1075-AA1175; AA1050-AA1200; AA1070-AA1100; ΑΑ1100-ΑΑ113Ό; AAl140-AAl165;
AA1192-AA1457; AAl195-AA1250; AA1200-AA1225; AA1225-AA1250? AA1250-AA1300; AA1260-AA1310; AA1260-AA1280; AA1266-AA1428; AA1300-AA1350?
AAl290-AA1310; AAl310-AA1340? AA1345-AA1405; AA1345-AA1365; AA1350-AA1400; AA1365-AA1380; AA1380-AA1405; AA1400-AA1450; AA1450-AA15Q0; AA1460-AA1475; AA1475-AA1515; AA1475-AA1500; AA1500-AA1550; AA1500-AA1515; AA1515-AA1550; AA1550-AA1600? AA1545-AA1560: AA1569-AA1931:
____
ΕAA1570-AA1590? ΑΑ1610-ΑΑ1645; ΑΑ1689-ΑΑ1805; ΑΑ1720-ΑΑ1745? ΑΑ1775-ΑΑ1810; ΑΑ1900-ΑΑ1950; ΑΑ1920-ΑΑ1940; AA1950-AÀ1985? ΑΑ2005-ΑΑ2025? AA2045-AA2070? ΑΑ2100-ΑΑ2150; ΑΑ2200-ΑΑ2325; ΑΑ2265-ΑΑ2280; ΑΑ2300-ΑΑ2350; ΑΑ2330-ΑΑ2350; AA2345-AA2415? ΑΑ2371-ΑΑ2502 ; ΑΑ2415-ΑΑ2450; ΑΑ2470-ΑΑ2490; ΑΑ2535-ΑΑ2560; AA26Q0-AA2650; ΑΑ2640-ΑΑ2660; ΑΑ2670-ΑΑ2700; ΑΑ2750-ΑΑ28007 ΑΑ2780-ΑΑ28307 ΑΑ2810-ΑΑ2825; ΑΑ2850-ΑΑ2865;
ΑΑ1595-ΑΑ1610; AA1650-AA1690? ΑΑ1690-ΑΑ1720; ΑΑ1745-ΑΑ17707 ΑΑ1795-ΑΑ1850; ΑΑ1900-ΑΑ1920·,· ΑΑ1949-ΑΑ2124; ΑΑ1980-ΑΑ2000; AA2020-AA2045? ΑΑ2054-ΑΑ2223; ΑΑ2150-ΑΑ22007 ΑΑ2250-ΑΑ2330; ΑΑ2280-ΑΑ2290; ΑΑ2290-ΑΑ23107 ΑΑ2350-ΑΑ2400; ΑΑ2345-ΑΑ2375; ΑΑ2400-ΑΑ2450? ΑΑ2445-ΑΑ2500? ΑΑ2500-ΑΑ2550; ΑΑ2550-ΑΑ2600? ΑΑ2605-ΑΑ2620; ΑΑ2650-ΑΑ2700; ΑΑ2700-ΑΑ2750; ΑΑ2755-ΑΑ2780; ΑΑ2785-ΑΑ2810; ΑΑ2800-ΑΑ2850; ΑΑ2885-ΑΑ2905;
AA1590-AA1650? ΑΑ1685-ΑΑ1770; ΑΑ1694-ΑΑ1735; ΑΑ1750-ΑΑ1800; ΑΑ1850-ΑΑ1900; ΑΑ1916-ΑΑ2021? ΑΑ1950-ΑΑ2000; ΑΑ2000-ΑΑ2050; ΑΑ2045-ΑΑ21007 ΑΑ2070-ΑΑ2100; ΑΑ2200-ΑΑ2250; ΑΑ2255-ΑΑ2270; ΑΑ2287-ΑΑ2385; ΑΑ2310-ΑΑ2330; AA2348-AA2464? ΑΑ2370-ΑΑ2410; ΑΑ2400-ΑΑ2425; ΑΑ2445-ΑΑ2475; AA2505-AA2540? ΑΑ2560-ΑΑ2580; ΑΑ2620-ΑΑ2650; ΑΑ2655-ΑΑ2670; ΑΑ2740-ΑΑ2760;
AA2796-AA2886? ΑΑ2850-ΑΑ2900; ΑΑ2900-ΑΑ2950;
AA2910-AA2930? ΑΑ2925-ΑΑ2950; AA2945-Extremidade C’ -termi na 1
As sequências de aminoácidos do HCV, acima
4?' £
referidas, podem ser preparadas sob a forma de péptidos distintos, ou incorporados num polipéptido de maiores dimensões, e ser utilizadas do modo aqui descrito. Nos exemplos descrevem-se polipéptidos adicionais compreendendo sequências truncadas do HCV.
A relação observada entre as supostas poliproteinas do HCV e os Flavivirus permite alguma previsão acerca dos possíveis dominios das proteinas HCV não estruturais (NS). As localizações das proteinas NS individuais na suposta poliproteina precursora dos Flavivirus são relativamente bem conhecidas. Além do mais, estas localizações coincidem também com grandes flutuações no perfil de hidrofobicidade da poliproteina. Está estabelecido que NS5 dos Flavivirus codifica a polimerase do viriâo, e que NS1 corresponde a um antigénio de complemento de fixação que se demonstrou ser uma vacina eficaz em animais. Recentemente, demonstrou-se que uma função de protease flaviviral reside em NS3. Devido às semelhanças observadas entre o HCV e os Flavivirus, são possíveis deduções quanto às localizações aproximadas dos dominios proteicos correspondentes e funções na poliproteina HCV. A expressão de polipéptidos contendo estes dominios numa variedade de células hospedeiras recombinantes incluindo, por exemplo, bactérias, leveduras, células de insectos e de vertebrados, deverão originar importantes reagentes imunológicos que podem ser utilizados para diagnóstico, detecção e vacinas.
Apesar das regiões proteicas não-estruturais das poliproteinas supostas do extracto de HCV isolado, aqui descritas, e dos Flavivirus parecerem ser semelhantes, existe menos semelhança entre as supostas regiões estruturais mais próximas da extremidade N. Nesta região, existe uma maior divergência da sequência, e além disso, o perfil hidrofóbico das duas regiões apresenta menos semelhanças. Esta divergência começa na extremidade N do suposto dominio de NS1 em HCV, e prolonga-se até à suposta extremidade N. No entanto, pode ainda ser possivel prever as localizações aproximadas na poliproteina HCV do dominio da nucleocápside suposta (dominio básico da extremidade N) e do dominio E (geralmente hidrofóbico). Nos Exemplos, as previsões baseiamse nas alterações observadas no perfil hidrofóbico da poliproteina HCV, e num conhecimente da localização e carácter das proteinas flavivirais. A partir destas previsões é possivel identificar regiões aproximadas da poliproteina HCV que tenham correspondência com reagentes imunológicos de utilidade. Por exemplo, sabe-se que as proteinas E e NS1 dos Flavivirus têm eficácia como vacinas protectoras. Estas regiões, bem como algumas que se mostram ser antigénicas no isolado de HCV aqui descrito, por exemplo as que se encontram em NS3, C, NS5, etc, deverão também originar reagentes para diagnóstico. Além do mais, a localização e expressão de enzimas codificados por virus podem também permitir a avaliação de inibidores enzimáticos anti-virais, por exemplo, inibidores que impedem a actividade enzimática devido a uma interacção com o próprio enzima, ou substâncias que possam impedir a expressão do enzima (por exemplo, RNA anti-sentido, ou outras drogas que interfiram com a expressão).
Preparação de Partículas Híbridas de Imunogénios Contendo
Epitopos de HCV
A imunogenicidade dos epitopos de HCV pode também ser aumentada preparando-os em sistemas de mamíferos ou de leveduras, fundidos com ou adicionados a proteinas formadoras de partículas, tais como a associada ao antigénio de superfície da hepatite B. Construções em que o epitopo de NANBV está directamente ligado às sequências codificadoras das proteinas formadoras de partículas, produzem hibridos que são imunogénicos em relação ao epitopo HCV. Além disso, todos os vectores preparados incluem epitopos especificos para o HBV, havendo vários graus de imunogenicidade, como, por exemplo, o péptido pré-S. Assim, partículas construídas a partir de proteína formadora de partículas que incluam sequências HCV são imunogénicas quanto ao HCV e HBV.
Demonstrou-se que o antigénio de superfície da hepatite (HBSAg) se formava e agregava em partículas, tanto em S. cerevisiae (Valenzuela et al, 1982) como, por exemplo, em células de mamífero (Valenzuela, P., et al, 1984). Foi demonstrado que a formação dessas partículas levava a um aumento na imunogenicidade da subunidade monomérica. As construções podem ainda incluir o epitopo imunodominante de HBSAg, compreendendo os 55 aminoácidos da região présuperficie (pré-S) (Neurath at al, 1984). Contruções da partícula pre-S-HBSAg com expressão em leveduras são referidas na EPO 174,444, publicada em 19 de Março de 1986; hibridos incluindo sequências virais heterólogas para expressão em leveduras são referidos na EPO 175,261, publicada em 26 de
Março de 1966. Estas construções podem também ser expressas em células de mamífero, como as células de ovário de Hamster chinês (CHO), usando um vector SV40-dihidrofolato redutase (Michelle et al, 1984).
E ainda possivel substituir porções da sequência codificadora das proteínas formadoras de partículas, por codões codificando um epitopo HCV. Nesta substituição podem-se eliminar regiões que não são necessárias para mediar a agregação das unidades para formar partículas imunogénicas em leveduras ou mamíferos, eliminando-se assim a competição de sitios antigénicos HBV adicionais com o epitopo HCV.
Preparação de vacinas
Podem-se preparar vacinas a partir de um ou mais polipéptidos imunogénicos derivados a partir de cDNA de HCV, incluindo as sequências de cDNA descritas nos Exemplos. A homologia observada entre HCV e os Flavivirus proporciona informação respeitante aos polipéptidos que podem ser mais eficazes como vacinas, bem como as regiões do genoma em que estes estão codificados. A estrutura geral do genoma dos Flavivirus é discutida em Rice et al (1986). Pensa-se que o RNA genómico dos Flavivirus é a única espécie de mRNA especifico de virus, e que é traduzido em três proteínas estruturais do virus, C, M, e E, bem como em duas grandes proteínas não estruturais, NS4 e NS5, e complexo conjunto de proteínas não estruturais de dimensões mais reduzidas. Sabe-se que importantes epitopos neutralizantes para Flavovirus residem na proteina da membrana (proteina E) (Roehrig, 1986).
Portanto, podem-se constituir vacinas a partir de polipéptidos recombinantes contendo epitopos de HCV E. Estes polipéptidos podem ser expressos em bactérias, leveduras, ou células de mamífero, ou alternativamente ser isolados a partir de preparações virais. Prevê-se também que as outras proteinas estruturais possam também conter epitopos que dêem origem a anticorpos de protecção anti-HCV. Assim, polipéptidos contendo os epitopos de E, C e M podem também ser usados, quer simples quer combinados, em vacinas HCV.
Adicionalmente, mostrou-se que a imunização com NS1 (proteina não estrutural 1), resulta numa protecção contra a febre amarela (Schlesinger et al, 1986). Isto é verdade, embora a imunização não origine anticorpos neutralizantes. Assim, e particularmente porque esta proteina parece estar altamente conservada entre os Flavivirus, é provável que HCV NS1 confira também protecção contra infecção por HCV. Mais ainda, parece mostrar que proteinas não estruturais podem conferir protecção contra patogenicidade virai, mesmo que não causem a produção de anticorpos neutralizantes.
A informação fornecida nos Exemplos respeitante à imunogenicidade dos polipéptidos expressos a partir de cDNAs de HCV cionados que percorrem as várias regiões ORF do HCV também permite previsões quanto ao seu uso em vacinas.
Conclui-se, pelo que foi referido, que vacinas multivalentes contra o HCV podem ser constituídas por um ou mais epitopos de uma ou mais proteinas estruturais, e/ou um ou mais epitopos de uma ou mais proteinas não estruturais. Estas vacinas podem ser compostas, por exemplo, por polipéptidos de
HCV recombinantes, e/ou polipéptidos isolados a partir dos viriões. Em particular, está-se a considerar a constituição de vacinas que compreendam uma ou mais das seguintes proteinas de HCV, ou antigénios de subunidades delas derivados: E, NS1, C, NS2, NS3, NS4 e NS5. São preferíveis, particularmente, as vacinas que compreeendam a proteina E e/ou NS1, ou subnidades delas derivadas.
A preparação de vacinas que contenham um ou mais polipéptidos imunogénicos como ingredientes activos, é conhecida dos peritos na técnica. Estas vacinas são tipicamente preparadas sob a forma injectável, quer como soluções liquidas quer como suspensões; formas sólidas apropriadas para preparação de soluções em, ou suspensão num liquido imediatamente antes da injecção, podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada, ou a proteina encapsulada em lipossomas. Os ingredientes imunogénicos activos são frequentemente misturados com excipientes que são farmaceuticamente aceites e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou outros semelhantes e combinações entre eles. Adicionalmente, se for requerido, a vacina pode conter quantidades reduzidas de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponizantes do pH, e/ou adjuvantes que aumentem a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não estão limitados a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D55 polipépido de HCV, isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, referido como MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraidos de bactérias, monofosforil lipido A, dimicolato de trehalose e esqueleto de parede celular (MPL+TDM+CWS) numa emulsão a 2% de esqualeno/Tween 80. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada medindo a quantidade de anticorpos dirigida contra um imunogénico contendo uma sequência antigénica resultando da administração deste polipéptido em vacinas das quais façam também parte os vários adjuvantes.
