JP2927187B2 - 大腸癌の検査方法および検査薬 - Google Patents
大腸癌の検査方法および検査薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清中の血管透過性因
子（以下ＶＰＦという）の存在量を測定し、その測定値
に基づいて検査することを特徴とする大腸癌の検査方法
および測定に用いられるＶＰＦの抗体からなることを特
徴とする大腸癌検査薬に関するものである。血清中のＶ
ＰＦの存在量を測定することによる本発明の大腸癌検査
方法は、既知の各種腫瘍マーカーや便の潜血反応を用い
た場合よりも非常に高率で大腸癌患者を検出することが
でき臨床上非常に有用なものであるため、本発明は医
薬、特に検査薬、診断薬業界で有用なものであり、それ
らの業界で広く利用されるものである。
子（以下ＶＰＦという）の存在量を測定し、その測定値
に基づいて検査することを特徴とする大腸癌の検査方法
および測定に用いられるＶＰＦの抗体からなることを特
徴とする大腸癌検査薬に関するものである。血清中のＶ
ＰＦの存在量を測定することによる本発明の大腸癌検査
方法は、既知の各種腫瘍マーカーや便の潜血反応を用い
た場合よりも非常に高率で大腸癌患者を検出することが
でき臨床上非常に有用なものであるため、本発明は医
薬、特に検査薬、診断薬業界で有用なものであり、それ
らの業界で広く利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】現在、日本において大腸癌患者は年々増
加しており、早期発見のための検査方法が必要とされて
いる。大腸癌は進行が比較的緩やかであり進行癌でも治
癒切除が完全に行われれば予後は比較的良好であるが、
かなり進行するまで自覚症状が少なく確定診断時にすで
に転移や浸潤などをおこして切除不可能な場合も少なく
ない。大腸癌の検査には、便の免疫潜血反応や各種の腫
瘍マーカーが利用されているが、いずれもその陽性率は
満足出来るものではない。すなわち、大腸癌の検査のた
めに用いられている便の免疫潜血反応検査の陽性率は５
０〜６０％であり、大腸癌の腫瘍マーカーとしては Car
cinoembryonic antigen(ＣＥＡ）、ＣＡ１９-９、ＮＣ
Ｃ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮなどがあり治療効果の判定や再
発のモニターとして用いられているが、病期別腫瘍マー
カー陽性率は治癒切除可能なDukes C においてもＣＥ
Ａ、ＣＡ１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮで各々
３６％、３０％、３５％、２１％にすぎず、早期大腸癌
の発見に関して十分な腫瘍マーカーであるとは言えない
ものである（大倉久直他．大腸がんの腫瘍マーカー．Ｃ
ＲＣ１(4) ，４２-４７（１９９２））。
加しており、早期発見のための検査方法が必要とされて
いる。大腸癌は進行が比較的緩やかであり進行癌でも治
癒切除が完全に行われれば予後は比較的良好であるが、
かなり進行するまで自覚症状が少なく確定診断時にすで
に転移や浸潤などをおこして切除不可能な場合も少なく
ない。大腸癌の検査には、便の免疫潜血反応や各種の腫
瘍マーカーが利用されているが、いずれもその陽性率は
満足出来るものではない。すなわち、大腸癌の検査のた
めに用いられている便の免疫潜血反応検査の陽性率は５
０〜６０％であり、大腸癌の腫瘍マーカーとしては Car
cinoembryonic antigen(ＣＥＡ）、ＣＡ１９-９、ＮＣ
Ｃ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮなどがあり治療効果の判定や再
発のモニターとして用いられているが、病期別腫瘍マー
カー陽性率は治癒切除可能なDukes C においてもＣＥ
Ａ、ＣＡ１９-９、ＮＣＣ-ＳＴ-４３９、ＳＴＮで各々
３６％、３０％、３５％、２１％にすぎず、早期大腸癌
の発見に関して十分な腫瘍マーカーであるとは言えない
ものである（大倉久直他．大腸がんの腫瘍マーカー．Ｃ
ＲＣ１(4) ，４２-４７（１９９２））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、従来の
方法に比して非常に高率で大腸癌患者を検出することが
できる大腸癌の早期診断に役立つ検査方法および検査薬
について鋭意検討を行ったのである。
方法に比して非常に高率で大腸癌患者を検出することが
できる大腸癌の早期診断に役立つ検査方法および検査薬
について鋭意検討を行ったのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、種々検討
した結果、大腸癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦ
の存在量に顕著な差異があることを見出し、血清中のＶ
ＰＦの存在量に基づいて大腸癌の検査を行なえば、大腸
癌の早期においても、８０％以上の陽性率で大腸癌の診
断が可能になることを見い出し、本発明を完成した。す
なわち、本発明は、血清中のＶＰＦの存在量を測定し、
その測定値に基づいて検査することを特徴とする大腸癌
の検査方法に関する発明、さらには血清中のＶＰＦの存
在量をＶＰＦに対する抗体を用いて測定し、その量に基
づいて検査することを特徴とする大腸癌の検査方法およ
び血管透過性因子に対する抗体からなることを特徴とす
る大腸癌検査薬に関するものである。
した結果、大腸癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦ
の存在量に顕著な差異があることを見出し、血清中のＶ
