JPH10512672A - 心臓トロポニンｉの超高感度アッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ケミルミネッセンスによる心臓トロポニンＩの超高感度アッセイ方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 心臓トロポニンＩの超高感度アッセイ法 本発明は、ケミルミネッセンスによる心臓トロポニンＩの超高感度アッセイ法 に関する。 心筋梗塞（ＭＩＦ）は、なおも、医学的突発事故の代表であり、世界的に死亡 および心臓血管罹病の主な原因である。 全ての場合、導入された処置は、心筋組織を不可逆性壊死から保護するように 設計される。血栓崩壊または最も重要な血管形成術などの新しい治療手段により 、現今では、冠動脈循環を迅速に回復させることが可能になり、梗塞領域の大き さを制限し、死亡率および罹病率を低下させることが可能になった。 これらの治療器具は、臨床的発現開始後のより早い時期に用いられるほど、よ り有効である。この病理に立ち向かう臨床医は、ますます効果的な診断器具をも つことができるようになるべきである。 血清タンパク質、特に酵素のアッセイは、心筋梗塞の診断および再灌流の成功 または失敗の評価のために決定的な要素となった。 トロポニンは、トロポニンＣ、ＩおよびＴの３種類のタンパク質からなる筋原 線維タンパク質複合体であることが知られている。 心臓トロポニンＩは、全く心筋にのみ存在する収縮タンパク質である［Wilkin son，J．M.ら，Nature(1978)，271，p．31-35; Wade R.ら，Genomics(1990)，7 ，P．346-357］。 その生理学的役割は、カルシウムの不在下、アクチン−ミオシン複合体のＡＴ Ｐase活性を阻害することであり、したがって、筋肉収縮を予防することである ［Perry S．V.，Biochem．Soc．Trans(1979)，7，p．593-617］。 心臓を供給する動脈（冠動脈）の１つの閉塞による梗塞の間、虚血に続いて、 心筋壊死が出現し、心筋細胞の破壊および心臓トロポニンＩの血液中への放出を 生じる。したがって、トロポニンＩは、心筋梗塞に対して非常に特異的であるマ ーカーを表す。 かくして、トロポニンＩのアッセイは、最近、心筋梗塞の早期診断のために推 奨されている［Am．Heart J．(1981)，110，p．1334-1344; Molecular Immunolo gy(1992)，29(2)，p．271-278］。 さらにまた、現在、ある患者において、心筋虚血の臨界期を表す不安定なアン ギナが心筋梗塞の開始および突然死の高いリスクと関連していることが受け入れ られている。患者のこのカテゴリーについての剖検は、非常にしばしばこれらの 合併症の出現よりも先に心臓の微小梗塞が出現したことを示した［Davies M．J. ら，Circulation(1985)，71，p．699-708］。 したがって、心臓トロポニンＩのアッセイは、危険な状態の患者の検出におい て、不安定なアンギナを有する患者において、特に微小梗塞の診断のために、特 に好都合であることが明らかである。 さらにまた、トロポニンＩのアッセイは、血栓崩壊処置のモニターリングの間 に、ならびに、心臓外科手術（冠動脈バイパス、血管形成術など）の術後モニタ ーリングの間にも、再灌流の成功または失敗を確認することが認識される。トロ ポニンＩのアッセイは、また、移植後の心臓移植拒絶の診断および例えばアント ラシクリンを用いる心臓毒性治療のモニターリングにおける適用を見いだす。 トロポニンＩを測定する免疫酵素法は、すでに知られている。Larue C.ら［Mo l．Immunol．(1992)，29(2)，p．271-278; Clin．Chem．(1993)，39/6，p．972- 979］は、酵素的視覚化のために色素産生物質であるテトラメチルベンジジン（ ＴＭＢ）−Ｈ₂Ｏ₂を用いるサンドイッチ型免疫酵素アッセイのためのプロセスを 開示している。視覚化の後、４５０nmでの吸光度を記録し、該著者による検出限 界は、０.２μg／リットルである。 Bodorらによって開示されたトロポニンＩについての他の免疫酵素測定法は、 １.５〜３.１μg／リットル程度の濃度で後者を検出することができる［Bodorら ，Clin．