As vacinas são convencionalmente administradas por via parentérica, por injecção, por exemplo, quer subcutânea quer intramuscular. Formulações adicionais que sejam adequadas para outros modos de administração incluem os supositórios, ou, nalguns casos, formulações para administração oral. Para supositórios, excipientes ou transportadores tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados por misturas contendo o ingrediente activo numa gama de 0.5% a 10%, de preferência de 1% a 2%. Formulações orais incluem excipientes normalmente empregues tais como, por exemplo, gradientes farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e similares. Estas composições têm a forma de soluções, suspensões, comprimidos, drageias, cápsulas, formulações de libertação controlada ou pós e contêm 10%-95%
e de ingrediente activo, de preferência entre 25%-70%.
As proteinas podem fazer parte da vacina como f ormas neutras ou sob a forma de sais. Sais farmaceuticamente aceites incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amina livres do péptido) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos hidroclórico, fosfórico, ou orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, maleico, e outros do mesmo tipo. Sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados a partir de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, ou ferro, ou de bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2etilaminoetanol, histidina, procaina, e outras do mesmo tipo.
Dosagem e Administração de Vacinas
As vacinas são administradas de um modo compatível com a formulação da dosagem, e numa quantidade tal que seja profiláctica e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada, geralmente na ordem dos 5 microgramas a 250 microgramas de antigénio por dose, depende do indivíduo a ser tratado, capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, e grau de protecção desejado. As quantidades exactas de ingrediente activo necessárias para administração podem depender da decisão do médico e ser especificas para cada indivíduo.
A vacina pode ser dada numa única dose ou, de preferência, num esquema de doses múltiplas. Um esquema de doses múltiplas é aquele em que uma fase inicial da vacinação pode ser efectuada em 1-10 doses separadas, seguida por outras doses dadas a intervalos de tempo subsequentes e que se destinam a manter e ou reforçar a resposta imunitária, por exemplo, a 1-4 meses para uma segunda dose, e, se necessário, dose(s) subsequente(s) alguns meses mais tarde. O regime de dosagem será também, pelo menos em parte, determinado pelas necessidades do indivíduo e pela decisão do médico.
Adicionalmente, a vacina contendo o(s) antigénio(s) imunogénico(s) do HCV pode ser administrada em conjunção com outros agentes imunorreguladores, por exemplo imunoglobulinas.
Preparação de Anticorpos Contra Epitopos do HCV
Os polipéptidos imunogénicos preparados do modo atrás descrito são utilizados para produzir anticorpos, tanto policlonais como monoclonais. Se se pretende obter anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (ex, rato, coelho, cabra, cavalo, etc) é imunizado com um polipéptido imunogénico contendo epitopo(s) HCV. 0 soro do animal imunizado é recolhido e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se o soro contendo anticorpos policlonais para um epitopo HCV contiver anticorpos para outros antigénios, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. Técnicas para produzir e processar anti-soros policlonais são conhecidos e estão descritos na literatura da especialidade; ver, por exemplo, Mayer e Walker (1987).
Alternativamente, podem-se isolar anticorpos monoclonais de um mamifero que tenha sido previamente infectado com HCV. Um exemplo de um método para purificar anticorpos para epitopos de HCV, a partir de soro de um individuo infectado, baseado na cromatografia de afinidade, e utilizando um polipéptido resultante da fusão entre SOD e um polipéptido codificado no interior do clone 5-1-1-de cDNA, é apresentado na Pub. EPO no 318,216.
Anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos de HCV podem também ser facilmente produzidos por peritos neste tipo de técnicas. A metodologia geral para produzir anticorpos monoclonais a partir de hibridomas é bem conhecida. Linhagens imortais de células produtoras de anticorpos podem ser criadas por fusão celular, e também por outras técnicas como tranformaçâo directa de linfócitos B com DNA oncogénico, ou tranfecçâo com virus de Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. Schreier et al (1980); Hammerling et al (1981); Kennett et al (1980); ver também Patentes norte americanas nos 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; e 4,493,890. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra epitopos de HCV podem ser testados, fazendose uma triagem quanto a várias propriedades; por exemplo, quanto ao isotipo, afinidade para o epitopo, etc.
Anticorpos dirigidos contra epitopos de HCV, quer sejam monoclonais quer policlonais, são particularmente úteis em diagnóstico, e aqueles que são neutralizantes são úteis em imunoterapia passiva. Os anticorpos monoclonais, em particular, podem ser utilizados para desenvolver a produção de anticorpos anti-idiotipo.
Anticorpos anti-idiotipo são imunoglobulinas que transportam uma imagem interna do antigénio do agente infeccioso contra ο qual se pretende obter protecção. Ver, por exemplo, Nisonoff, A., et al (1981) e Dreesman et al (1985).
Técnicas para originar a produção de anticorpos anti-idiotipo são conhecidas. Ver, por exemplo, Grzych (1985), MacNamara et al (1984) e Uytdehaag et al (1985). Estes anticorpos anti-idiotipo podem também ser úteis no tratamento e/ou diagnóstico de NANBH, bem como para a elucidação das regiões imunogénicas dos antigénios de HCV.
E também fácil de verificar por qualquer perito na técnica que pode ser produzida uma variedade de tipos de anticorpos contra epitopos de HCV. No contexto utilizado, o termo anticorpo refere-se a um polipéptido ou grupo de polipéptidos que sejam constituidos por, pelo menos, um sitio de ligação de anticorpo. Um sitio de ligação de anticorpo ou domínio de ligação é formado pelo dobramento de dominios variáveis de uma(s) molécula(s) de anticorpo, para formar espaços tridimensionais de ligação com uma superfície interna dotada de uma forma e de uma distribuição de cargas complementar às características de um epitopo de um antigénio, permitindo assim uma reacção imunológica com o antigénio. Um sitio de ligação de anticorpo pode ser formado por um dominio de cadeia pesada e/ou leve (VH e VL, respectivamente), que formam laçadas hipervariáveis que contribuem para a ligação do antigénio. 0 termo anticorpo inclui, por exemplo, anticorpos vertebrados, anticorpos híbridos, anticorpos quiméricos, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, as proteinas Fab, e anticorpos de um só dominio.
Um anticorpo de um só dominio (dAc) é um anticorpo que consiste num dominio VH, que reage imunologicamente com um determinado antigénio. Um dAc não contém um dominio VL, podem compreender outros dominios de ligação de antigénio que se sabe existirem em anticorpos, como, por exemplo, os dominios kappa e lambda. Métodos para preparar dABs são também conhecidos. Ver, por exemplo, Ward et al (1989).
Os anticorpos podem também ser constituidos por dominios VH e VL, bem como por outros dominios de ligação de antigénio conhecidos. Exemplos destes tipos de anticorpos e métodos para a sua preparação são conhecidos (ver, por exemplo, Patente Norte-americana No4,816,467, aqui incorporada por referência), e incluem os seguintes. Por exemplo, anticorpos vertebrados refere-se a anticorpos que são tetrâmeros ou seus agregados, compreendendo cadeias leves e pesadas que estão geralmente agregadas numa configuração em Y, podendo ter ou não ligações covalentes entre as cadeias. Nos anticorpos vertebrados, as sequências de aminoácidos de todas as cadeias de um determinado anticorpo são homólogas com as cadeias encontradas num anticorpo produzido pelo linfócito que produz esse anticorpo in situ ou in vitro, (por exemplo em hibridomas). Anticorpos vertebrados incluem em geral anticorpos nativos, por exemplo, anticorpos policlonais e monoclonais purificados. Mais adiante serão descritos exemplos dos métodos para a preparação destes anticorpos.
Anticorpos híbridos são anticorpos em que um par de cadeias leves e pesadas é homólogo às cadeias de um primeiro anticorpo, enquanto o outro par de cadeias leves e pesadas é homólogo às presentes num segundo anticorpo diferente do primeiro. Em geral, cada um destes dois pares se liga a diferentes epítopos, particularmente em antigénios diferentes. Isto resulta na propriedade conhecida por divalência, ou seja, na capacidade de se ligar a dois antigénios simultaneamente. Híbridos deste tipo podem também ser formados utilizando cadeias quiméricas, conforme se refere a seguir.
Anticorpos quiméricos são anticorpos em que as cadeias leves e/ou pesadas são proteínas de fusão. Em geral, o domínio constante das cadeias é de uma determinada espécie, e/ou classe e os dominios variáveis são de uma espécie e/ou classe diferente. Inclui-se também nesta categoria qualquer anticorpo em uma ou ambas as cadeias leves ou pesadas, que sejam compostas por combinações ou sequências que imitem as sequências em anticorpos de proveniências diferentes, quer essas proveniências sejam de diferentes classes, ou diferentes espécies de origem, e quer o ponto de fusão seja ou não na fronteira variável/constante. Portanto, é possivél produzir anticorpos em que nem a região constante nem a região variável imitem sequências de anticorpos conhecidas. Torna-se então possivél, por exemplo, construir anticorpos cuja região variável tem uma maior afinidade especifica para um determinado antigénio, ou cuja região constante possa conduzir a uma melhor fixação do complemento, ou ainda introduzir outros melhoramentos em propriedades existentes numa determinada região constante.
Outro exemplo são os anticorpos alterados, designação que se refere a anticorpos em que a sequência de aminoácidos que ocorreria normalmente num anticorpo vertebrado foi alterada. Utilizando técnicas de DNA recombinante, podemse introduzir alterações de modo a obter anticorpos com características desejadas. As variações possíveis são muitas, e vão desde a alteração de um ou mais aminoácidos, até à reconstrução completa de uma região, por exemplo, a região constante. Alterações na região constante destinam-se, em geral, a obter determinadas características do processo celular, por exemplo, alterações na fixação do complemento, na interacção com membranas, e outras características de efectores. As alterações na região variável podem ser feitas para alterar características de ligação do antigénio. 0 anticorpo pode também ser projectado para auxilir a entrega especifica de uma molécula ou substância, a um sitio especifico, numa célula ou tecido. As alterações pretendidas podem ser feitas por técnicas conhecidas em biologia molecular, por exemplo, técnicas recombinantes, mutagénese dirigida, etc.
Ainda outro exemplo são os anticorpos univalentes, que são agregados constituídos por um dimero cadeia leve/cadeia pesada ligado à região Fc (ou seja, constante), de uma segunda cadeia pesada. Este tipo de anticorpo foge à modulação antigénica. Ver, por exemplo, Glennie et al (1982).
Incluídos também na definição de anticorpos estão os fragmentos Fab de anticorpos. A região Fab refere-se às porções das cadeias leves e pesadas que são grosseiramente equivalentes, ou análogas, às sequências que compreendem a zona de ramificação das cadeias leves e pesadas, e que se provou apresentarem ligação imunológica a um antigénio especificado, mas que não possuem a região efectora Fc. Fab inclui agregados de uma cadeia leve e uma cadeia pesada (geralmente conhecidos por Fab'), bem como tetrâmeros contendo as cadeias 2H e 2L (designados por F(ab)2)» que apresentam a capacidade de reagir selecivamente com um determinado antigénio ou familia de antigénios. Os anticorpos Fab podem ser divididos em subconjuntos análogos aos descritos anteriormente, isto é, Fab vertebrados, Fab hibridos, Fab quiméricos, e Fab alterados. São conhecidos métodos de J produzir fragmentos Fab de anticorpos incluindo, por exemplo, a proteólise e síntese por técnicas recombinantes.
II·H. Sondas de Oligonucleótidos e Kits para Diagnóstico
Usando como base as porções descritas dos cDNAs isolados do HCV, podem-se preparar oligómeros de aproximadamente 8 nucleôtidos ou mais, quer por excisâo quer sinteticamente, que hibridizem com o genoma de HCV e são úteis na identificação do(s) agente(s) virai(is), caracterização posterior e mais completa do(s) genoma(s) virai(is), bem como na detecção do(s) virus em indivíduos doentes. As sondas para polinucleótidos de HCV (naturais ou derivados) serão de um comprimento que permita a detecção de sequências virais únicas por hibridação. Enquanto 6-8 nucleôtidos pode ser um comprimento fácil de trabalhar, são preferíveis sequências de 10-12 nucleôtidos, e consideram-se óptimas sequências de cerca de 20 nucleôtidos. Estas sequências devem ser derivadas, de preferência, de regiões com falta de heterogenidade. Estas *<
Η sondas podem ser preparadas usando métodos de rotina, incluindo métodos de sintese automática de oligonucleótidos. Entre as sondas úteis, por exemplo, encontram-se as derivadas a partir dos clones recentemente isolados que aqui são revelados, bem como os diversos oligómeros úteis para a sondagem de patrimónios de cDNA que se apresentam adiante. Uma sequência que seja complementar a qualquer região exclusiva do genoma de HCV será satisfatória. Para a utilização como sonda, é desejável uma complementaridade integral, embora possa ser desnecessária à medida que se aumenta o comprimento do fragmento.