ＰＦの存在量に基づいて大腸癌の検査を行なえば、大腸
癌の早期においても、８０％以上の陽性率で大腸癌の診
断が可能になることを見い出し、本発明を完成した。す
なわち、本発明は、血清中のＶＰＦの存在量を測定し、
その測定値に基づいて検査することを特徴とする大腸癌
の検査方法に関する発明、さらには血清中のＶＰＦの存
在量をＶＰＦに対する抗体を用いて測定し、その量に基
づいて検査することを特徴とする大腸癌の検査方法およ
び血管透過性因子に対する抗体からなることを特徴とす
る大腸癌検査薬に関するものである。
【０００５】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明は、血清中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗
体、特にはヒトＶＰＦに対する抗体を用いて測定し、そ
の量に基づいて大腸癌の有無の検査を行うというもので
あり、ＶＰＦ、即ち血管透過性因子(vascular permeabi
lity factor)とは、血管内皮細胞増殖因子(vascular en
dothelial cell growth factor,ＶＥＧＦ)と呼ばれてい
るものと同じ因子であり、下記の因子と同様に、血管新
生を誘導する因子として知られているものの一つであ
る。すなわち、ＶＰＦ以外に血管新生を誘導する因子と
して知られているものには、直接的に血管内皮細胞に作
用する物質としての塩基性線維芽細胞増殖因子(basic f
ibroblast growth factor, bＦＧＦ）、酸性線維芽細胞
増殖因子(acidic fibroblast growth factor, aＦＧ
Ｆ）、血小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived
endothelial cell growth factor, ＰＤ-ＥＣＧＦ）等
であり、また間接的に血管内皮細胞に作用する物質とし
てのtransforming growth factor-α(ＴＧＦ-α)、tran
sforming growth factor-β(ＴＧＦ-β)、angiogenin、
tumor necrosis factor-α(ＴＮＦ-α)等がある[Folkma
n,J. & Shing,Y.,J.Biol.Chem.,267:10931(1992)]。こ
れらの因子は血管新生の誘導、すなわち、毛細血管内皮
細胞の増殖、移動および組織への浸潤によって、胎児の
生長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理
的現象において重要な役割を果たしていることが知られ
ている[(Folkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]。
発明は、血清中のＶＰＦの存在量を、ＶＰＦに対する抗
体、特にはヒトＶＰＦに対する抗体を用いて測定し、そ
の量に基づいて大腸癌の有無の検査を行うというもので
あり、ＶＰＦ、即ち血管透過性因子(vascular permeabi
lity factor)とは、血管内皮細胞増殖因子(vascular en
dothelial cell growth factor,ＶＥＧＦ)と呼ばれてい
るものと同じ因子であり、下記の因子と同様に、血管新
生を誘導する因子として知られているものの一つであ
る。すなわち、ＶＰＦ以外に血管新生を誘導する因子と
して知られているものには、直接的に血管内皮細胞に作
用する物質としての塩基性線維芽細胞増殖因子(basic f
ibroblast growth factor, bＦＧＦ）、酸性線維芽細胞
増殖因子(acidic fibroblast growth factor, aＦＧ
Ｆ）、血小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived
endothelial cell growth factor, ＰＤ-ＥＣＧＦ）等
であり、また間接的に血管内皮細胞に作用する物質とし
てのtransforming growth factor-α(ＴＧＦ-α)、tran
sforming growth factor-β(ＴＧＦ-β)、angiogenin、
tumor necrosis factor-α(ＴＮＦ-α)等がある[Folkma
n,J. & Shing,Y.,J.Biol.Chem.,267:10931(1992)]。こ
れらの因子は血管新生の誘導、すなわち、毛細血管内皮
細胞の増殖、移動および組織への浸潤によって、胎児の
生長、創傷治癒、癌細胞の増殖などの生理的または病理
的現象において重要な役割を果たしていることが知られ
ている[(Folkman,J.,Cancer Res.46:467(1986)]。
【０００６】これらの血管新生を誘導する因子の内、Ｖ
ＰＦに関しては、マウス、ラット、モルモット、ウシお
よびヒトの正常または腫瘍細胞株で分泌されており、ま
た組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが
明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine R
eviews 13:18(1992)]。さらにヒトＶＰＦに関しては、
乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Me
d. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ,1
68:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新生[Ad