Chem．(1992)，38/11，p．2203-2214; Adams J.ら，Circulation(1993) ，88(1)，p．101-106］。このアッセイは、酵素的視覚化のために、アルカリホ スファターゼのための色素産生物質であるｐ−ニトロフェニルホスフェートを用 い、 測定は、４０５nmで行われる。 これらのアッセイを用いると、心筋梗塞の臨床的発現の開始から約４時間後の 患者の血漿中のトロポニンＩの存在を示すことができた［Adams J.ら，Circulat ion(1993)，88(1)，p．101-106］。 しかしながら、これらの免疫酵素測定アッセイの感度は、例えば放射能の測定 に基づくアッセイなどの非常に複雑化されて使用するのが困難である方法に基づ くアッセイにより得られるよりもかなり低い［Am．Heart Journal，(June 1987) ，113(6)，p．1333-1334］。 ヒドラジン、特にジアシルヒドラジンの、環状誘導体がケミルミネッセンス試 薬として用いられることも知られている［Roswellら，Methods Enzymol．(1978) ，57，p．409-423］。これらの試薬の使用は、ある主の免疫酵素アッセイの間に 認識されるかまたは行われる［Thrope G．H．G.ら，Clin．Chem．(1985)，31，p ．1335-1341; Thrope G．H．G．ら，Medors,Enzymol．(1988)，133，p．331-353 ］（国際出願公開WO 88/00695）。さらにまた、１,２−ジオキセタンの誘導体の 酵素的分解を用いるケミルミネッセンス検出法が知られている。 しかしながら、これらの試薬の使用は、当業者が高感度アッセイの開発のため に多くの限定因子（種々のアッセイ成分の、特に、抗原／抗体系のアフィニティ ー、酵素的マーカー、基質、検出の原理など）と直面するので、集中的な研究を 必要とすることが知られている。実際、種々の試薬およびアッセイ条件の好適な 選択が必要とされる。測定バックグラウンド（バックグラウンドノイズまたはブ ランクバックグラウンド）が高い場合、または、測定についてのシグナル／ノイ ズ比が小さすぎる場合、高感度および特異的アッセイを考えることは不可能であ るということが明らかである。今、正確には、この測定バックグラウンドは、選 択される種々の試薬およびアッセイ条件に依存する。 今、ある種の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体および酵素的視覚化に適 している基質を用いて、非常に高い感度を有するトロポニンＩのケミルミネッセ ンスアッセイを行うことが可能であることが判明した。実際、本発明のプロセス を適用することにより、２〜５ng／リットル程度の感度を得ることが可能であり 、 これは、これまで知られていたトロポニンＩについての最も高感度の免疫酵素法 のものよりも４０〜約１５００倍大きな感度を表す。 本発明は、酵素的視覚化のために用いられた基質が多くのケミルミネッセンス 基質から選択されたケミルミネッセンス基質、特にジアシルヒドラジンまたは１ ,２−ジオキセタンの誘導体である、心臓トロポニンＩの定量的アッセイを可能 ならしめるサンドイッチ型免疫酵素アッセイのためのプロセスに関する。 本発明の目的は、より正確には、 ２つの抗心臓トロポニンモノクローナル抗体を用い、そのうちの１つが酵素マ ーカーとカップリングさせられ、抗体が、自然にまたは協同作用（cooperation ）を介して、心臓トロポニンＩに対する高い親和性を有し、したがって、１０^-8 Ｍ以下、好ましくは、１０^-9Ｍ以下の平衡解離定数を有し； 酵素的視覚化のために、ジアシルヒドラジンの誘導体または１,２−ジオキセ タンの誘導体であるケミルミネッセンス基質を用いること からなる、心臓トロポニンＩの免疫酵素アッセイ方法である。 実際、本発明は、アッセイしようとする試料または標準試料が酵素マーカーに カップリングした抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と、および、他の抗心 臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させられ（ここで、これらのモノクロ ーナル抗体は、自然にまたは協同作用効果を介して、１０^-8Ｍ以下、好ましくは 、１０^-9Ｍ以下の心臓トロポニンＩについての平衡解離定数を有する）、次いで 、選択されたケミルミネッセンス基質の添加により酵素的視覚化が行われ、次い で、得られた光シグナルを直接記録することからなる、心臓トロポニンＩのサン ドイッチ型定量的免疫酵素アッセイ方法に関する。 