Para a utilização destas sondas como meios de dignóstico, a amostra biológica a ser tratada, por exemplo sangue ou soro, pode ser tratada, se tal for pretendido, para a extracção dos ácidos nucleicos nela contidos. Os ácidos nucleicos resultantes da amostra podem ser submetidos a electroforese em gel ou outras técnicas de separação baseadas na dimensão; alternativamente, a amostra de ácidos nucleicos pode ser dot blotted sem separação por tamanho. As sondas são então marcadas. Conhecem-se marcadores adequados e métodos para a marcação de sondas, incluindo, por exemplo, marcadores radioactivos incorporados por corte e translacção nick translation ou uso de quinases, biotina, sondas fluorescentes e sondas quimioluminescentes. Os ácidos nucleicos extraídos da amostra são posteriormente tratados com a sonda marcada, sob condições de hibridaçâo, com o rigor adequado, e detectam-se os polinucleótidos duplex que contenham a sonda.
As sondas podem ser feitas com uma
complementariedade integral ao genoma do HCV. Logo, em geral sao desejáveis condições extremamente rigorosas para impedir o aparecimento de falsos positivos. No entanto, condições de extremo rigor só devem ser utilizadas se as sondas forem complementares a regiões do genoma virai que tenham falta de heterogeneidade. 0 rigor da hibridaçâo é determinado por uma série de factores durante a hibridaçâo e durante o processo de lavagem, incluindo a temperatura, força iónica, duração, e concentração de formamida. Estes factores são descritos, por exemplo, em Maniatis, T. (1982).
Geralmente, espera-se que as sequências genómicas do
HCV estejam presentes no soro dos individuos infectados em 2 niveis relativamente reduzidos, isto é, aproximadamente 10 a 3 doses infecciosas para chimpanzé (CID), por ml. Este nivel pode implicar a necessidade de utilizar técnicas de amplificação nos ensaios de hibridaçâo. Estas técnicas são também conhecidas no meio. Por exemplo, o sistema Biobridge da Enzo Biochemical Corporation utiliza desoxinucleótido transferase terminal para adicionar caudas 3'-poli-dT não modificadas a uma sonda de DNA. A sonda com a cauda poli-dT é hibridizada com a sequência de nucleótidos a identificar, e posteriormente com um poli-A modificado com biotina. O Pedido PCT 84/03520 e EPA124221 descrevem um ensaio de hibridaçâo de DNA em que: (1) a amostra a analisar é hibridada com uma sonda de DNA de cadeia simples que é complementar de um oligonucleótido marcado enzimaticamente; e (2) o duplex resultante, dotado de uma cauda, é hibridizado com um oligonucleótido marcado enzimaticamente. EPA204510 descreve um ensaio de hibridização de DNA em que o DNA a analisar é posto em contacto com uma sonda que tem uma cauda, por exemplo uma cauda poli-dT, uma cadeia amplificadora que tem uma sequência que hibridiza com a cauda da sonda, como uma sequência poli-A, e que é capaz de se ligar a uma série de cadeias marcadas. Uma técnica particularmente vantajosa pode envolver primeiro uma amplificação em cerca de 10.000 vezes das sequências alvo de HCV existentes no soro, isto é, passando a ser de cerca de 10 sequências/ml. Isto pode ser efectuado, por exemplo, por meio da técnica das reacções de polimerase em cadeia (PCR) descrita por Saiki et al (1986), de Mullis, Patente Norte Americana no4,683,195, e de Mullis et al, Patente Norte Americana no4,683,202. A(s) sequência(s) amplificada(s) pode(m) ser detectada(s) utilizando um método de hibridização descrito em EPO 317,077, publicada em 24 de Maio de 1989. Estes ensaios de hibridização, que devem detectar sequências ao nivel de 10 /ml, utilizam multimeros de ácidos nucleicos que se ligam à amostra de DNA de cadeia simples a analisar, e também se ligam a uma variedade de oligonucleótidos marcados de cadeia simples. Um ensaio adequado de sandwich em fase liquida pode ser utilizado com sonda de polinucleótidos marcadas, e os métodos para a preparação das sondas são descritos em EPO225,807, publicado em 16 de Junho de 1987 As sondas podem ser embaladas em diagnóstico. Os kits de diagnóstico incluem a sonda de DNA, que pode ser marcada; alternativamente, a sonda de DNA pode não ser marcada, e os ingredientes para a marcação serem incluídos no kit, mas embalados separadamente. 0 kit pode
1987 «
kits de
de DNA,
DNA pode
ãO serem
kit pode
também incluir outros reagentes adequadamente embalados e material necessário para o protocolo de hibridação em particular, por exemplo, padrões, bem como as instruções para a execução do ensaio de diagnóstico.
Kits de Ensaio imunológico e de Diagnóstico
Tanto os polipéptidos que reagem imunologicamente com o soro contendo anticorpos HCV, por exemplo os detectados pelo método de pesquisa antigénica descrito nos Exemplos, bem como os derivados de ou codificados nos clones isolados descritos nos Exemplos, e compostos a partir destes, e os anticorpos desenvolvidos contra os epitopos específicos de HCV nestes polipéptidos, têm utilidade em ensaios imunológicos para detectar a presença de anticorpos de HCV, ou a presença do virus e/ou antigénios virais, em amostras biológicas. A constituição dos ensaios imunológicos está sujeita a uma grande variação, conhecendo-se uma grande variedade de ensaios neste tipo de técnicas. Por exemplo, o ensaio imunológico pode utilizar um epitopo virai; alternativamente, o ensaio imunológico pode utilizar uma combinação de epitopos virais derivado destas fontes; estes epitopos podem ser derivados do mesmo ou de diferentes polipéptidos virais, e estar em polipéptidos naturais ou recombinantes separados, ou juntos nos mesmos polipéptidos recombinantes. 0 ensaio pode usar, por exemplo, um anticorpo monoclonal dirigido contra um(s) epitopo(s) virai(s), uma combinação de anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos de um antigénio virai, anticorpos monoclonais dirigidos contra epitopos de diferentes antigénios '“Μ
Μ virais, anticorpos policlonais dirigidos contra o mesmo antigénio virai, ou anticorpos policlonais dirigidos contra diferentes antigénios virais. Os protocolos experimentais podem-se basear, por exemplo, em ensaios de competição, ou de reacção directa, ou tipo sandwich. Os protocolos podem também, por exemplo, usar suportes sólidos, ou ser por imunoprecipitação. A maioria dos ensaios envolvem o uso de anticorpo ou polipéptido marcados; os marcadores podem ser, por exemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminescentes, radioactivas ou corantes. Conhecem-se também ensaios que amplificam os sinais da sonda; são exemplos destes, ensaios que utilizam biotina e avidina, e ensaios imunológicos marcados e mediados por enzimas, tal como os ensaios tipo
ELISA.
Algumas das regiões antigénicas da suposta poliproteina foram mapeadas e identificadas mediante uma triagem da antigenicidade dos produtos de expressão bacteriana de cDNA de HCV que codificam porções da poliproteina. Ver os Exemplos. Outras regiões antigénicas do HCV podem ser detectadas expressando as porções dos cDNAs de HCV noutros sistemas de expressão, incluindo sistemas de leveduras e sistemas celulares derivados de insectos e vertebrados.
Adicionalmente, estudos que dêem origem a um Índice de antigenic idade e a um perfil de hidrofobicidade/ hidrofilicidade podem fornecer informação respeitante à probabilidade de uma região ser antigénica.
Estudos de mapeamento antigénico por expressão de cDNAs de HCV, mostraram que um número de clones contendo estes cDNAs expressavam polipéptidos que eram imunologicamente reactivos com soro de individuos com NANBH. Nenhum polipéptido sózinho era imunologicamente reactivo com todos os soros. Cinco destes polipéptidos eram muito imunogénicos, ou seja, foram detectados anticorpos contra epitopos de HCV contidos nestes polipéptidos, em soros de muitos doentes, embora a sobreposição na detecção não fosse completa. Assim, os resultados acerca da imunogenicidade dos polipéptidos codificados nos vários clones sugerem que sistemas de detecção eficazes podem incluir a utilização de painéis de epitopos. Os epitopos no painel podem ser incluídos num ou em múltiplos polipéptidos.
Os kits adequados para a diagnose imunológica e contendo os reagentes marcados adequados, são construídos embalando os materiais adequados, incluindo os polipéptidos da invenção contendo epitopos de HCV ou anticorpos dirigidos contra epitopos de HCV, em recipientes adequados, junto com os restantes reagentes e materiais necessários para a execução do ensaio, bem como um conjunto de instruções de ensaio adequado.
Aprofundamento da Caracterização do Genoma de HCV, Viriões, e Antigénios Virais Utilizando Sondas Derivadas de cDNA do
Genoma Virai
A informação respeitante à sequência do cDNA de HCV nos clones recentemente isolados, descrita nos Exemplos, pode ser utilizada para adquirir mais informação acerca da sequência do genoma de HCV, e para identificação e isolamento do agente HCV, e portanto ajudará na sua caracterização ύ ' ¢incluindo a natureza do genoma, a estrutura da particula virai, e a natureza dos antigénios que a constituem. Esta informação, por sua vez, pode conduzir a sondas de polinucleótido adicionais, polipéptidos derivados do genoma de HCV, e anticorpos dirigidos contra epitopos de HCV que seriam úteis para o diagnóstico e/ou tratamento de NANBH causado por
HCV.
A informação acerca da sequência de cDNA nos clones atrás referidos é útil para o projecto de sondas, para o isolamento de sequências de cDNA adicionais que são derivadas de regiões ainda não definidas do(s) genoma(s) de HCV dos quais derivam os cDNAs dos clones descritos aqui, e na EPO 316,218. Por exemplo, sondas marcadas contendo uma sequência de aproximadamente 8 ou mais nucleótidos, e de preferência 20 ou mais nucleótidos, derivadas de regiões próximas das extremidade 3'ou 5'da sequência de cDNA de HCV composta que é mostrada na Fig.17, podem ser utilizadas para isolar, a partir de patrimónios de cDNA de HCV, sequências de cDNA que se sobreponham. Alternativamente, a caracterização de segmentos do genoma poderia ser a partir do(s) genoma(s) viral(s) isolado(s) de partículas de HCV purificadas. Métodos para purificar partículas de HCV e para as detectar durante o processo de purificação são descritas adiante. São conhecidos processos para isolar genomas de polinucleótidos a partir de partículas virais, e um procedimento que pode ser utilizado é o descrito na EPO.218,316. Os segmentos genómicos isolados podem então ser clonados e sequenciados. Um exemplo desta técnica, que utiliza a amplificação das sequências a cionar, é descrito adiante, e originou o clone 16jh.
Conhecem-se métodos para a construção de patrimónios de cDNA, e são descritos atrãs e a seguir; um método para a construção de patrimónios de cDNA de HCV em lambda-gtll é discutido na Pub EPO no 318,216. No entanto, podem-se também construir noutros vectores patrimónios de cDNA úteis para uma triagem com sondas de ácidos nucleicos, por exemplo no vector lambda-gtlO (Huynh et al, 1985).
agentes que multiplicação
Pesquisa para Identificação de Agentes Antivirais para HCV
A disponibilidade de culturas celulares e sistemas modelo animais para o HCV torna possivel efectuar uma pesquisa para a identificação de agentes anti-virais que inibam a replicação do HCV, e particularmente de preferencialmente permitam o crescimento e celular e simultaneamente inibam a replicação virai. Estes métodos de triagem são conhecidos das pessoas que trabalham nesta área. Em geral, os agentes anti-virais são testados a uma séria de concentrações, quanto ao seu efeito em evitar a replicação virai em sistemas de cultura celular que suportam a replicação virai, e posteriormente quanto a uma inibição da patogenicidade virai ou infecciosidade (e um baixo nivel de toxicidade), num sistema modelo animal.
Os métodos e composições aqui fornecidos para a detecção de antigénios de HCV e de polinucleótidos de HCV são úteis para uma pesquisa de agentes anti-virais, uma vez que proporcionam uma alternativa, ou mesmo um meio mais sensível, para a detecção do efeito do agente na replicação virai, do
que o ensaio de placas celulares ou o ensaio do ID50· Por exemplo, as sondas de polinucleótidos de HCV aqui descritas podem ser utilizadas para quantificar a quantidade de ácido nucleico virai produzido numa cultura celular. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por hibridizaçâo ou hibridizaçâo competitiva dos ácidos nucleicos da célula infectada, com uma sonda de polinucleótido de HCV marcada. Também, por exemplo, anticorpos anti-HCV podem ser utilizados para identificar e quantificar antigénio(s) HCV na cultura celular utilizando os ensaios imunológicos aqui descritos. Adicionalmente, uma vez que pode ter interesse quantificar os antigénios HCV na cultura celular infectada, por meio de um ensaio de competição, os polipéptidos codificados no interior dos cDNAs de HCV descritos são úteis nesses ensaios de competição. Em geral, um polipéptido HCV recombinante derivado do cDNA de HCV seria marcado, e seguir-se-ia a inibição da ligação deste polipéptido marcado a um polipéptido do HCV devida ao antigênio produzido no sistema de cultura celular. Além do mais, estas técnicas têm um interesse particular nos casos em que o HCV tenha a capacidade de se replicar numa linha celular sem causar a morte celular.
Os agentes antivirais que podem ser testados quanto à sua eficácia por estes métodos são conhecidos de quem trabalhe nesta área, e incluem, por exemplo, aqueles que interagem com componentes de viriões e/ou componentes celulares que sejam necessários para a ligação e/ou replicação do virus. Agentes anti-virais tipicos podem incluir, por exemplo, inibidores da polimerase do virião e/ou proteases do virião, necessários à clivagem dos polipéptidos precursores.