amis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:63
1(1993)]に関与していることが報告されている。また、
ＶＰＦは標的細胞表面に存在する受容体（flt, fms-lik
e tyrosine kinase)と結合することにより細胞内へシグ
ナルを伝達することも明らかにされているが[De Vies,
C. et. al. Science,255:989(1992)]、ＶＰＦとその受
容体との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳
細には解明されていない。
ＰＦに関しては、マウス、ラット、モルモット、ウシお
よびヒトの正常または腫瘍細胞株で分泌されており、ま
た組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在することが
明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine R
eviews 13:18(1992)]。さらにヒトＶＰＦに関しては、
乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Me
d. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ,1
68:231(1994)]、あるいは網膜疾患における血管新生[Ad
amis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:63
1(1993)]に関与していることが報告されている。また、
ＶＰＦは標的細胞表面に存在する受容体（flt, fms-lik
e tyrosine kinase)と結合することにより細胞内へシグ
ナルを伝達することも明らかにされているが[De Vies,
C. et. al. Science,255:989(1992)]、ＶＰＦとその受
容体との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳
細には解明されていない。
【０００７】ヒトＶＰＦ遺伝子についてはその cＤＮＡ
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
（以下ＶＰＦ121 といい他のものも同様にする）とＶＰ
Ｆ165 が成熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N.,
et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121
はＶＰＦ165 のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が
欠損したものであるが、ＶＰＦ121 とＶＰＦ165 の間
に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかに
ついては明らかにされてはいない。
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も推定されている。この遺伝子は１つの遺伝子からアミ
ノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数が１
２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作
られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの
（以下ＶＰＦ121 といい他のものも同様にする）とＶＰ
Ｆ165 が成熟蛋白であると言われている[(Ferrara,N.,
et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰＦ121
はＶＰＦ165 のカルボキシル末端の４４個のアミノ酸が
欠損したものであるが、ＶＰＦ121 とＶＰＦ165 の間
に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうかに
ついては明らかにされてはいない。
【０００８】血清中のＶＰＦ量の測定は、公知であるＶ
ＰＦに対するモノクローナル抗体等を用いた酵素免疫測
定法等により行うことができ、それに用いられる抗体も
公知の方法で作製することができ、またＶＰＦの抗体を
得たとの報告も少なくない(K. Jin Kim 他 NATURE VOL3
62 29 APRIL 1993 841-844) 。本発明者等も、ヒトＶＰ
Ｆ121 に対するモノクローナル抗体を数種取得し、ま
た、それらのモノクローナル抗体およびヒトＶＰＦ121
に対するポリクローナル抗体を用い酵素免疫測定法によ
りＶＰＦが測定できることを、本発明者等は明らかにし
ている（平成６年６月１０日付け特許出願；発明の名称
「ペプチド及びモノクローナル抗体」他）。
ＰＦに対するモノクローナル抗体等を用いた酵素免疫測
定法等により行うことができ、それに用いられる抗体も
公知の方法で作製することができ、またＶＰＦの抗体を
得たとの報告も少なくない(K. Jin Kim 他 NATURE VOL3
62 29 APRIL 1993 841-844) 。本発明者等も、ヒトＶＰ
Ｆ121 に対するモノクローナル抗体を数種取得し、ま
た、それらのモノクローナル抗体およびヒトＶＰＦ121
に対するポリクローナル抗体を用い酵素免疫測定法によ
りＶＰＦが測定できることを、本発明者等は明らかにし
ている（平成６年６月１０日付け特許出願；発明の名称
「ペプチド及びモノクローナル抗体」他）。