本発明のプロセスは、手動システム（診断アッセイキット）を用いて、または 、自動化システムを用いて、行われる。具体例に依存して、一段階のアッセイま たは二段階のアッセイを行うことが可能である。 一段階のアッセイについては、アッセイしようとする試料または標準試料を、 酵素マーカーに結合した抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と、および、所 望により固体支持体に結合していてもよい第２の抗心臓トロポニンＩモノクロー ナル抗体と同時に接触させる。インキュベーションおよび洗浄の後、酵素的視覚 化を行う。これは、本発明に従ってジアシルヒドラジンまたは１,２−ジオキセ タンから誘導されたケミルミネッセンス基質を添加することにより行われる。ア ッセイしようとする試料または標準試料中に存在する心臓トロポニンＩの量は、 得られた光シグナルの直接的記録により評価される。 二段階のアッセイについては、アッセイしようとする試料または標準試料を、 まず、酵素マーカーに結合した抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触 させ、次いで、インキュベーション後、所望により固体支持体に結合していても よい第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させ、次いで、再度、 インキュベーションを行うか、または、 まず、所望により固体支持体に結合していてもよい抗心臓トロポニンＩモノク ローナル抗体と接触させ、次いで、インキュベーションおよび任意の洗浄後、酵 素マーカーに結合した第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させ 、次いで、再度、インキュベーションを行う。 両者の場合、任意の洗浄を行い、次いで、ジアシルヒドラジンまたは１,２− ジオキセタンから誘導されたケミルミネッセンス基質の添加により行われる酵素 的視覚化を行う。得られた光シグナルの直接的記録により、アッセイしようとす る試料または標準試料中に存在する心臓トロポニンＩの量を評価する。 二段階のアッセイについては、好ましくは、アッセイしようとする試料および 標準的試料を、まず、酵素マーカーに結合した抗心臓トロポニンＩモノクローナ ル抗体と接触させ、インキュベーション後、固体支持体に結合した第２の抗心臓 トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させ、次いで、再度、インキュベートす る。 抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体として、心臓トロポニンＩに対して高 い親和性を有するモノクローナル抗体が使用され、その平衡解離定数は、１０^-8 Ｍ以下、好ましくは、１０^-9Ｍ以下である。心臓トロポニンＩに関する協同結合 を有するモノクローナル抗体対を用いることも可能であり、この協同作用は、心 臓トロポニンＩが既に第２抗体に結合している場合、心臓トロポニンＩに対する ２つのモノクローナル抗体のうち一方の親和性の増加を生じる（平衡解離定数＜ １０^-8Ｍ）。 好ましくは、抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体として、Clin．Chem．(1 993)，39，p．972-979に開示されているマウス１１Ｅ１２および８Ｅ１モノクロ ーナル抗体が使用される。実際、驚くべきことに、１１Ｅ１２モノクローナル抗 体は、８Ｅ１抗体に結合した心臓トロポニンＩの放出を遮断することが観察され た。この現象は、ファルマシア（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）からのＢＩＡＣＯＲＥ^TM システムを用いて、および、１１Ｅ１２抗体の存在下または不在下、８Ｅ１モノ クローナル抗体についての心臓トロポニンＩ（cＴnＩ）の会合および解離につい ての速度定数を測定することにより示された。 