Outros agentes anti-virais podem incluir aqueles que interajam com ácidos nucleicos para impedir a replicação virai, por exemplo, polinucleótidos anti-sentido, etc.
As moléculas de polinucleótido anti-sentido consistem numa sequência de núcleótidos complementar que lhes permite hibridizar especificamente com determinadas regiões dos genomas ou RNAs. Os polinucleótidos anti-sentido podem incluir, por exemplo, moléculas que vão bloquear a tradução das proteínas por se ligarem ao mRNA, ou podem ser moléculas que impedem a replicação do RNA virai pela trancriptase. Podem também incluir moléculas que transportam agentes (nãocovalentemente associados, ou covalentemente ligados) que vão tornar o RNA virai inactivo porque causam, por exemplo, cisões no RNA virai. Podem-se também ligar a polinucleótidos celulares que aumentam e/ou são necessários para a infectividade virai, capacidade replicativa, ou cronicidade. Moléculas anti-sentido que se destinem a hibridizar com os RNAs derivados de HCV podem ser proj ectadas com base na informação da sequência dos cDNAs do HCV que aqui se proporciona. Os agente anti-virais baseados em polinucleótidos anti-sentido para o HCV podem ser projectados para se ligarem com uma elevada especificidade, para ter uma solubilidade aumentada, uma maior estabilidade, e uma toxicidade reduzida. Consequentemente, podem ser administrados em sistemas especializados, por exemplo, lipossomas, ou por terapia génica. Adicionalmente, podem incluir análogos, proteínas ligadas, bases substituídas ou ligações alteradas
Outros tipos de drogas podem-se basear em polinucleótidos que imitem importantes regiões de controle do genoma de HCV, e que podem ser terapêuticas devido às suas interacções com componentes chave do sistema responsável pela infectividade ou replicação virais.
entre bases, etc.
Métodos Gerais
As técnicas gerais utilizadas na extracção do genoma de um virus, na preparação e sondagem de um património de cDNA, na sequênciação de clones, construção de vectores de expressão, transformação de células, execução de ensaios imunológicos tais como os ensaios radioimunológicos e os ensaios tipo ELISA, crescimento de células em cultura, e outras semelhantes, são conhecidas e existem manuais de laboratório que as descrevem. No entanto, como guia geral, a seguir se descrevem algumas das fontes geralmente disponíveis para esses procedimentos, e os materiais que são necessários para a sua execução.
Tanto células eucarióticas como procarióticas podem ser utilizadas como hospedeiras para a expressão das sequências codificadoras pretendidas, desde que se use sequências de controle compatíveis com o hospedeiro escolhido. Entre os hospedeiros procarióticos, E. coli é o mais utilizado. Sequências de controle de expressão para procariotas incluem promotores, contendo opcionalmente porções operadoras, e sitios de ligação dos ribossomas. Vectores de transferência compatíveis com hospedeiros procarióticos são frequentemente derivados de, por exemplo, pBR322, um plasmídeo contendo operões que conferem resistência à ampicilina e à tetraciclina, e os diversos vectores pUC, que também contém como marcadores sequências conferindo resistência a antibióticos. Estes marcadores podem ser utilizados para obter por selecção transformantes bem sucedidos. Sequências de controle para procariotas normalmente utilizadas incluem os sistemas promotores da Beta-lactamase (penicilinase) e da lactose (Chang et al, 1977), o sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al, 1980) e o promotor Pjj derivado do lambda, e o local de ligação ao ribossoma do gene N (Shimatake et al, 1981), e o promotor hibrido tac (De Boer et al, 1983) derivado das sequências dos promotores trp e lac UV5. Os sistemas referidos são particularmente compatíveis com E. coli; se necessário, podem-se utilizar outros hospedeiros procarióticos, como estirpes de Bacillus e de Pseudomonas, com as sequências de controle correspondentes.
Os hospedeiros eucarióticos incluem células de leveduras e de mamíferos em sistemas de cultura. Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsbergensis são os mais frequentemente utilizados, e são hospedeiros fúngicos convenientes. Vectores compatíveis com as leveduras possuem marcadores que permitem a selecção dos tranformantes bem sucedidos conferindo prototrofia a mutantes auxotróficos ou resistência a metais pesados a estirpes selvagens. Vectores compatíveis com leveduras podem utilizar a extremidade de 2 micron da replicação (Broach et al, 1983), a combinação de CEN3 e ARS1 ou outros meios para assegurar a replicação, tais
como sequências que resultem na incorporação de um fragmento apropriado no genoma da célula hospedeira. Sequências de controle para vectores em leveduras estão descritas e incluem promotores para a sintese de enzimas glicoliticos (Hess et al, 1968; Holland et al, 1978), incluindo o promotor para a 3fosfoglicerato quinase (Hitzeman, 1980). Sequências de terminação podem também ser incluídas, tais como as derivadas do gene da enolase (Holland, 181). Sistemas de controle particularmente úteis são aqueles que compreendem o promotor da gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou o promotor regulável da álcool desidrogenase (ADH), sequências de terminação também derivadas da GAPDH, e se se pretender secreção, a sequência lider do factor alfa das leveduras. Adicionalmente, a região reguladora da transcrição e a região de inicio da transcrição que são operativamente ligadas, podem ser de um tipo que não se encontra naturalmente associado no organismo selvagem. Estes sistemas estão descritos em detalhe em EPO 120,551, publicado em 3 de Outubro de 1984; EPO 116,201, publicado em 22 de Agosto de 1984; e EPO 164,556, publicado em 18 de Dezembro de 1985, todas elas atribuídas à presente requerente, e aqui incorporadas para referência.
Existem várias linhagens de células de mamifero disponíveis como hospedeiros para expressão, e incluem muitas linhagens de células imortais na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo células HeLa, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebé (BHK), e uma série de outra linhagens de células. Promotores adequados para células de mamifero são também conhecidos e incluem promotores virais como o do Virus Simio 40 (SV40) (Fiers, 1978), do virus do sarcoma de Rous (RSV), do adenovirus (ADV), e do virusdo papiloma bovino (BPV). As células de mamifero podem também necessitar de sequências de terminação e de sequências de adição de poli-A; sequências efectoras que aumentem a expressão podem também ser incluídas, e sequências que causem a amplificação do gene podem também ser desejáveis. Estas sequências são conhecidas nesta área. Vectores adequados para a replicaçâo em células de mamifero podem incluir replicões virais, ou sequências que assegurem a integração no genoma do hospedeiro das sequências apropriadas que codificam os epitopos NANBV.
A transformação pode ser feita por qualquer método conhecido de introduzir polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, utilizar um virus como veiculo do polinucleótido e fazer a transduçâo duma célula hospedeira com esse virus, ou por introdução directa do polinucleótido. 0 processo de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Por exemplo, a transformação de células hospedeiras de E. coli com lambda-gtll contendo sequências BB-NANBV é discutida na secção dos exemplos, adiante. A transformação bacteriana por introdução directa geralmente utiliza um tratamento com cloreto de cálcio ou de rubidio (Cohen, 1972; Maniatis, 1982). A transformação de leveduras pelo método da introdução directa pode ser efectuada usando o método de Hinnen et al (1978. Transformações de células de mamifero por introdução directa podem ser feitas utilizando o método de precipitação com fosfato de cálcio de
Graham e Van der Eb (1978), ou as várias modificações a este método.
A construção de vectores recorre a técnicas conhecidas nesta área. A clivagem especifica do DNA é feita tratando com enzimas de restrição adequados em condições que são geralmente especificadas pelo fabricante desses enzimas comercialmente disponíveis. Em geral, cerca de um micrograma de plasmídeo ou de sequência de DNA é clivada por uma unidade de enzima em cerca de 20 microlitros de solução tampão por incubação durante 1-2 horas a 37°C. Após incubação com o J enzima de restrição, a proteina é removida por extracção com fenol/clorofórmio e o DNA recuperado por precipitação com etanol. Os fragmentos clivados podem ser separados utilizando técnicas de electroforese em gel de agarose, ou poliacrilamida, de acordo com os procedimentos gerais que se podem encontrar em Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.
Fragmentos de clivagem de extremidades coesivas podem ser transformadas em extremidades cegas utilizando DNA polimerase I de E. coli (Klenow) em presença dos trifosfatos £ de desoxinucleótido (dNTPs) apropriados, presentes na mistura. Pode também ser usado o tratamento com nuclease Sl, resultando na hidrólise de quaisquer porções de DNA de cadeia simples.
As ligações são feitas em condições padrão de tampão e de temperatura usando DNA ligase de T4 e ATP; as ligações de extremidades coesivas necessitam de menos ATP e menos ligase que as ligações de extremidades cegas. Quando se usam fragmentos de vectores como parte de uma mistura de ligação, o fragmento de vector é frequentemente tratado com fosfatase alcalina bacteriana (BAP) ou fosfatase alcalina de intestino de vitelo para remover o 5'-fosfato e assim evitar a religaçâo do vector; alternativamente, a digestão dos fragmentos de vector indesejados por enzimas de restrição pode também ser utilizada para evitar a ligação.
As misturas de ligação são transformadas para hospedeiros de clonagem adequados, como E. coli, e os tranformantes bem sucedidos seleccionados, por exemplo, por resistência a um antibiótico, e feita uma triagem para identificar as construções correctas.
Podem ser preparados oligonucleótidos sintéticos utilizando um sintetizador automático de oligonucleótidos, conforme o descrito por Warner (1984). Se se quiser, as 32 cadeias sintéticas podem ser marcadas com P por tratamento 32 com polinucleótido quinase em presença de P-ATP, em condições padrão para esta reacção.
Sequências de DNA, incluindo aquelas isoladas a partir de patrimónios de cDNA, podem ser modificadas por técnicas conhecidas, por exemplo mutagénese dirigida, conforme descrito por · Zoller (1982). Resumidamente, o DNA a ser modificado é introduzido em fagos como uma sequência de cadeia simples, e convertido num DNA de cadeia dupla com DNA polimerase usando, como sequência iniciadora (primer), um oligonucleótido sintético complementar à porção de DNA a ser modificada, e tendo a modificação pretendida incluida na sua própria sequência. 0 DNA de cadeia dupla resultante é transformado, por intermédio do fago, para uma célula bacteriana hospedeira. Culturas da bactéria transformada,
I;
SãO contendo replicações de cada uma das cadeias do fago, plaqueadas em agar para obter placas. Teoricamente, 50% das novas placas contêm fago com a sequência mutada, e os restantes 50% têm a sequência original. As réplicas das placas são hibridadas com sonda sintética marcada, a temperaturas e em condições que permitam a hibridizaçâo com a cadeia correcta, mas não com a sequência que não foi modificada. As sequências que foram identificadas por hibridizaçâo são recuperadas e clonadas.
Podem-se sondar patrimónios de DNA usando o método de Grunstein e Hogness (1975). Resumidamente, neste processo, o DNA a ser sondado é imobilizado em filtros de nitrocelulose, desnaturado, e pré-hibridizado com um tampão contendo 0-50% de formamida, 0,75 M NaCl, 75 mM citrato de Na, 0,02% (p/v) de albumina de soro bovino, de polivinil-pirrolidona, e de Ficoll, 50 mM de fosfato de Na (pH 6,5), 0,1% SDS, e 100 microgramas/ml de veiculo de DNA desnaturado. A percentagem de formamida no tampão, bem como o tempo e as condições de temperatura da pré-hibridização e dos subsequentes passos de hibridizaçâo depende do grau de rigor pretendido. Sondas oligoméricas que necessitam de condições menos rigorosas são geralmente utilizadas com baixas percentagens de formamida, temperaturas mais baixas, e tempos de hibridizaçâo mais prolongados. Sondas contendo mais de 30 ou 40 nucleótidos tais como as derivadas de cDNA ou sequências genómicas geralmente utilizam-se com temperaturas mais elevadas, por exemplo 4042°C, e uma percentagem de formamida mais elevada, por exemplo, 50%. A seguir Δ pré-hibridização, adiciona-se ao tampão sonda de oligonucleótido marcado 5'- P, e os filtros são incubados nesta mistura em condições de hibridização. Após lavagem, os filtros tratados são sujeitos a autoradiografia para mostrar a localização da sonda hibridizada; o DNA, em localizações correspondentes nas placas de agar originais, é utilizado como fonte do DNA pretendido.
Para construções rotineiras de vectores, faz-se a tranformação de misturas de ligação para estirpe HB101 de E. coli ou outro hospedeiro adequado, e os transformantes bem sucedidos seleccionados por resistência a antibiótico ou outros marcadores. Preparam-se então plasmideos a partir dos transformantes de acordo com o método de Clewell et al (1969), em geral após amplificação por cloroanfenicol (Clewell, 1972). 0 DNA é isolado e analisado, geralmente por análise por enzimas de restrição e /ou sequenciação. A sequenciação pode ser feita pelo método de desoxi de Sanger et al (1977), conforme descrito e modificado por Messing et al (1981), ou pelo método de Maxam et al (1980). Problemas com compressão das bandas, que se observam por vezes em regiões ricas em GC, foram superadas pela utilização de T-deazo-guanosina de acordo com Barr et al (1986).
ensaio de imunoabsorção com enzima ligado (ELISA) pode ser utilizado para medir concentrações quer de antigénio quer de anticorpo. Este método depende da conjugação de um enzima a um antigénio ou um anticorpo, e utiliza a actividade do enzima ligado como marcador quantitativo. Para medir anticorpo, o antigénio conhecido é fixado a uma fase sólida (por exemplo, uma microplaca ou taça plástica), incubado com diluições do soro a testar, lavado, incubado com antiimunoglobulina marcada com um enzima, e lavado novamente. Conhecem-se vários enzimas adequados para esta marcação, incluindo, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre. A actividade do enzima ligado à fase sólida é medida por adição do substrato especifico, e determinando colorimetricamente a formação do produto ou a utilização do substrato. A actividade do enzima ligado é uma função directa da quantidade de anticorpo ligado.