【０００９】
【作用】上記した様に、血管新生にかかわる因子は、癌
細胞の増殖において重要な役割を果たしていることが知
られており、さらにヒトＶＰＦに関しては、乳癌の血管
新生と転移や腎細胞癌の血管新生に関与していることが
知られているが、ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウシおよびヒトの正常および腫瘍細胞株のいずれに
おいても分泌されているものであり、癌患者、特に大腸
癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦの存在量に何故
かくも特異的に差異があるのか不明であるが、本発明等
の見出したその差異に基づいて癌の検査、特に早期癌の
検査ひいては診断が従来に比し高率で行なえるのであ
る。
細胞の増殖において重要な役割を果たしていることが知
られており、さらにヒトＶＰＦに関しては、乳癌の血管
新生と転移や腎細胞癌の血管新生に関与していることが
知られているが、ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウシおよびヒトの正常および腫瘍細胞株のいずれに
おいても分泌されているものであり、癌患者、特に大腸
癌患者と健常人との間で血清中のＶＰＦの存在量に何故
かくも特異的に差異があるのか不明であるが、本発明等
の見出したその差異に基づいて癌の検査、特に早期癌の
検査ひいては診断が従来に比し高率で行なえるのであ
る。
【００１０】
【実施例】以下実施例に基づいて更に詳細に説明する。 実施例１ （１）ＶＰＦモノクローナル抗体およびＶＰＦポリクロ
ーナル抗体の作製 ＶＰＦモノクローナル抗体およびＶＰＦポリクローナル
抗体の作製は単離したヒトＶＰＦ cＤＮＡをグルタチオ
ン S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ
−ＶＰＦ)として大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗
原として常法に従ってマウスモノクローナル抗体を作製
した。すなわちＧＳＴ−ＶＰＦ(１００μｇ)をフロイン
ト完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腹腔内に０日、１４日後、２５日後の３回投与するこ
とにより免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細
胞(ＳＰ2)をＰＥＧ存在下で、１分間インキュベーショ
ンすることにより細胞融合させた。得られた細胞をＨＡ
Ｔ培地〔組成：ヒポキサンチン(１×１０-4Ｍ)、アミノ
プテリン(４×１０-7Ｍ)、チミジン(１.６×１０
-5Ｍ)、ペニシリン(１００単位／ml)、牛胎児血清(２０
％)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ml)、2-メルカ
プトエタノール(２×１０-5Ｍ)を含むＲＰＭＩ１６４０
培地〕中で培養することによりハイブリドーマを選別し
た。得られたハイブリドーマは限界希釈法によりクロー
ニングした。一方ＶＰＦを産生する酵母を、単離したＶ
ＰＦ cＤＮＡを含む環状ＤＮＡを酢酸リチウム法で酵母
Ｓaccharomyces cerevisiae に導入することにより作成
し、この酵母の培養液中から陽イオン交換クロマトグラ
フィー（東ソー株式会社製ＴＳＫ−ＳＰ６５０）、硫安
沈澱及びゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社
製Ｓuperdex-７５）を用いて酵母由来のヒトＶＰＦ（以
下ＹＶＰＦとする）を調製した（特許出願；特願平０５
−２００１８１）。なお、上記ＶＰＦを産生する酵母
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７３０およびＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３７３１が付与されている。このＹＶＰＦ
とクローン化したハイブリドーマの培養上清の反応性を
酵素免疫測定法により調べ、ＹＶＰＦと反応するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。得
られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４５、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４３４６およびＦＥＲＭ Ｐ−１４３４７が付
与されている。
ーナル抗体の作製 ＶＰＦモノクローナル抗体およびＶＰＦポリクローナル
抗体の作製は単離したヒトＶＰＦ cＤＮＡをグルタチオ
ン S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ
−ＶＰＦ)として大腸菌で産生させ、得られた蛋白を抗
原として常法に従ってマウスモノクローナル抗体を作製
した。すなわちＧＳＴ−ＶＰＦ(１００μｇ)をフロイン
ト完全アジュバントと等量混合し、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腹腔内に０日、１４日後、２５日後の３回投与するこ
とにより免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細
胞(ＳＰ2)をＰＥＧ存在下で、１分間インキュベーショ
ンすることにより細胞融合させた。得られた細胞をＨＡ
Ｔ培地〔組成：ヒポキサンチン(１×１０-4Ｍ)、アミノ
プテリン(４×１０-7Ｍ)、チミジン(１.６×１０