種々の結果を表Ｉに示す。 表Ｉにおける結果は、８Ｅ１抗体について、親和性は、心臓トロポニンＩが１ １Ｅ１２モノクローナル抗体の存在下にある場合に１０倍高いことを示す。さら に正確には、平衡解離定数は、１０倍低い（会合速度定数は、変わらない）。し たがって、協同作用は、心臓トロポニンＩに関する２つの抗トロポニンＩモノク ローナル抗体の結合について存在する。該複合体の解離を「遮断する」この効果 により、このモノクローナル抗体対を用いて、本発明の課題である免疫酵素アッ セイのためのプロセスを行うことが可能である。 コンジュゲート抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体−酵素マーカーの形成 については、酵素マーカーとして、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダ ーゼのいずれかが用いられる。 アルカリホスファターゼは、ケミルミネッセンス基質が１,２−ジオキセタン の誘導体である場合に用いられ、ペルオキシダーゼは、ケミルミネッセンス基質 がジアシルヒドラジンの誘導体である場合に用いられる。 特に、酵素マーカーとのコンジュゲートを製造するためにモノクローナル抗体 ８Ｅ１または１１Ｅ１２を用いることが可能である。好ましくは、１１Ｅ１２モ ノクローナル抗体のペルオキシダーゼとのコンジュゲートおよび８Ｅ１モノクロ ーナル抗体のアルカリホスファターゼとのコンジュゲートが製造される。 具体例によると、固体支持体として、抗心臓トロポニンＩ抗体を結合している ポリスチレン管（診断キットの場合）、または、磁性物質（特に、鉄製）である かもしくは抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体を結合している粒子（自動化 アッセイ）のいずれかを考えることができる。 抗トロポニンＩモノクローナル抗体−酵素マーカーコンジュゲートは、公知の 方法に従って製造される（J．Histochem．Cytochem．(1974)，22，p.1084-1091] 。 例えば固体相に共有結合により結合した抗トロポニンＩモノクローナル抗体の 製造もまた、文献に開示されている方法に従って行われる［J．Immunological M ethods，(1979)，31，p．231-236］。 アッセイしようとする試料または標準試料を抗心臓トロポニンＩモノクローナ ル抗体および／または酵素マーカーに結合した抗心臓トロポニンＩモノクローナ ル抗体と接触させている間、反応培地のpＨは、好ましくは、わずかに酸性であ る。pＨは、特に、５〜６であり、さらに正確には、５.４〜５.７である。pＨを 調節するために、種々の好適なバッファーまたは弱性有機酸の溶液、例えば、コ ハク酸溶液またはpＨ５.２〜５.４のバッファーなどを用いることが可能である 。 血漿または血清と抗トロポニンＩ抗体または標準試料との間のインキュベーシ ョンは、２０℃〜３７℃で行われ、インキュベーション時間は、５〜２０分の間 で変化してよい。 インキュベーション後、２℃〜３７℃の温度で、好ましくは、１０℃未満の温 度で、１回またはそれ以上の洗浄を行う。洗浄について、リン酸塩バッファー溶 液（pＨ６.８）またはトリスバッファー溶液（ｐＨ８）を用いるのが好ましい。 前記のとおり、ケミルミネッセンス基質としては、ジアシルヒドラジン誘導体 、特に、ルミノール［５−アミノ−２,３−ジヒドロ−１,４−ナフタルアジンジ オン］または１,２−ジオキセタン誘導体、特に、ルミゲンＰＰＤ［４−メトキ シ−４−(３−ホスファート−フェニル)スピロ(１,２−ジオキセタン−３−アダ マンタン−２')のナトリウム塩］のいずれかである。ルミノールを含有するルミ ネッセンス基質は、商業的に入手可能であり、例えば、アマーシャム（Ａmersha m）により販売されているルミノールＥＣＬ−免疫アッセイシグナル試薬ＲＰＮ １９０、またはベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）により 販売されているルミノールＢＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ試薬１５８２９５ ０などである。