Para medir o antigénio, fixa-se à fase sólida um anticorpo especifico conhecido, o material a testar contendo o antigénio é adicionado, após uma incubação a fase sólida é lavada, e um segundo anticorpo marcado com um enzima é adicionado. Após lavagem, adiciona-se substrato, e a actividade enzimática é calculada colorimetricamente, e relacionada com a concentração de antigénio.
Exemplos
A seguir descrevem-se exemplos do presente invento que são proporcionados apenas a titulo de ilustração, e não para limitar o âmbito do presente invento. A partir do que foi revelado, serão aparentes muitas concretizações no âmbito do que é descrito para aqueles que trabalham neste ramo.
Isolamento e Sequência dos Clones Sobreponíveis de cDNA de HCV: 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e e CA167b
Os clones 13i, 26j, CA59a, CA84a, CA156e e CA167b foram isolados a partir do património lambda-gtll que contém
SSS cDNA de HCV (ATCC nq 40394), cuja preparação é descrita em EPO Pub. no 318,216 (publicado em 31 de Maio de 1989), e em WO 89/04669 (publicado em 1 de Junho de 1989). A pesquisa do património foi feita com as sondas a seguir descritas, utilizando o método descrito em Huynh (1985). As frequências com que apareceram clones positivos com as sondas respectivas foi de cerca de 1 em 50.000.
isolamento do clone 13i foi feito utilizando uma sonda sintética derivada da sequência do clone 12f. A sequência da sonda era:
5' GAA CGT TGC GAT CTG GAA GAC AGG GAC AGG 3'.
isolamento do clone 26j foi feito utilizando uma sonda derivada da região 5'do clone k9-l. A sequência da sonda era:
5' TAT CAG TTA TGC CAA CGG AAG CGG CCC CGA 3'.
Os procedimentos de isolamento para o clone 12f e para o clone k9-l (também chamado K9-1) estão descritos em EPO Pub. no 318,216, e as suas sequências são mostradas nas Figs. 1 e 2, respectivamente. As sequências do cDNA de HCV dos clones 13i e 26j, são mostradas nas Figs. 4 e 5, respectivamente. Mostram-se também os aminoácidos por elas codificados, bem como a sobreposição do clone 13i com o clone 12f, e a sobreposição do clone 26j com o clone 13i. As sequências para estes clones confirmaram a sequência do clone K9-1. 0 clone K9-1 tinha sido isolado a partir de um diferente património de cDNA de HCV (ver EPO,218,316).
'''Μ » clone CA59a foi isolado utilizando uma sonda baseada na sequência da região 5' do clone 26j. A sequência desta sonda era:
5' CTG GTT AGC AGG GCT TTT CTA TCA CCA CAA 3' .
Utilizou-se uma sonda derivada da sequência do clone CA59a para isolar o clone CA84a. A sequência da sonda utilizada para este isolamento era:
5’ AAG GTC CTG GTA GTG CTG CTG CTA TTT GCC 3'.
clone CA156e foi isolado utilizando uma sonda derivada da sequência do clone CA84a. A sequência da sonda era:
5' ACT GGA CGA CGC AAG GTT GCA ATT GCT CTA 3' .
clone CA167b foi isolado utilizando uma sonda derivada da sequência do clone CA156e. A sequência da sonda era:
5' TTC GAC GTC ACA TCG ATC TGC TTG TCG GGA 3’.
As sequências de nucleótidos dos cDNAs de HCV nos clones CA59a, CA84a, CA156e e CAl67b, estão representadas nas Figs. 6, 7, 8 e 9, respectivamente. Os aminoácidos que codificam, bem como as sobreposições com as sequências dos clones relevantes, estão também representados nas Figuras.
Criação de um Património pi de cDNA de HCV
Construiu-se um património de cDNA de HCV, o património pi, a partir do mesmo lote de plasma de chimpanzé infeccioso utilizado para construir o património lambda-gtll de cDNA de HCV (ATCC no 40394) descrita em EPO Pub. no
318,216, e utilizando essencialmente as mesmas técnicas. No entanto, para a construção do património pi utilizou-se um método de extensão do iniciador, em que a sequência iniciadora para a transcriptase reversa se baseou na sequência do clone CA59a. A sequência do iniciador era:
5' GGT GAC GTG GGT TTC 3'
Isolamento e Sequenciação do Clone pi!4a A pesquisa do património pi do cDNA de HCV atrás descrito, com a sonda utilizada para isolar o clone CA167b (ver atrás), deu origem ao clone pil4a. O clone contém cerca de 800 pares de bases de cDNA que se sobrepõem aos clones CAl67b, CA156e, CA84a e CA59a, que foram isolados a partir do património lambda-gtll de cDNA de HCV (ATCC no 40394). Adicionalmente, pil4a contém cerca de 20 pares de bases de DNA que se encontram a montante do cDNA de HCV do clone CA167b.
Isolamento e Sequenciação dos Clones CA216a, CA290a e ag30a
Com base na sequência do clone CA167b construiu-se uma sonda sintética com a seguinte sequência:
5’ GGC TTT ACC ACG TCA CCA ATG ATT GCC CTA 3'
A sonda acima referida foi utilizada para uma pesquisa da qual resultou o clone CA216a, cujas sequências de
HCV estão representadas na Fig. 10.
Fez-se outra sonda baseada na sequência do clone CA216a, com a seguinte sequência:
5' TTT GGG TAA GGT CAT CGA TAC CCT TAC GTG 3'
A pesquisa do património lambda-gtll (ATCC no 40394) com esta sonda deu origem ao clone CA290a, cujas sequências HCV são representadas na Fig. 11.
Numa tentativa semelhente, constituiu-se um património de cDNA de extensão de sequências iniciadoras utilizando ácido nucleico extraido do mesmo plasma infeccioso utilizado no património lambda-gtll de cDNA atrás descrita. O iniciador utilizado baseou-se na sequência dos clones CA216a e
CA290a:
5' GAA GCC GCA CGT AAG 3' património de cDNA foi constituído recorrendo a métodos semelhantes aos descritos anteriormente para patrimónios utilizados no isolamento dos clones pil4a e k9-l. A sonda utilizada para a pesquisa deste património baseou-se na sequência do clone CA290a:
5' CCG GCG TAG GTC GCG CAA TTT GGG TAA 3'
O clone ag30a foi isolado a partir do novo património com a sonda descrita acima, e continha cerca de 670 pares de bases de sequência HCV. Ver Fig. 12. Parte desta sequência sobrepõe-se à sequência HCV dos clones CA216a e
ft
CA290a. No entanto, cerca de 300 pares de bases da sequência de ag30a encontram-se a montante da sequência do clone CA290a. A sequência não sobreponivel mostra um codão de iniciação (*) e codões de paragem que podem indicar o inicio do HCV ORF. Estão também indicados na Fig. 12 pequenos péptidos codificados supostos (#) que podem desempenhar um papel na regulação da tradução, bem como o suposto primeiro aminoácido do suposto polipéptido (/), e os aminoácidos codificados a jusante.
Isolamento e Sequenciação do Clone CA205a 0 clone CA205a foi isolado a partir do património original lambda-gtll (ATCC no 40394), utilizando uma sonda sintética derivada da sequência HCV do clone CA290a (Fig. 11). A sequência da sonda era:
5' TCA GAT CGT TGG TGG AGT TTA CTT GTT GCC 3’.
A sequência do cDNA de HCV nó CA205a, representada na Fig. 13, sobrepõe-se com as sequências de cDNA dos clones ag30a e CA290a. A sobreposição da sequência com a de CA290a está representada pela linha a tracejado acima da sequência (a figura mostra também os supostos aminoácidos codificados neste fragmento).
Conforme foi observado a partir das sequências de cDNA de HCV nos clones CA205a e ag30a. a poliproteina HCV suposta parece começar no codão iniciador ATG; as sequências HCV em ambos os clones contém um codão de paragem duplo e contiguo (TGATAG) quarenta e dois nucleótidos a montante deste ATG. 0 ORF do HCV parece começar depois destes codões de paragem, e prolongar-se pelo menos 8907 nucleótidos (ver o cDNA do HCV composto mostrado na Fig. 17).
Isolamento e Sequenciaçâo do Clone I8g
Com base na sequência do clone ag30a (ver Fig. 12) e de um clone sobreponivel do património lambda-gtll original (ATCC no 40394), contruiu-se CA230a, uma sonda sintética com a seguinte sequência:
5' CCA TAG TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGT ACA 3'.
A pesquisa do património lambda-gtll original de cDNA de HCV com esta sonda deu origem ao clone 18g, cuja sequência do cDNA HCV é representada na Fig. 14. Também representada na figura está a sobreposição com o clone ag30a, e o suposto polipéptido codificado no interior do cDNA de HCV.
cDNA do clone 18g (C18g ou 18g) sobrepõe-se ao dos clones ag30a e CA205a, atrás descritos. A sequência de C18g também contém a região do duplo codão de paragem observada no clone ag30a. A região de polinucleótido, a montante destes codões de paragem, representa, possivelmente, parte da região 5'do genoma do HCV, que podem conter curtos ORs, o que pode ser confirmado por sequenciaçâo directa do genoma de HCV purificado. Estes pequenos polipéptidos supostos codificados podem desempenhar um papel regulador na tradução. A região do genoma do HCV a montante da representada pelo C18g pode ser isolada por análise sequencial utilizando essencialmente a técnica descrita na EPO Pub. no 318,216, para o isolamento de sequências de cDNA, a montante da sequência HCV de cDNA no clone 12f. Essencialmente, são sintetizados pequenos oligonucleótidos sintéticos iniciadores da trancritase reversa, com base na sequência do C18g, e utilizam-se para ligar à correspondente sequência genómica no RNA do HCV. As sequências iniciadoras são próximas do terminal 5' conhecido de C18g, mas suficientemente a jusante para permitir a construção de sequências de sondas a montante das sequências iniciadoras. Utilizam-se métodos padrão conhecidos de impressão e clonagem. Os patrimónios de cDNA resultantes são pesquisados com sequências a montante dos sitios de iniciação (conforme deduzido a partir da sequência apresentada de C18g).
RNA do genoma do HCV é obtido a partir de amostras de plasma ou de figado de indivíduos com NANBH. Uma vez que o HCV parece ser semelhante aos Flavivirus, a extremidade 5’do genoma pode ser modificada com uma estrutura tipo cap. Sabe-se que os genomas de Flavivirus contêm estruturas cap nas extremidades 5' (virus da Febre Amarela, Rice et al, 1988; virus de Dengue,
Hahn et al, 1988; virus da encefalite japonesa, 1987).
Isolamento e Sequênciação de Clones do
Património do cDNA do beta-HCV
Isolaram-se clones contendo cDNA representativo da extremidade 3'do genoma de HCV a partir de um património de cDNA constituido a partir do lote original de plasma infeccioso chimpanzé que se utilizou para a criação do património lambdagtll de cDNA de HCV (ATCC no 40394), descrita em EPO Pub. no
318,216. A fim de criar o património de DNA, adicionou-se, com de ?!
poli (rA) polimerase, uma cauda de poli rA a RNA extraido do plasma. Sintetizou-se cDNA utilizando oligo(dT)12-I8 como iniciador para a trancritase reversa. 0 hibrido RNA:cDNA resultante digerido com RNAse H, e convertido num cDNA de HCV de cadeia dupla, o cDNA do HCV resultante foi clonado em lambda-gtlO, utilizando essencialmente a técnica descrita em Huynh (1985), obtendo-se o património beta (ou b) de cDNA de HCV. Os procedimentos foram os que se descrevem a seguir.
Uma aliquota (12 ml) do plasma foi tratada com proteinase K, e extraida com um volume igual de fenol saturado com 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,05% (v/v) de betamercaptoetanol , 0,1% (p/v) de hidroxiquinolona, 1 mM EDTA. A fase aquosa resultante foi reextaida com a mistura fenólica, seguindo-se 3 extracções com uma mistura de 1:1 contendo fenol e clorofórmio:álcool isoamilico (24:1), seguindo-se 2 extracções com uma mistura de clorofórmio e álcool isoamilico (1:1). A seguir a um ajustamento da fase aquosa para 200 mM quanto ao NaCl, deixou-se durante a noite para precipitar os ácidos nucleicos a -20°C, com 2,5 volumes de etanol absoluto frio. Os precipitados foram recolhidos por centrifugação a 10.000 RPM durante 40 min, lavados com etanol a 70% contendo 20 mM NaCl, e com 100% de etanol frio, secos durante 5 min num excicador, e dissolvidos em água.