-5Ｍ)、ペニシリン(１００単位／ml)、牛胎児血清(２０
％)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ml)、2-メルカ
プトエタノール(２×１０-5Ｍ)を含むＲＰＭＩ１６４０
培地〕中で培養することによりハイブリドーマを選別し
た。得られたハイブリドーマは限界希釈法によりクロー
ニングした。一方ＶＰＦを産生する酵母を、単離したＶ
ＰＦ cＤＮＡを含む環状ＤＮＡを酢酸リチウム法で酵母
Ｓaccharomyces cerevisiae に導入することにより作成
し、この酵母の培養液中から陽イオン交換クロマトグラ
フィー（東ソー株式会社製ＴＳＫ−ＳＰ６５０）、硫安
沈澱及びゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア社
製Ｓuperdex-７５）を用いて酵母由来のヒトＶＰＦ（以
下ＹＶＰＦとする）を調製した（特許出願；特願平０５
−２００１８１）。なお、上記ＶＰＦを産生する酵母
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７３０およびＦＥ
ＲＭ Ｐ−１３７３１が付与されている。このＹＶＰＦ
とクローン化したハイブリドーマの培養上清の反応性を
酵素免疫測定法により調べ、ＹＶＰＦと反応するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。得
られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３４５、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４３４６およびＦＥＲＭ Ｐ−１４３４７が付
与されている。
【００１１】（２）ＶＰＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
得られた腹水をプロテインＧアフィニティーカラム(MAb
Trap GII、ファルマシア社製)で処理することにより精
製したモノクローナル抗体を取得し、その中の一つのモ
ノクローナル抗体を、ＭＶ303 と命名し、以下の実験に
使用した。該ＭＶ303 抗体のクラスを抗マウス免疫グロ
ブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法に
より調べた結果、ＩgＧ2aであった。このモノクローナ
ル抗体ＭＶ303 は、ＶＰＦのアミノ酸配列の一部を示す
配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識するものであった。
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
得られた腹水をプロテインＧアフィニティーカラム(MAb
Trap GII、ファルマシア社製)で処理することにより精
製したモノクローナル抗体を取得し、その中の一つのモ
ノクローナル抗体を、ＭＶ303 と命名し、以下の実験に
使用した。該ＭＶ303 抗体のクラスを抗マウス免疫グロ
ブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法に
より調べた結果、ＩgＧ2aであった。このモノクローナ
ル抗体ＭＶ303 は、ＶＰＦのアミノ酸配列の一部を示す
配列番号１および配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識するものであった。
【００１２】（３）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 ＧＳＴ−ＶＰＦを抗原として常法によりウサギを免疫し
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーで処理することによりウ
サギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、マレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させ、
ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナ
ル抗体を得た。
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーで処理することによりウ
サギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')2を調製
し、マレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させ、
ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナ
ル抗体を得た。
【００１３】（４）酵素免疫測定法による大腸癌患者血
清中のＶＰＦ量の測定 １）比色法による測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体およびＭＶ303 抗体
を用いて血清中のＶＰＦ量を測定する方法を構築した。
すなわち、５μg/mlの抗ＶＰＦポリクローナル抗体を96
穴の酵素免疫測定用プレートに１００μlずつ入れ４℃
で一晩放置することにより抗ＶＰＦポリクローナル抗体
をプレートに吸着させた。０.１％ウシ血清アルブミン
を含むリン酸緩衝化生理的食塩水（以下ウシ血清アルブ
ミンをＢＳＡ、リン酸緩衝化生理的食塩水をＰＢＳ、ウ
シ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水をＢ
ＳＡ／ＰＢＳといいＢＳＡの濃度を語頭に示す即ち０.
