CN105132383A - 抗cTnI单克隆抗体产生的杂交瘤 - Google Patents
抗cTnI单克隆抗体产生的杂交瘤 Download PDFInfo
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Abstract
抗cTnI单克隆抗体产生的杂交瘤的制备，属于免疫分析医学领域。本发明提供了一种特异性识别cTnI的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测cTnI的高灵敏度的方法。
Description
【技术领域】
本发明涉及cTnI单克隆抗体产生的杂交瘤。
【背景知识】
肌钙蛋白(Cardiactroponini)是由C、T、I3个亚单位组成的复合体，调节肌肉的收缩和舒张，cTnI是心肌细胞所特有，是复合体中的抑制亚单位，抑制肌钙蛋白连接，有防止肌肉收缩的作用。肌钙蛋白I(CardiactroponiniI，cTnI)分子量为24000，正常情况下，cTnI不能透过细胞膜进入血液循坏，当出现心悸缺血损伤时，它们能透过破损的细胞膜释放入血液，是迄今发现对心肌损伤诊断特异性和敏感性最高的标志物之一，具有以下特点：在急性心肌梗死发生后4-12小时即有明显升高，可持续4-10天。此外，心肌肌钙蛋白I对于检测急性冠状动脉综合征患者心肌缺血及危险分级具有重要意义。cTnI的检测不仅可以用来早期诊断急性心肌梗死和心绞痛等，还可以作为晚入院病人的回顾诊断和动态指标。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种抗cTnI单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测cTnI含量的方法，该方法可应用于心肌梗死的检测。以解决现有的单克隆抗体检测cTnI的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。
本发明获得了能够产生特异性识别cTnI的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株27-1与杂交瘤细胞株18-1，此2株细胞株分别在2015年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：C201592与CCTCCNO：C201593。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别cTnI的两个不同表位，通过27-1与18-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
因此，本发明提供了下面所述的1至3的内容：
1.抗cTnI的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCNO：C201592和CCTCCNO：C201593。
2.抗cTnI的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO：C201592和CCTCCNO：C201593的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为27-1和18-1。
3.如权利要求2所述的抗cTnI单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测cTnI，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCCNO：C201592杂交瘤分泌的抗体27-1和保藏号为CCTCCNO：C201593杂交瘤分泌的抗体18-1，其步骤包括：
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体27-1包被；
(2)加入待测样品孵育；
(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体18-1作为二抗，加入反应体系；
(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
(5)结果表明检测的灵敏度很高。
【附图说明】
附图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗cTnI单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。
附图2显示的是标记HRP的抗cTnI单克隆抗体滴度测量结果。
附图3显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阐述了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。
实施例1：动物免疫
选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为30ug的cTnI抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序：经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合。
实施例2：杂交瘤细胞的构建
1、骨髓瘤细胞株的培养及制备
(1)本发明采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；
(2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加10mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
2、脾细胞的制备
(1)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；
(2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加10mL的红细胞裂解液裂解10min，再加20-25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加10mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。
3、细胞融合
加强免疫后3天做细胞融合。
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1∶10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为27-1和18-1。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱中封闭培养12天。
实施例3：单克隆抗体的制备及筛选
1、单克隆抗体的制备
从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与cTnI抗原反应的单克隆抗体。
2、单克隆抗体的筛选
(1)将100uL浓度为0.5ug/mL的cTnI抗原到96孔板的每个孔格中，于4℃过夜后使其固定于固相；
(2)用150uL浓度为1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时；
(3)将100uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37℃反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37℃反应1小时；
(4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min；
(5)添加50uL浓度为0.1mol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；
(6)选出吸光度大约为3的27-1和18-1，并通过有限稀释法进行亚克隆。
3、单克隆抗体的大量制备及和纯化
将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(ProteinA)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为27-1和18-1。
4、单克隆抗体效价的测定
所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入27-1、18-1(10ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，两种mAb效价达到10-9以上(附图1所示)。
实施例4：单克隆抗体的标记及滴度的测定
将纯化出得各抗体按常规方法进行HRP标记，标记好的单克隆抗体的滴度通过下面的方法测定，将浓度为0.5ug/mL的cTnI抗原固定在96孔微板上(100uL/孔)。使用1％的牛血清白蛋白进行封闭2小时，加标记的单克隆抗体(第一孔稀释100倍)，从第二孔开始做4倍稀释，于室温下反应2小时。添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，用0.1mol/L的硫酸中止反应。测量在450nm的吸光度，按实施例3中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明具有有效的滴度(附图2所示)。
实施例5：双抗体夹心ELISA检测cTnI方法的建立
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体之一包被，0.5ug/mL的单克隆抗体以100uL/孔的量加到微孔板土，于4℃孵育24小时固定于固相；
(2)孔格使用含有0.1％Tween20的pH值为7.4的20mMPBS(PBST)，以200uL/孔的量洗涤2次。以150uL/孔的量加入1％牛血清白蛋白进行封闭2小时；
(3)孔格用PBST以200uL/孔的量洗涤4次，加入由起始浓度10ug/mL连续4倍稀释cTnI抗原，于室温温育2小时，然后加入HRP标记的另一株抗体(1∶5000；100uL/孔)并于室温温育2小时；
(4)添加TMB后，反应在室温下进行20分钟，加入0.1mol/L的硫酸来终止反应并测量450nm的吸光度；
(5)结果表明检测的灵敏度很高(附图3所示)。
Claims (3)
1.抗cTnI的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCCNO：C201592和CCTCCNO：C201593。
2.抗cTnI的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCCNO：C201592和CCTCCNO：C201593的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为27-1和18-1。
3.如权利要求2所述的抗cTnI单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测cTnI，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCCNO：C201592杂交瘤分泌的抗体27-1和保藏号为CCTCCNO：C201593杂交瘤分泌的抗体18-1，其步骤包括：
(1)以所述的两两配对的单克隆抗体27-1包被；
(2)加入待测样品孵育；
(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体18-1作为二抗，加入反应体系；
(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；
(5)结果表明检测的灵敏度很高。
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