Ligaram-se caudas de poli rA aos ácidos nucleicos isolados a partir do plasma infeccioso de chimpanzé, utilizando poli-A polimerase em presença de inibidor da ribonuclease extraido de placenta humana (HPRI) (adquirido à Amersham Corp. ), com MS2 RNA como transportador. Incubaram-se ácidos nucleicos isolados equivalentes à quantidade presente em 2ml de plasma numa solução contendo TMN (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl2, 250 mM NaCl, 2,5 mM MnCl2, 2 mM ditiotreitol (DTT)), 40 micromolar alfa-[32P]ATP, 20 unidades de HPRI (Amersham Corp.), e cerca de 9 a 10 unidades de polimerase poli-A sem RNase (BRL) . A incubação foi de 10 min a 37°C, e as reacções paradas com EDTA (concentração final cerca de 250 mM) . A solução foi extraida com um volume igual de fenol-clorofórmio, e com um volume igual de clorofórmio, e os ácidos nucleicos deixados a precipitar durante a noite a -20°C com 2,5 volumes de etanol em presença de 200 mM NaCl.
Isolamento do Clone b5a
Fez-se uma pesquisa do património de cDNA beta HCV por hibridização com uma sonda sintética, com uma sequência baseada na sequência do cDNA de HCV do clone 15e. 0 isolamento do clone 15e é descrito em EPO Pub. no 318,216, e a sua sequência está representada na Fig. 3. A sequência da sonda sintética era:
5' ATT GCG AGA TCT ACG GGG CCT GCT ACT CCA 3'
A pesquisa do património deu origem ao clone beta-5a (b5a), que contém uma região de cDNA de HCV de cerca de 1000 pares de bases. A região 5' deste cDNA sobrepõe-se aos clones 35f, 19g, 26g e 15e (estes clones foram descritos atrás). A região entre a sequência poli-A no extremo 3'e a sequência 3' que se sobrepõe ao clone 15e, contém aproximadamente 200 pares de bases. Este clone permite a identificação de uma região da
sequência da extremidade 3'do genoma do HCV.
A sequência do b5a está contida na sequência do cDNA de HCV no clone 16jh (descrito adiante). Além disso, esta sequência está também presente em CC34a, isolado a partir do património lambda-gtll original (ATCC no 40394) . (O património lambda-gtll original é aqui referido como o património C).
Isolamento e Sequenciação dos Clones Originados por
Amplificação com PCR da Região 3'do Genoma do HCV
Originaram-se muitos clones de cDNA que contém sequências de nucleótidos derivadas da região 3'do genoma do HCV. Isto efectuou-se amplificando uma região escolhida do genoma por meio de uma técnica de reacção da cadeia com uma polimerase (Polimerase Chain Reaction, PCR), descrita em Saiki et al (1986), e em Saiki et al (1988), que foi modificada conforme se descreve a seguir. O RNA do HCV, que foi amplificado, foi obtido a partir do plasma infeccioso de chimpanzé original que se utilizou para a criação do património lambda-gtll de cDNA de HCV (ATCC no 40394) descrita na EPO Pub. no 318,216. O isolamento do RNA de HCV foi feito conforme decrito anteriormente. O RNA isolado foi dotado de uma cauda na extremidade 3'com ATP por poli-A polimerase de E. coli, conforme descrito em Sippel (1973), com a diferença de que os ácidos nucleicos isolados de soro de chimpanzé substituíram o substrato de ácido nucleico. 0 RNA com cauda de poli-A foi seguidamente transcrito reversamente em cDNA por transcritase reversa, utilizando um adaptador ao iniciador oligo-dT, essencialmente conforme descrito por Han (1987), com a excepção que os componentes e sequência do adaptadoriniciador eram:
Stuffer Notl
Promotor SP6
Iniciador
AAATC GCGGCCGC CATACGATTTAGGTGACACTATAGAA T15 cDNA resultante foi sujeito a amplificação por PCR utilizando dois iniciadores:
Iniciador
Sequência
JH32 (30mer) JH11 (20mer)
ATAGCGGCCGCCCTCGATTGCGAGATCTAC
AATTCGGGGCGGCCGCCATACGA iniciador JH32 continha 20 sequências de nucleótidos hibridizáveis com a extremidade 5'da região alvo no cDNA, com um Tm calculado de 66°C. JH11 foi derivado de uma porção do adaptador do iniciador oligo-dT; assim, é especifico para a extremidade 3'do cDNA com uma Tm de 64°C. Ambos os iniciadores foram projectados para possuir um sitio de reconhecimento para o enzima de restrição, Notl, na extremidade 5', para utilização na clonagem posterior do cDNA de HCV amplificado.
A reacção PCR foi efectuada suspendendo o cDNA e os iniciadores em 100 microlitros de mistura reaccional contendo os quatro trifosfatos de desoxinucleósido, sais tamponizantes e iões metálicos, e uma DNA polimerase termoestável isolada de Thermus aquaticus (Taq polimerase), que fazem parte de um kit Perkin Elmer Cetus PCR (N801-0043 ou N801-0055). A reacção PCR foi realizada durante 35 ciclos num ciclizador térmico de DNA (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler). Cada ciclo consistiu de um passo de desnaturação de 1,5 min a 94°C, um passo de hibridiaçâo a 60°C durante 2 min, e um passo de extensão do iniciador a 72°C durante 3 min. Os produtos do PCR foram sujeitos a uma análise, por análise por transferência de Southern , utilizando uma sonda de 30 nucleótidos, JH34, cuja sequência se baseou na da região da extremidade 3'do clone 15e. A sequência de JH34 é:
5' CTT GAT CTA CCT CCA ATC ATT CAA AGA CTC 3' .
Os produtos do PCR detectados pela sonda de cDNA de HCV estavam compreeendidos numa gama entre 50 e 400 pares de bases.
Afim de clonar o cDNA de HCV amplificado, os produtos do PCR foram clivados com Notl e escolhidos quanto à dimensão por electroforese em gel de poliacrilamida. 0 DNA maior que 300 pares de bases foi cionado no sitio Notl do pUC18S. 0 vector pUC18S é construído por inclusão de um polylinker de Notl cionado entre os sitios EcoRI e Sall do pUC18. Os clones foram triados para identificação de cDNA de
HCV utilizando a sonda JH34. Obteve-se uma série de clones positivos, que foram sequenciados. A sequência nucleotídica do cDNA de HCV inserido num destes clones, 16jh, e os aminoácidos por ela codificados, estão representados na Fig. 15. Está indicada na Figura uma heterogeneicidade em nucleótidos, detectada na sequência do cDNA de HCV no clone 16jh, quando comparada com outro clone nesta região.
Sequêncas de DNA Compiladas
Foi feita a compilação de uma sequência de cDNA de HCV, a partir de uma série de clones com sobreposição, derivados a partir das vários patrimónios de cDNA de HCV atrás descritos. Nesta sequência, a sequência de cDNA de HCV obtida a partir dos clones bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA15e, CA84a e CA59a encontra-se a montante da sequência de cDNA de HCV compilada publicada em EPO Pub. no
318.216, e que está representada na Fig. 16. A sequência compilada de cDNA de HCV obtida a partir dos clones b5a e 16jh está a jusante da sequência de cDNA de HCV compilada publicada em EPO Pub. no 318,216.
A Fig. 17 representa a sequência de cDNA de HCV compilada derivada a partir dos clones atrás descritos e a sequência de cDNA de HCV compilada publicada na EPO Pub. no
318.216. Os clones a partir dos quais a sequência foi derivada são bll4a, 18g, ag30a, CA205a, CA290a, CA216a, pil4a, CA167b, CA156e, CA84a, CA59a, K9-1 (também chamado k9-l), 26j, 13i, 12f, 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, 15e, b5a e 16jh. Na Figura, os três traços acima da sequência indicam a posição do codão de metionina iniciador putativo.
clone bll4a foi obtido utilizando o procedimento de clonagem descrito atrás para o clone b5a, com a excepção de que a sonda era a sonda sintética utilizada para detectar o clone 18g, também descrita atrás. O clone bll4a sobrepõe-se com os clones 18g, ag30a e CA205a, excepto que o clone bll4a contém dois nucleótidos extra, a montante da sequência do clone 18g (isto é, 5'-CA). Estes dois nucleõtidos extra foram incluídos na sequência genómica da HCV mostrada na Fig.17.
E de realçar que, embora vários dos clones atrás descritos tenham sido obtidos a partir de patrimónios distintos do património original lambda-gtll C de cDNA de HCV (ATCC no 40394), estes clones contêm sequências de cDNA de HCV que se sobrepõem a sequências de cDNA de HCV do património original. Assim, essencialmente toda a sequência do HCV é derivãvel a partir do património de cDNA de HCV original, lambda-gtll C (ATCC no 40394) que foi utilizada para isolar o primeiro clone de cDNA de HCV (5-1-1). 0 isolamento do clone
5-1-1 é descrito em EPO Pub. no 318,216.
Purificação do Polipéptido de Fusão C100-3 (Método Alternativo
O polipéptido de fusão C100-3 (também chamado HCV clOO-3 ou, alternativamente, cl00-3), consiste em superóxido dismutase (SOD) na extremidade N e um polipéptido in-frame C100 de HCV na extremidade C. Na EPO Pub. no 318,216 descrevese um método para preparar este polipéptido por expressão em levedura e extraeção diferencial da fraeção insolúvel das células hospedeiras extraídas. A seguir descreve-se um método alternativo para a preparação deste polipéptido de fusão. Neste método, o antigénio é precipitado do lisado celular bruto com acetona; o antigénio precipitado com acetona é posteriormente sujeito a cromatografia de troca iónica, e, posteriormente, purificado por filtração em gel.
polipéptido de fusão C100-3 (HCV clOO-3) é
Μ aproximadamente rebentadas são expresso na estirpe de levedura JSC 308 (ATCC nq 20879) transformada com pAB24C100-3 (ATCC nq 67976); a levedura transformada é crescida em condiçOes que permitem expressão (isto é, por crescimento em YEP contendo 1% de glucose) (ver EPO Pub. nq 318,216). Prepara-se um lisado celular suspendendo as células em Tampão A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). As células são quebradas por trituração com esferas de vidro, num homogenizador tipo Dynomill ou num homogenizador correspondente. O grau de rebentamento celular é controlado contando as células num microscópio de contraste de fase. As células rebentadas são escuras, enquanto que as células viáveis têm uma cor clara. A percentagem de células quebradas é determinada.
Quando a percentagem de células rebentadas é de 90% ou mais, os resíduos das células separados das esferas de vidro por centriugaçâo, e as células de vidro são lavadas com tampão A. Após a adição do homogenato e do tampão resultante das lavagens, o material insolúvel no lisado é obtido por centrifugação. 0 material no depósito pellet é lavado para retirar as proteinas solúveis, por suspensão em Tampão B (50 mM glicina pH 12,0, 1 mM DTT, 500 mM NaCl), seguindo-se o Tampão C (50 mM glicina pH 10,0, 1 mM DTT). 0 material insolúvel é recuperado por centrigação, e solubilizado por suspensão em Tampão C contendo SDS. A solução do extracto pode ser aquecida em presença de beta-mercaptoetanol e concentrada por ultrafiltraçâo. O HCV cl00-3 presente no etracto é precipitado com acetona fria. Se se desejar, o precipitado pode ser armazenado a temperaturas de cerca de, ou abaixo de,
-15°C.
Posteriormente à cromatografia de troca iónica, o material precipitado com acetona é recuperado por centrifugação, e pode ser seco numa atmosfera de azoto. 0 precipitado é suspendido em Tampão D (50 mM glicina pH 10,0, 1 mM DTT, 7 M ureia), e centrifugado de modo a obter um material de pellet insolúvel. 0 sobrenadante é aplicado a uma coluna de troca iónica previamente equilibrada com Tampão D. Recolhem-se fracções que são analisadas por absorção no ultravioleta ou por electroforese em géis de SDS poliacrilamida. As fracções contendo o polipéptido HCV cl00-3 são recolhidas num lote comum.
Afim de purificar o polipéptido HCV cl00-3 por filtração em gel, as fracções recolhidas da coluna de troca iónica são aquecidas em presença de beta-mercaptoetanol e SDS, e o eluido é concentrado por ultrafiltração. 0 concentrado é aplicado a uma coluna de filtração em gel previamente equilibrada com Tampão E (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM DTT, 0,1% SDS). A presença de HCV cl00-3 nas fracções eluidas, bem como a presença de impurezas, são determinadas por electroforese em géis de poliacrilamida em presença de SDS e visualização dos polipéptidos. As fracções que contenham HCV cl00-3 purificado são recolhidas. Fracções que tenham um elevado conteúdo em HCV cl00-3 podem ser sujeitas a uma nova purificação repetindo o processo de filtração em gel. Se se pretender a remoção de material em partículas, o material contendo HCV cl00-3 pode ser filtrado através de um filtro de
0,22 micron.