１％ＢＳＡ／ＰＢＳとする）でプレートの穴を６回洗浄
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ／ＰＢＳを除いた後、Ｐ
ＢＳで２倍に希釈した血清を入れ室温で１時間放置し
た。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで６回洗浄後５μg/mlのＭ
Ｖ303 抗体（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を１００μl
ずつ入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ溶液で６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を
入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで
６回洗浄後０.２mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび
０.０１５％過酸化水素を含む０.１５Ｍクエン酸緩衝液
(pH=５.0)を入れて発色させた。反応は１０％硫酸を加
えて停止させた後、吸光度(ＯＤ490/650)を測定した。
また、同様に健常人血清中のＶＰＦ量も測定し、大腸癌
患者の結果と比較した。以上の結果をグラフにプロット
し図１に示したところ、健常人と大腸癌患者との間に明
白に有意差がみられた。さらに測定結果をステージ別に
解析して図２に示したが、その図から明らかな様にステ
ージに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこ
とから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆるス
テージの大腸癌患者を識別できることが明らかになっ
た。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値をカッ
トオフ値として検査の陽性率を求め表１および表２に示
した。それらの表から明らかな様に、本発明方法による
陽性率は、既存の大腸癌検査の陽性率（５０％〜６０
％）よりもはるかに高い５０％〜１００％を示し、本発
明の大腸癌検査方法が非常に有用であることが示され
た。
清中のＶＰＦ量の測定 １）比色法による測定 ウサギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体およびＭＶ303 抗体
を用いて血清中のＶＰＦ量を測定する方法を構築した。
すなわち、５μg/mlの抗ＶＰＦポリクローナル抗体を96
穴の酵素免疫測定用プレートに１００μlずつ入れ４℃
で一晩放置することにより抗ＶＰＦポリクローナル抗体
をプレートに吸着させた。０.１％ウシ血清アルブミン
を含むリン酸緩衝化生理的食塩水（以下ウシ血清アルブ
ミンをＢＳＡ、リン酸緩衝化生理的食塩水をＰＢＳ、ウ
シ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理的食塩水をＢ
ＳＡ／ＰＢＳといいＢＳＡの濃度を語頭に示す即ち０.