ルミノールおよび４−ヨードフェノールの混合物を含有する基質 が好ましい。ルミゲンＰＰＤを含有するルミネッセンス基質もまたは商業的に入 手可能であり、例えば、アナリティカル・ルミネッセンス・ラボラトリー（Ａna lytical Ｌuminescence Ｌaboratory）により販売されているルミ−フォス（Ｌu mi−Ｐhos）５３０などである。この試薬は、ルミゲンＰＰＤ、およびフルオレ セインから誘導される界面活性剤であるケミルミネッセンスプロモーターを含有 する。 酵素的視覚化もまた、２０℃〜３７℃の温度で行われる。ケミルミネッセンス の記録は、約２〜１０分後に行われるのが好ましい。 定量的アッセイのための校正シリーズを作成するために、精製したヒト心臓ト ロポニンＩの標準溶液（標準試料）を用いる［Larue C.ら，Clin．Chem．(1993) ,39，p．972-979］。 本発明は、１つが酵素マーカーと結合している２つの抗心臓トロポニンＩモノ クローナル抗体を用いる心臓トロポニンＩのサンドイッチ型免疫酵素アッセイの ためのケミルミネッセンス基質としてのルミノールおよびルミゲンＰＰＤの使用 であって、特に、酵素マーカーが、基質がルミノールである場合、ペルオキシダ ーゼであり、基質がルミゲンＰＰＤである場合、アルカリホスファターゼであり 、抗体（自然にまたは協同作用を介して）が、心臓トロポニンＩに対して、１０^-8 Ｍ以下の平衡解離定数を有することを特徴とする使用にも関する。 本発明の課題は、１つが酵素マーカーと結合している２つの抗心臓トロポニン Ｉモノクローナル抗体からなる心臓トロポニンＩをアッセイするためのキットで あって、該抗体（自然にまたは協同作用を介して）が、心臓トロポニンＩに対し て、１０^-9Ｍ以下の平衡解離定数を有し、ケミルミネッセンス基質が、ジアシル ヒドラジンから誘導され、好ましくは、ルミノールであるか、または、１,２− ジオキセタン誘導体、好ましくは、ルミゲンＰＰＤであることを特徴とするキッ トでもある。 以下の実施例は、本発明を限定しようとするものではなく、本発明を説明する ものである。 実施例Ｉ 自動化システムによる心臓トロポニンＩのアッセイ 免疫酵素アッセイのために用いる自動化システムは、サノフィ・ダイアグノス ティクス・パストゥール（Ｓanofi Ｄiagnostics Ｐasteur）により販売されて 該アッセイは、以下の方法で行われる：アッセイウエル中にアッセイしようと する試料５０μl、４mg／mlのマウス免疫グロブリン溶液２５μl、０.１Ｍコハ ク酸溶液１０μl、マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体８Ｅ１−アル カリホスファターゼコンジュゲート（Ｃ＝５μg／ml）５０μlを導入する。３７ ℃で５分間インキュベートした後、鉄ラテックスビーズ（ローヌ・プーラン ズに抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体１１Ｅ１２を共有結合により結合さ せる。 該混合物を３７℃で３６秒間インキュベートし、次いで、磁場により鉄ラテッ クスビーズを分離する。トリスバッファー溶液（pＨ８）により洗浄を行い、次 いで、ルミ−フォス（Ｌumi−Ｐhos^TM）５３０基質を添加する。 ３７℃で視覚化を行い、反応により生じたルミネッセンスをルミノメーターで 測定する。 全分析時間は、１５分である。 校正シリーズのために、精製したヒト心臓トロポニンＩ溶液を用いる。 校正シリーズは、０〜５０μg／lの濃度に対応して作成する。 該校正曲線により評価された該プロセスの感度は、３.５ng／lである。 実施例II 心臓トロポニンＩの免疫酵素マーカーによるアッセイ マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体８Ｅ１で被覆されたポリスチレ ン管において、２０〜０.２％トゥイーン、非特異的マウス免疫グロブリンおよ び０.１％カソン（Ｋathon）を含有するコハク酸塩バッファー溶液１５０μl、 マウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体１１Ｅ１２−ペルオキシダーゼ５ ０μl、ならびにアッセイしようとする試料および校正シリーズのために用いる 標準溶液２００μlを用いる。 