Expressão e Antigenicidade de Polipéptidos
Codificados pelo cDNA de HCV
Polipéptidos Expressos em E. coli
Os polipéptidos codificados por uma variedade de cDNAs de HCV que abarcam o ORF genómico do HCV foram expressos em E. coli e testados quanto à sua antigenicidade, utilizando soro obtido a partir de indivíduos com NANBH. Os vectores de expressão contendo os cDNAs de HCV clonados foram construídos a partir de pSODcfl (Steimer et al, 1986). A fim de garantir um molde de leitura correcto, criaram-se três vectores de expressão separados, pcflAB, pcflCD e pcflEF, ligando cada um de três linkers, AB, CD e EF, a um fragmento BamHI-EcoRl obtido por digestão completa do vector pSODcfl com EcoRl e BamHI, seguindo-se um tratamento com fosfatase alcalina. Os linkers foram criados a partir de seis oligómeros, A, B, C, D, E e F. Cada oligómero foi fosforilado por tratamento com cinase em presença de ATP antes da hibridizaçâo com o seu oligómero complementar. As sequências dos linkers sintéticos eram as seguintes:
(ver Pag. seguinte)
100
Nome
Sequência do DNA (5f- 3')
-Μ
A GATC CTG AAT TCC TGA TAA
B GAC TTA AGG ACT ATT TTA A
C GATC CGA ATT CTG TGA TAA
D GCT TAA GAC ACT ATT TTA A
E GATC CTG GAA TTC TGA TAA
F GAC CTT AAG ACT ATT TTA A
Cada um destes três linkers destrói o sitio
original, e cria um novo sitio EcoRI no interior do linker, mas com um molde de leitura diferente. Assim, os fragmentos EcoRI de cDNA de HCV isolados a partir dos clones, encontravam-se inseridos no vector de expressão, em três moldes de leitura diferentes.
Os fragmentos de cDNA de HCV nos clones de lambdagtll designados foram cortados dos clones por digestão com EcoRI; cada fragmento foi inserido em pcflAB, pcflCD e pcflEF. Estas construções de expressão foram posteriormente transformadas para células D1210 de E. coli, os tranformantes foram clonados, e bactérias recombinantes de cada clone foram induzidas para expressar os polipéptidos de fusão por crescimento das bactérias em presença de IPTG.
Produtos de expressão dos cDNAs de HCV indicados foram testados quanto à sua antigenicidade por pesquisa imunológica directa das colónias, utilizando uma modificação do método descrito em Helfman et al (1983). Resumidamente, conforme está representado na Fig. 18, as bactérias foram transferidas para placas, através de filtros de nitrocelulose
101 colocados em placas de ampicilina, de modo a dar cerca de 1000 colónias por filtro. As colónias foram transferidas para placas, através de filtros de nitrocelulose, e as réplicas deixadas crescer durante a noite em presença de 2 mM IPTG e ampicilina. As colónias bacterianas foram lisadas por suspensão dos filtros de nitrocelulose, durante cerca de 15 a 20 min, numa atmosfera saturada com vapor de CHCI3. Cada filtro foi depois colocado individualmente numa placa de Petri de 100 mm contendo 10 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 3% (p/v) BSA, 40 microgramas/ml de lisozima, e 0,1 microgramas/ml de DNAse. As placas foram agitadas suavemente durante, pelo menos 8 horas, à temperatura ambiente. Os filtros foram lavados em TBST (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20). Após incubação, os residuos celulares foram lavados e incubados em TBS (TBST sem Tween) contendo 10% de soro de carneiro; a incubação foi de uma hora. Os filtros foram seguidamente incubados com soro previamente tratado em TBS de indivíduos com NANBH, incluindo: 3 chimpanzés; 8 doentes com NANBH crónica, cujo soro era positivo com respeito a anticorpos ao polipéptido HCV C100-3 (descrito na EPO Pub. no 318,216, e anteriormente neste texto) (também chamado C100); 8 doentes com NANBH crónica cujo soro era negativo com respeito a anticorpos anti-ClOO; um doente convalescente cujo soro era negativo em relação aos anticorpos anti-ClOO; e 6 pacientes com NANBH adquirido na comunidade, incluindo um cujo soro era fortemente positivo com respeito aos anticorpos anti-ClOO, e outro cujo soro era marginalmente positivo com respeito aos anticorpos anti-ClOO. Os soros,
102 diluídos em TBS, foram previamente tratados com pré-absorção com hSOD. A incubação dos filtros com o soro foi de, pelo menos, duas horas. Após a incubação, os filtros foram lavados duas vezes durante 30 min com TBST. A marcação das proteínas expressas às quais se ligaram os anticorpos presentes no soro foi feita por incubação durante duas horas com anticorpo anti125 humano de carneiro marcado com I. Após lavagem, os filtros foram lavados duas vezes durante 30 minutos com TBST, secos, e autoradiografados.
Uma série de clones (ver a seguir) expressavam polipéptidos contendo epitopos de HCV que eram imunologicamente reactivos com soro de indivíduos com NANBH. Cinco destes polipéptidos eram muito imunogénicos, uma vez que anticorpos contra epitopos de HCV nestes polipétidos foram detectados em soros de muitos pacientes diferentes. Os clones codificando estes polipéptidos, e a localização do polipéptido na suposta poliproteina de HCV (em que os números dos aminoácidos começam com o codão iniciador suposto) são os seguintes: clone 5-1-1, aminoácidos 1694-1735; clone C100, aminoácidos 1569-1931; clone 33c, aminoácidos 1192-1457; clone CA279a, aminoácidos 1-84; e clone CA290a, aminoácidos 9-177. A localização dos polipéptidos imunogénicos na poliproteina de HCV suposta mostra-se imediatamente a seguir.
Clones que Codificam Polipéptidos de Reactividade Comprovada
103 com Soros de Doentes com NANBH
Clone
CA279a
CA74a
13i
CA290a
33c
40b
5-1-1
33b
25c
14c
8f
33f
33g
39c
15e
C100
Localização na poliproteina HCV (nodo aminoácido, começando com a suposta metionina iniciadora)
1-84
437-582
511-690
9-177
1192-1457
1266-1428
1694-1735
1689-1805
1916-2021
1949-2124
2054-2223
2200-3325
2287-2385
2348-2464
2371-2502
2796-2886
1569-1931
Os resultados quanto à imunogenicidade dos polipéptidos codificados pelos vários clones examinados sugere que sistemas eficientes de detecção e imunização podem incluir painéis de polipéptidos/epitopos de HCV.
Expressão de Epitopos de HCV em Leveduras Construiram-se três diferentes vectores de expressão
104
em leveduras que permitem a inserção de cDNA de HCV em três diferentes moldes de leitura. A construção de um dos vectores, pAB24C100-3, está descrita em EPO Pub. no 318,216. Nos estudos descritos a seguir, o cDNA de HCV dos clones listados acima no estudo de mapeamento da antigenicidade utilizando os produtos expressos em E. coli é substituido pelo cDNA C100 de HCV. A construção dos outros vectores substitui o adaptador descrito nos estudos de E. coli acima referidos, por um dos adaptadores seguintes:
Adaptador 1
ATT TTG AAT TCC TAA TGA G
AC TTA AGG ATT ACT CAG CT
Adaptador 2
AAT TTG GAA TTC TAA TGA G
AC CTT AAG ATT ACT CAG CT cDNA de HCV inserido é expresso em leveduras transformadas com os vectores, utilizando as condições de expressão descritas anteriormente para a expressão do polipéptido de fusão, C100-3. Os polipéptidos resultantes são pesquisados utilizando o soro de indivíduos com NANBH, do modo descrito para a pesquisa de polipéptidos imunogénicos codificados em cDNAs de HCV expressos em E. coli.
105
Comparação dos Perfis Hidrofóbicos das Poliprotelnas HCV com uma Poliproteina do Virus West Nile e com NS1 do Vírus de Dengue perfil de hidrofobicidade de um segmento de uma poliproteina HCV foi comparado com o perfil de uma poliproteina de um Flavivirus típico, o Virus West Nile. A sequência polipeptidica do virus West Nile foi deduzida a partir das sequências polinucleotidicas conhecidas que codificam as proteinas não estruturais daquele virus. A sequência da poliproteina de HCV foi deduzida a partir da sequência dos clones de cDNA sobreponiveis. Os perfis foram determinados utilizando um programa de antigénio que utiliza uma janela de 7 aminoácidos de largura (o aminoácido em questão, e 3 residuos de cada lado) para fornecer a hidrofobicidade média â volta de um dado residuo de aminoácido. Os parâmetros dando a hidrofobicidade reactiva para cada residuo de aminoácido são de Kyte e Doolittle (1982). A Fig. 19 mostra os perfis hidrofóbicos das duas poliprotelnas; as áreas correspondentes às proteinas não estruturais no virus West Nile, nsl até ns5, estão indicadas na figura. Conforme se pode ver na figura, existe uma semelhança geral nos perfis da poliproteina de HCV e na poliproteina do virus West Nile.
A sequência dos aminoácidos codificados na região 5' do cDNA de HCV mostrado na Fig. 16 foi comparada com a região correspondente de uma das estirpes do virus de Dengue, descrita anteriormente neste texto, com respeito ao perfil das regiões de hidrofobicidade e hidrofilicidade (dados não
106 apresentados). Esta comparação indicou que os polipéptidos de
HCV e de Dengue codificados nesta região, que corresponde à região que codifica NS1 (ou a uma porção dessa região), têm um perfil hidrofóbico/hidrofilico semelhante.
A semelhança entre os perfis de hidrofobicidade, em conjunção com as homologias previamente identificadas nas sequências de aminoácidos do HCV e do Flavivirus de Dengue em EPO 218,316 sugere que o HCV está relacionado com estes membros da familia dos Flavivirus.
J
Caracterização dos Supostos Polipéptidos Codificados no ORF do HCV
A sequência da cadeia com sentido do cDNA de HCV, representada na Fig. 17, foi deduzida a partir dos cDNAs de HCV sobreponiveis dos vários clones descritos em EPO Pub. no 318,216 e dos aqui descritos. Pode ser deduzido, a partir da sequência, que o genoma de HCV contém essencialmente um longo ORF continuo, que codifica uma poliproteina. Na sequência, o nucleótido número 1 corresponde ao primeiro nucleótido do codão MET iniciador; números negativos indicam que os nucleótidos estão a essa distância na direcção 5' (a montante), enquanto que números positivos indicam que os nucleótidos se encontram a essa distância na direcção 3'(a jusante). A sequência composta mostra a cadeia com sentido do cDNA do HCV.
A sequência de aminoácidos da suposta poliproteina de HCV, deduzida a partir da sequência da cadeia com sentido do cDNA do HCV, está também representada na Fig. 17, em que a
107
posição 1 começa com o suposto iniciador metionina.
Possíveis domínios proteicos da poliproteina de HCV codificada, bem como as fronteiras aproximadas, são as seguintes (os polipéptidos identificados dentro de parêntesis são aqueles que são codificados no dominio do Flavivirus):
Dominio Suposto_Fronteira Aproximada (no dos aminoácidos)
C (proteina nucleocápsido) 1-120
E (proteinas do invólucro do viriâo) e possivelmente proteinas da matriz - M 120-400
NS1 (antigénio de complemento de fixação?) 400-660
NS2 (função desconhecida) 660-1050
NS3 (protease?) 1050-1640
NS4 (função desconhecida) 1640-2000
NS5 (polimerase) 2000-? fim
Note-se, no entanto, que os perfis de hidrofobicidade (descritos atrás), indicam que o HCV diverge do modelo dos Flavivirus, particularmente no que diz respeito à região a montante do NS2. Além do mais, as fronteiras indicadas não pretendem mostrar demarcações firmes entre os polipéptidos supostos.
Perfil Hidrofilico e Antigénico do Polipéptido
Os perfis da hidrofilicidade/hidrofobicidade e
Índice antigénico da suposta poliproteina codificada pela sequência de cDNA de HCV, mostrada na Fig. 16, foram
108 determinadas por análise em computador. 0 programa para a hidrofilicidade/hidrofobicidade foi conforme descrito atrás. 0 indice antigénico resulta de um programa de computador que se baseia nos critérios seguintes: 1) probabilidade da superfície; 2) previsão da alfa-helicidade por dois métodos diferentes; 3) previsão das regiões em folha beta por dois métodos diferentes; 4) previsão das viragens em U por dois métodos diferentes; 5) hidrofilicidade/hidrofobicidade; e flexibilidade. 0 traçado dos perfis gerados pelas análises em computador estão representados na Fig. 20. No perfil de hidrofilicidade, o desvio acima da abcissa indica hidrofilicidade, e abaixo da abcissa indica hidrofobicidade. Considera-se em geral que a probabilidade de que uma região dum polipéptido seja antigénica aumenta, quando há um desvio para cima da abcissa no perfil hidrofilico e/ou antigénico. Note-se, no entanto, que estes perfis não são forçosamente indicadores do grau de imunogenicidade de um polipéptido.
Identificação de Polipéptidos Co-lineares em
HCV e Flavivirus
A sequência de aminoácidos da suposta poliproteina, codificada na cadeia com sentido do cDNA do HCV, foi comparada com as sequências de aminoácidos conhecidas em vários membros dos Flavivirus. A comparação mostra que a homologia é ligeira, mas devido às regiões em que é encontrada, é provavelmente significativa. As regiões co-lineares conservadas estão representadas na Fig. 21. Os números de aminoácidos listados abaixo das sequências representam o número na poliproteina
109 suposta do HCV (ver Fig. 17).
espaçamento entre estes motivos conservados é semelhante entre os Flavivirus e o HCV, e indica que há alguma semelhança entre o HCV e estes agentes flavivirais.