１％ＢＳＡ／ＰＢＳとする）でプレートの穴を６回洗浄
した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを穴一杯に入れ室温で１時
間放置した。穴から１％ＢＳＡ／ＰＢＳを除いた後、Ｐ
ＢＳで２倍に希釈した血清を入れ室温で１時間放置し
た。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで６回洗浄後５μg/mlのＭ
Ｖ303 抗体（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を１００μl
ずつ入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ溶液で６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マ
ウス免疫グロブリン（０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）を
入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで
６回洗浄後０.２mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび
０.０１５％過酸化水素を含む０.１５Ｍクエン酸緩衝液
(pH=５.0)を入れて発色させた。反応は１０％硫酸を加
えて停止させた後、吸光度(ＯＤ490/650)を測定した。
また、同様に健常人血清中のＶＰＦ量も測定し、大腸癌
患者の結果と比較した。以上の結果をグラフにプロット
し図１に示したところ、健常人と大腸癌患者との間に明
白に有意差がみられた。さらに測定結果をステージ別に
解析して図２に示したが、その図から明らかな様にステ
ージに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこ
とから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆるス
テージの大腸癌患者を識別できることが明らかになっ
た。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値をカッ
トオフ値として検査の陽性率を求め表１および表２に示
した。それらの表から明らかな様に、本発明方法による
陽性率は、既存の大腸癌検査の陽性率（５０％〜６０
％）よりもはるかに高い５０％〜１００％を示し、本発
明の大腸癌検査方法が非常に有用であることが示され
た。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】２）発光法による測定 ＶＰＦポリクローナル抗体（５μg/ml）を１００μl/we
llずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ／
ＰＢＳでブロッキング（室温で１時間）した後、大腸癌
患者および健常者血清（ＰＢＳで２倍希釈したもの）を
加え室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で４回洗浄後、ＭＶ303抗体（５μg/mlの０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ溶液）を１００μl/wellずつ入れ室温で１時間
反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧ（０.１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈したもの）を１００μl/
wellずつ入れ室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで４回洗浄した後、０.１１５mg/ml AMPPD (4-
Methoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro[1,2-dioxetane-
3,2'-adamantane],disodium salt)の５０mM炭酸緩衝液
(pH=９.5)を１００μl/wellずつ入れ、室温で２０分間
放置後、発光強度を測定した。以上の方法で測定した結
果をグラフにプロットし図３に示し、比色法の場合と同
様に、測定結果をステージ別に解析して図４に示した
が、比色法の場合と同じく、図から明らかな様にステー
ジに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこと
から血清中ＶＰＦ量を発光法で測定することによりあら
ゆるステージの大腸癌患者を識別できることが明らかに
なった。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値を
カットオフ値として、比色法の場合と同じく、検査の陽
性率を求め表１および表２に示した。それらの表から明
らかな様に、本発明方法による陽性率は、既存の大腸癌
検査の陽性率（５０％〜６０％）よりもはるかに高い８
０％〜１００％をステージに関係なく示し、本発明の大
腸癌検査方法が非常に有用であることが示された。以上
のことから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆ
るステージの大腸癌患者の検査が出来ることが明らかに
なり、また比色法よりも発光法の方が高率で大腸癌を検
査出来ることがわかった。
llずつ９６穴プレートにまき４℃で一晩放置した後、
０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。１％ＢＳＡ／
ＰＢＳでブロッキング（室温で１時間）した後、大腸癌
患者および健常者血清（ＰＢＳで２倍希釈したもの）を
加え室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で４回洗浄後、ＭＶ303抗体（５μg/mlの０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ溶液）を１００μl/wellずつ入れ室温で１時間
反応させた。０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩgＧ（０.１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈したもの）を１００μl/
wellずつ入れ室温で１時間反応させた。０.１％ＢＳＡ
／ＰＢＳで４回洗浄した後、０.１１５mg/ml AMPPD (4-
Methoxy-4-(3-phosphatephenyl)spiro[1,2-dioxetane-
3,2'-adamantane],disodium salt)の５０mM炭酸緩衝液
(pH=９.5)を１００μl/wellずつ入れ、室温で２０分間
放置後、発光強度を測定した。以上の方法で測定した結
果をグラフにプロットし図３に示し、比色法の場合と同
様に、測定結果をステージ別に解析して図４に示した
が、比色法の場合と同じく、図から明らかな様にステー
ジに関係なくＶＰＦ量の高い患者がみられた。このこと
から血清中ＶＰＦ量を発光法で測定することによりあら