校正シリーズについては、０〜２μg／lの精製したヒト心臓トロポニンＩを含 有するヒト血清を用いる。 室温で水平撹拌しつつ正確には１５分間インキュベーションを行い、次いで、 管を以下の方法で洗浄する： 管の内容物を容器中に注ぎ、管を吸収紙で拭き、 温度を高くて８℃に維持しつつ、０．１％トゥイーン２０および０.３％カソ ン（Ｋathon）を含有する０.１Ｍリン酸塩バッファー（pＨ６.８）１mlを添加す ることにより洗浄を行う。この抗体を３回繰り返す。 洗浄を行い、後者のために用いた痕跡量の溶液を除去した後、ルミノール（Ｂ ＭケミルミネッセンスＥＬＩＳＡ試薬ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehringer Ｍannheim）１００部および過酸化水素１部からなる混合物３００μlを用いて、 酵素的視覚化を行う。 培地を室温で放置し、３分後、ルミノメーターによりルミネッセンスを測定す る。各管を正確に３０秒間および正確に１０秒間記録する。 このアッセイの感度は、３ng／lである。 前記方法に従って、および、Larue C.ら［Mol．Immunol．(1992)，29(2)，p． 271-278; Clin．Chem．(1993)，39/6，p．972-979］により開示された方法に従 っ て、得られる測定についての正味のシグナル／ノイズ比の値(Ｓ−Ｎ)／Ｎを下記 表IIに示す。 本発明のプロセスを適用することにより得られる測定についてのシグナル／ノ イズ比の値は、その高い感度およびその特異性を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ポー，ベルナール フランス、エフ−34080モンペリエー、リ ュ・サント−ジュヌヴィエーヴ、ル・マ・ クロ・ニュメロー６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１つが酵素マーカーと結合している２つの抗心臓トロポニンＩモノクロー ナル抗体（ここで、該抗体は、自然にまたは協同作用を介して、心臓トロポニン Ｉに対して１０^-8Ｍ以下、好ましくは、１０^-9Ｍ以下の平衡解離定数を有する） を用い、酵素的視覚化のためにジアシルヒドラジンまたは１,２−ジオキセタン から誘導されたケミルミネッセンス基質を用いる心臓トロポニンＩのサンドイッ チ型免疫酵素アッセイ方法。 ２．以下の工程： ａ − 試料を、酵素マーカーと結合した抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗 体と、および第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させ、 ｂ − ジアシルヒドラジンまたは１,２−ジオキセタンから誘導されたケミル ミネッセン基質の添加により酵素的視覚化を行い、 ｃ − 得られた光シグナルの直接的な記録により心臓トロポニンＩの量を評価 すること からなる請求項１記載の方法。 ３．以下の工程： ａ − アッセイしようとする試料または標準試料を、酵素マーカーに結合した 抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と、および所望により固体支持体に結合 していてもよい第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と同時に接触させ 、 ｂ − 該反応混合物をインキュベートし、 ｃ − 次いで、洗浄し、 ｄ − ジアシルヒドラジンまたは１,２−ジオキセタンから誘導されたケミル ミネッセンス基質の添加により酵素的視覚化を行い、 ｅ − 得られた光シグナルの直接的な記録により、アッセイしようとする試料 中または標準試料中に存在する心臓トロポニンＩの量を評価すること からなる請求項１または２記載の方法。 ４．