Os materiais listados a seguir estão em depósito, nos termos do Tratado de Budapeste, na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland 20852, e foram-lhes atribuídos os seguintes Números de Acesso:
lambda-gtll ATCC no Data de Depósito
Biblioteca cDNA de HCV 40394 1 Dez 1987
clone 81 40388 17 Nov 1987
clone 91 40389 17 Nov 1987
clone 1-2 40390 17 Nov 1987
clone 5-1-1 40391 18 Nov 1987
clone 12f 40514 10 Nov 1988
clone 35f 40511 10 Nov 1988
clone 15e 40513 10 Nov 1988
clone K9-1 40512 10 Nov 1988
JSC 308 20879 5 Maio 1988
pS356 67683 29 Abril 1988
Adicionalmente, foram feitos os depósitos seguintes
em 11 de Maio de 1989:
Estirpe Linkers ATCC no
D1210 (Cfl/5-1-1) EF 67967
D1210 (Cfl/81) EF 67968
D1210 (Cfl/CA74a) EF 67969
110
D1210 (Cfl/35f) AB 67970
D1210 (Cfl/279a) EF 67971
D1210 (Cf1/C36) CD 67972
D1210 (Cfl/13i) AB 67973
D1210 (Cfl/C33b) EF 67974
D1210 (Cfl/CA290a) AB 67975
HB101 (AB24/C100 #3R) 67976
Os derivados seguintes da estirpe D1210 foram
depositados em 3 de Maio de 1989:
Derivado da Estirpe ATCC no.
pCFlCS/C8f 67956
pCFlAB/C12f 67952
pCFlEF/14c 67949
pCFlEF/15e 67954
pCFlAB/C25c 67958
pCFlEF/C33c 67953
pCFlEF/C33f 679 50
pCFlCD/33g 67951
pCFlCD/C39c 67955
pCFlEF/C40b 67957
pCFlEF/CA167b 67959
As estirpes seguintes foram depositadas
Maio de 1989:
Estirpe ATCC no
Lambda-gtll(C35) 40603
Lambda-gtlO(beta-5a) 40602
lll
D1210 (C40b) D1210 (M16)
67980
67981
Após aceitação e publicação deste Pedido, como uma Patente Norte-Americana, toda a restrição à disponibilidade destes depósitos será irrevogavelmente removida; e o acesso aos depósitos designados será disponível durante a pendência do Pedido acima referido, a alguém que seja determinado pelo Comissário ter direito a esse acesso de acordo com 37 CFR 1.14 e 35 USC 1.22. Os depósitos designados serão ainda mantidos por um periodo de trinta (30) anos a partir da data de depósito, ou por cinco (5) anos a partir do último pedido pelo depósito; ou pelo tempo de vida executável da patente norteamericana, conforme o que for mais longo. Os materiais depositados aqui mencionados destinam-se apenas a maior conveniência, e não são necessários para a prática do presente invento em vista das descrições aqui contidas, e adicionalmente esses materiais são aqui incorporados para referência.
Aplicação Industrial invento, nas várias manifestações aqui reveladas, tem muitos usos industriais, alguns dos quais são os seguintes. Os cDNAs de HCV podem ser utilizados para o projecto e construção de sondas para a detecção de ácidos nucleicos de HCV nas amostras. As sondas derivadas a partir dos cDNAs podem ser usadas para detectar ácidos nucleicos de HCV em, por exemplo, reacções de sintese química. Podem também
112 ser utilizadas em programas de pesquisa para agentes antivirais, para determinar o efeito de agentes na inibição da replicação virai em sistemas de cultura celular, e em sistemas modelo animais. As sondas polinucleotidicas de HCV são também úteis na detecção de ácidos nucleicos virais em humanos, e assim, podem servir como base de diagnóstico para infecções por HCV em humanos.
Em adição ao referido acima, os cDNAs aqui estabelecidos fornecem informação e um meio para a sintese de polipéptidos contendo epitopos de HCV. Estes polipéptidos são úteis na detecção de anticorpos a antigénios de HCV. São aqui descritos uma série de ensaios imunológicos para a infecção por HCV, baseados em polipéptidos recombinantes contendo epitopos de HCV, e encontrarão utilização comercial no diagnóstico de NANBH provocada por HCV, na pesquisa de dadores de bancos de sangue para detectar hepatite infecciosa provocada por HCV, e ainda para detectar sangue contaminado de dadores de sangue infectados. Os antigénios virais terão também utilidade no controlo da eficácia de agentes antivirais em sistemas de modelo animal. Adicionalmente, os polipéptidos derivados dos cDNAs de HCV aqui revelados poderão ter utilidade como vacinas para o tratamento de infecções por HCV.
Os polipéptidos derivados a partir dos cDNAs de HCV, além dos usos acima mencionados, são também úteis para o desenvolvimento de anticorpos anti-HCV. Assim, podem ser utilizados em vacinas anti-HCV. No entanto, os anticorpos produzidos como resultado da imunização com os polipéptidos de HCV são também úteis na detecção da presença de antigénios
113 virais em amostras. Assim, podem ser utilizados para ensaiar a produção de polipéptidos HCV em sistemas quimicos. Os anticorpos anti-HCV podem também ser utilizados para controlar a eficácia de agentes antivirais em programas de pesquisa em que esses agentes sejam testados em sistemas de cultura de tecidos. Podem também ser utilizados para imunoterapia passiva, e para diagnosticar NANBH causada por HCV, permitindo a detecção de antigénio(s) viral(s) tanto em dadores de sangue como em receptores. Outra utilização importante para os anticorpos anti-HCV é a cromatografia de afinidade para a purificação de virus e polipéptidos virais. As preparações purificadas de virus e polipéptidos virais podem ser utilizadas em vacinas. No entanto, o virus purificado pode também ser útil para o desenvolvimento de sistemas de cultura celular em que haja replicação de HCV.
Polinucleótidos anti-sentido podem ser utilizados como inibidores da replicação virai.
Para conveniência, os anticorpos anti-HCV e os polipéptidos HCV, quer naturais quer recombinantes, podem ser embalados em kits.

Claims (14)

1- Um método de produção de um vector recombinante composto de uma sequência de polinucleótido derivada do cDNA do HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de uma célula hospedeira transformada com ura vector que é constituido de uma sequência
114 de cDNA do HCV derivada do cDNA do HCV existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou 156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou sendo o cDNA do HCV derivado de uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348, ou do 8659 ao 8866, na Figura 17.
(b)isolamento do vector recombinante a partir da célula hospedeira.
2- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o vector , com o qual a célula hospedeira é transformada, ser um vector de expressão constituído de uma sequência de cDNA do HCV, derivada do cDNA do HCV existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou 156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou sendo o cDNA do HCV derivado de uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348, ou do 8659 ao 8866, na Figura 17, e em que a sequência do cDNA do HCV codifica para um epitopo do HCV.
3- Um método de preparação de uma célula hospedeira transformada com um polinucleótido recombinante compreendendo uma sequência de cDNA do HCV derivada do cDNA do HCV existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil
4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou possuindo o cDNA do HCV uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348 ou do 8659 ao 8866, na figura 17, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de uma célula hospedeira passivel de transformação;
115 (b) o fornecimento do polinucleótido recombinante; e (c) a incubação de (a) com (b) sob condições que permitem a transformação da célula hospedeira com o polinucleótido.
4- Um método de produção de um polipéptido constituido por um epitopo do HCV, caracterizado pelo facto de compreender: (a) o fornecimento de uma célula hospederia transformada com um sistema de expressão recombinante compreendendo um molde aberto de leitura (ORF), de DNA,
derivado do cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV se encontra nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA 290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou em que o cDNA do HCV tem uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348 ou do 8659 ao 8866 na Figura 17, estando o ORF ligado, de forma operável, a uma sequência de controlo compatível com um hospedeiro desejado; e (b) a incubação de uma célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do polipéptido de HCV.
5- Um método de preparação de um polipéptido imunogénico
de HCV, caracterizado pelo facto de compreender; hospedeira (a) o fornecimento de uma célula trans formada com um vector de expressão recombinante
compreendendo um ORF do DNA derivado do cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é constituido de uma sequência derivada de uma sequência cDNA do HCV nos clones CA279a, ou CA74A, ou 13i, ou CA290a, ou 33c, ou 40b, ou 33b, ou 25c, ou 14c, ou 8f, ou 33f, ou 33g, ou 39c, ou 15e, e em que o ORF, é ligado, dum modo
116 operável, a uma sequência de controlo compatível com um hospedeiro desejado; e (b) a incubação da célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do polipéptido de HCV.
6- Um método de preparação de sangue isento de HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de uma amostra de sangue que se suspeita conter HCV e anticorpos anti-HCV;
(b) o fornecimento de um polipéptido imunogénico preparado de acordo com as reivindicações 4 ou 5;
(c) a incubação da amostra de (a) com o polipéptido imunogénico de (b) sob condições que permitem a formação de complexos de polipéptido de HCV-anticorpo;
(d) detecção da presença dos complexos formados na fase (c); e (e) recolher o sangue a partir do qual não foram detectados complexos em (d).
7- Um método de preparação de sangue isento de HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de ácidos nucleicos a partir de uma amostra de sangue que se suspeita conter polinucleótidos de HCV;
(b) o fornecimento de uma sonda para o HCV, sendo a sonda constituida de uma sequência de HCV derivada de um cDNA do HCV que tem uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348 ou do 8659 ao 8866, na Figura 17, (c) reacção de (a) com (b) sob condições que permitem a formação de um duplex polinucleotidico entre a
117 £
sonda e o ácido nucleico de HCV da amostra;
(d) detecção de um polinucleótido que contém a sonda, formado na fase (c); e (e) recolha do sangue a partir do qual não foram detectados complexos em (d).
8- Um método de produção de um hibridoma que produz anticorpos monoclonais anti-HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) a imunização de um indivíduo com um polipéptido imunogénico contendo um epitopo codificado num cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é derivado de um cDNA do HCV existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou em que o cDNA do HCV tem uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348, ou do 8659 ao 8866, na Figura 17; ou a imunização de um individuo com um polipéptido imunogénico preparado de acordo com a reivindicação 5;
(b) imortalização das células produtoras de anticorpos, a partir do individuo imunizado;
(c) selecção de uma célula imortalizada que produz anticorpos que reagem com um epitopo de HCV, no polipéptido imunogénico de (a) ou (b); e (d) cultura da referida célula imortalizada.
9- Um método de produção de anticorpos policlonais antiHCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) a imunização de um individuo com um polipéptido imunogénico contendo um epitopo codificado num cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é derivado do cDNA do HCV existente nos
118 clones 13i, ou 26 j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou em que o cDNA do HCV tem uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348, ou do 8659 ao 8866, na Figura 17; ou a imunização de um individuo com um polipéptido imunogénico preparado de acordo com a reivindicação 5; e (b) isolamento dos referidos anticorpos a partir do referido individuo.
10- Um método de preparação de uma vacina útil no tratamento das infecções por HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) fornecimento de um polipéptido imunogénico constituído por um epitopo de HCV codificado num cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é derivado do existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou tendo o cDNA do HCV uma sequência indicada pelos números de nucleótido do -319 ao 1348 ou do 8659 ao 8866, na Figura 17; ou imunização de um individuo com um polipéptido imunogénico preparado de acordo com a reivindicação 5;
(b) formulação do polipéptido imunogénico numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.
11- Um método de preparação de uma vacina útil no tratamento das infecções por HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de um anticorpo neutralizante dirigido contra um polipéptido constituído por um epitopo de
119
Λ ύ
HCV codificado num cDNA do HCV, em que o cDNA do HCV é derivado do existente nos clones 13i, ou 26j, ou 59a, ou 84a, ou CA156e, ou 167b, ou pil4a, ou CA216a, ou CA290a, ou ag30a, ou 205a, ou 18g, ou 16jh, ou em que o cDNA do HCV tem uma sequência indicada pelos números de nucleótidos do -319 ao 1348, ou do 8659 ao 8866, na Figura 17; ou em que o cDNA do HCV é derivado da sequência de cDNA do HCV existente no clones CA279a, ou CA74a, ou 13i, ou CA290a, ou 33c, ou 40b, ou 33b, ou 25c, ou 14c, ou 8f, ou 33f, ou 33g ou 39c, ou 15e; e (b) a formulação de anticorpos neutralizantes numa dose farmacologicamente eficaz, num excipiente farmaceuticamente aceitável.
12- Um método para a detecção de anticorpos comtra o HCV, caracterizado pelo facto de compreender:
(a) o fornecimento de uma amostra que se suspeita conter anticorpos anti-HCV;
(b) fornecimento de um polipéptido imunogénico preparado de acordo com as reivindicações 4 ou 5;
(c) incubação da amostra de (a) com o polipéptido de (b) sob condições que permitem a formação de complexos anticorpo-antigénio, entre o polipéptido de (b) e os anticorpos de (a), se existirem; e (d) detecção da presença de complexos anticorpoantigénio compreendendo o polipéptido de (b), se existirem.
13- Um método para a detecção de um antigénio um epitopo do HCV, caracterizado pelo facto de o fornecimento de uma amostra que se compreendendo compreender:
(a) suspeita
120 conter um antigénio compreendendo um epitopo do HCV;
(b) o fornecimento de anticorpos produzidos pelo método da reivindicação 9, ou pelo hibridoma produzido pelo método da reivindicação 8;
(c) a incubação da amostra de (a) com o polipéptido de (b) sob condições que permitem a formação de complexos anticorpo-antigénio entre o polipéptido de (b) e os anticorpos de (a), se existirem; e (d) detecção da presença de complexos anticorpoantigénio compreendendo os anticorpos de (b), se existirem.
14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto do polipéptido ser constituido por um péptido de HCV com a fórmula:
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