ゆるステージの大腸癌患者を識別できることが明らかに
なった。健常人測定値の平均値＋標準偏差の２倍の値を
カットオフ値として、比色法の場合と同じく、検査の陽
性率を求め表１および表２に示した。それらの表から明
らかな様に、本発明方法による陽性率は、既存の大腸癌
検査の陽性率（５０％〜６０％）よりもはるかに高い８
０％〜１００％をステージに関係なく示し、本発明の大
腸癌検査方法が非常に有用であることが示された。以上
のことから血清中ＶＰＦ量を測定することによりあらゆ
るステージの大腸癌患者の検査が出来ることが明らかに
なり、また比色法よりも発光法の方が高率で大腸癌を検
査出来ることがわかった。
【００１７】比較例１ 実施例１と同様にして、子宮頚癌患者の血清中のＶＰＦ
量を測定したが、表３に示される様に、発光法では従来
の腫瘍マーカー程度の陽性率を示したが、比色法では低
く、従来品を凌駕することはできないものであった。な
お、健常人の中に２人、異常に高いＶＰＦ量を示したも
のがいたが、その数値から考えて、何らかの他の原因が
あると推定されるので検体からは除外した。
量を測定したが、表３に示される様に、発光法では従来
の腫瘍マーカー程度の陽性率を示したが、比色法では低
く、従来品を凌駕することはできないものであった。な
お、健常人の中に２人、異常に高いＶＰＦ量を示したも
のがいたが、その数値から考えて、何らかの他の原因が
あると推定されるので検体からは除外した。
【００１８】
【表３】
【００１９】
【発明の効果】ヒトＶＰＦ121 に対するモノクローナル
抗体およびヒトＶＰＦ121 に対するポリクローナル抗体
を用いた酵素免疫測定法を用いて血清中ＶＰＦ量を測定
することによりステージに関係なく、従来の腫瘍マーカ
ーや便の潜血反応を用いた場合よりも非常な高率で大腸
癌患者を識別診断できるという優れた効果が奏され、血
清中のＶＰＦ量に基づく検査方法という本発明は、大腸
癌の早期発見、大腸癌の病態の進行や治療効果の判定、
再発の予測などに巾広く利用できるという優れたもので
ある。
抗体およびヒトＶＰＦ121 に対するポリクローナル抗体
を用いた酵素免疫測定法を用いて血清中ＶＰＦ量を測定
することによりステージに関係なく、従来の腫瘍マーカ
ーや便の潜血反応を用いた場合よりも非常な高率で大腸
癌患者を識別診断できるという優れた効果が奏され、血
清中のＶＰＦ量に基づく検査方法という本発明は、大腸
癌の早期発見、大腸癌の病態の進行や治療効果の判定、
再発の予測などに巾広く利用できるという優れたもので
ある。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列： Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu 1 5 10 配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列： Leu Gln His Asn Lys Cys 1 5
【図１】酵素免疫測定法（発色法）により大腸癌患者お
よび健常人の血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
よび健常人の血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
【図２】図１の結果をステージ別大腸癌患者毎に解析し
た図である。
た図である。
【図３】酵素免疫測定法（発光法）により大腸癌患者お
よび健常人血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
よび健常人血清中VPF量を測定した結果を示す図であ
る。
【図４】図３の結果をステージ別大腸癌患者毎に解析し
た図である。
た図である。
フロントページの続き (56)参考文献 ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，53 （19）（1993）Ｐ4727−4735 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，36（４) （1985）ｐ473−478 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 血清中の血管透過性因子の存在量を測
定し、その測定値に基づいて検査することを特徴とする
大腸癌の検査方法。 - 【請求項２】 血管透過性因子の存在量を血管透過性
因子に対する抗体を用いて測定することを特徴とする請
求項１記載の大腸癌の検査方法。 - 【請求項３】 血管透過性因子に対する抗体からなる
ことを特徴とする大腸癌検査薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19388294A JP2927187B2 (ja) | 1994-07-27 | 1994-07-27 | 大腸癌の検査方法および検査薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19388294A JP2927187B2 (ja) | 1994-07-27 | 1994-07-27 | 大腸癌の検査方法および検査薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0843384A JPH0843384A (ja) | 1996-02-16 |
| JP2927187B2 true JP2927187B2 (ja) | 1999-07-28 |
Family
ID=16315311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19388294A Expired - Lifetime JP2927187B2 (ja) | 1994-07-27 | 1994-07-27 | 大腸癌の検査方法および検査薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2927187B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005960A1 (fr) * | 1996-08-02 | 1998-02-12 | Toagosei Co. Ltd. | Methode et reactifs pour detecter le cancer du colon |
-
1994
- 1994-07-27 JP JP19388294A patent/JP2927187B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，５３（１９）（１９９３）Ｐ４７２７−４７３５ |
| Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３６（４）（１９８５）ｐ４７３−４７８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0843384A (ja) | 1996-02-16 |
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