以下の工程： ａ − アッセイしようとする試料または標準試料を − まず、酵素マーカーに結合している抗心臓トロポニンＩモノクロー ナル抗体と接触させ、次いで、インキュベーション後、所望により固体支持体に 結合していてもよい第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体と接触させ、 再度、インキュベートするか、または、 − まず、所望により固体支持体に結合していてもよい抗心臓トロポニ ンＩモノクローナル抗体と接触させ、次いで、インキュベーションおよび任意の 洗浄の後、酵素マーカーに結合している第２の抗心臓トロポニンＩモノクローナ ル抗体と接触させ、再度、インキュベートし、 ｂ − 次いで、該反応混合物を所望により洗浄し、 ｃ − ジアシルヒドラジンまたは１,２−ジオキセタンから誘導されるケミル ミネッセンス基質の添加により酵素的視覚化を行い、 ｄ − 得られた光シグナルの直接的な記録により、アッセイしようとする試料 中または標準試料中に存在する心臓トロポニンＩの量を評価すること からなる請求項１または２記載の方法。 ５．ケミルミネッセンス基質がルミノールである請求項１〜４のいずれか１項 記載の方法。 ６．ケミルミネッセンス基質がルミゲンＰＰＤである請求項１〜４のいずれか １項記載の方法。 ７．抗トロポニンＩモノクローナル抗体がマウス１１Ｅ１２および８Ｅ１モノ クローナル抗体である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 ８．抗トロポニンＩモノクローナル抗体に結合している酵素マーカーがアルカ リホスファターゼまたはペルオキシダーゼである請求項１〜４のいずれか１項記 載の方法。 ９．酵素マーカーに結合している抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体がコ ンジュゲートマウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体１１Ｅ１２−ペルオ キシダーゼであり、ケミルミネッセンス基質がジアシルヒドラジンの誘導体であ る請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 １０．酵素マーカーに結合している抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体が コンジュゲートマウス抗心臓トロポニンＩモノクローナル抗体８Ｅ１−アルカリ ホスファターゼであり、ケミルミネッセンス基質が１,２−ジオキセタンの誘導 体である請求項１、２または４のいずかれ１項記載の方法。 １１．ケミルミネッセンス基質がルミノールおよび４−ヨードフェノールの混 合物である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 １２．５〜６、好ましくは、５.４〜５.７のわずかに酸性のpＨで、アッセイ しようとする試料または標準試料を、酵素マーカーに結合しており所望により第 ２の抗トロポニンＩ抗体に結合していてもよい抗心臓トロポニンＩモノクローナ ル抗体と接触させる請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 １３．視覚化前に用いる洗浄溶液のpＨが６.８〜８であり、温度が２℃〜３７ ℃、好ましくは、１０℃より低い請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 １４．１つがペルオキシダーゼと結合している２つの抗心臓トロポニンＩモノ クローナル抗体（該抗体は、自然にまたは協同作用を介して、心臓トロポニンＩ に対して、１０^-8Ｍ以下の平衡解離定数を有する）を用いる心臓トロポニンＩの サンドイッチ型免疫酵素アッセイのためのケミルミネッセンス基質としてのルミ ノールの使用。 １５．１つがアルカリホスファターゼと結合している２つの抗心臓トロポニン Ｉモノクローナル抗体（該抗体は、自然にまたは協同作用を介して、心臓トロポ ニンＩに対して、１０^-8Ｍ以下の平衡解離定数を有する）を用いる心臓トロポニ ンＩのサンドイッチ型免疫酵素アッセイのためのケミルミネッセンス基質として のルミゲンＰＰＤの使用。 １６．１つが酵素マーカーと結合している２つの抗心臓トロポニンＩモノクロ ーナル抗体（該抗体は、自然にまたは協同作用を介して、心臓トロポニンＩに対 して、１０^-9Ｍ以下の平衡解離定数を有する）、およびジアシルヒドラジンまた は１,２−ジオキセタンから誘導されるケミルミネッセンス基質からなる心臓ト ロポニンＩのアッセイ用キット。