CN113416255A - 一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用，所述抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法包括：进行小鼠免疫；构建杂交瘤细胞株；单克隆抗体制备及敏感性鉴定。本发明利用表达rFgCat L1免疫5只BALB/c小鼠，取其中抗体反应最高的小鼠，并分离脾细胞与SP 2/0细胞融合，构建阳性杂交瘤细胞株。利用该方法检测了前期经间接ELISA法检测为阳性的47份水牛血清及47份山羊血清，阳性结果符合率达72.3％及78.7％。本发明成功制备抗rFgCatL1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗夹心ELISA检测法，为研发低成本、快速诊断试剂盒提供了理论依据。

Description

一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
目前，大片形吸虫(Fasciola gigantica，Fg)是片形吸虫病(fascioliasis)的病原之一，属于食源性人兽共患寄生虫。主要宿主是地处热带及亚热带地区的奶牛、水牛、山羊等家畜。据估计，全世界畜牧业每年因片形吸虫病造成的损失超过32亿美元。另外在全球范围内，已有至少240万人感染片形吸虫病，并同时威胁着1.8亿人的健康安全，被世界卫生组织认定为最受忽视的热带病之一。在我国，大片形吸虫病主要分布在广西、云南等地。2011年10月-12月，云南省大理州宾川县出现26例以持续发热和肝损伤为主要临床表现的病例，最终确定为大片形吸虫群体感染事件。关于片形吸虫病的诊断主要分为病原学检测、分子生物学诊断及免疫学诊断。其中免疫学诊断因具备灵敏性高、特异性强、低成本等优点被广泛应用于该疾病检测的开发研究中。
组织蛋白酶L1(Cathepsin L1,Cat L1)是一种半胱氨酸蛋白酶，在许多寄生虫体内均有表达，主要由幼虫和成虫的消化道真皮上皮细胞分泌，在虫体寄生定植等过程中起到重要的作用，包括：促进虫体转化机体代谢产物，变为可吸收肽，获取养分；分解纤维连接蛋白等一系列间质物，促进虫体在宿主肠道及肝脏胆管之间的迁移；阻碍机体的免疫系统发挥作用等。此外，Cat L1也被证明可抑制机体的Th1型免疫反应，从而提高外界病原感染风险。因此关于Cat L1在寄生虫疾病免疫与防治方面的相关研究，一直是人们关注的对象之一。
近年来关于片形吸虫免疫与防治的研究一直在不断深化，但是现有的商业化诊断试剂盒存在成本较高，功能不够全面的缺点，且国内尚未有商品化试剂盒生产。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的商业化诊断试剂盒存在成本较高，功能不够全面的缺点，且国内尚未有商品化试剂盒生产。
解决以上问题及缺陷的难度为：我国商业化试剂盒制备工艺还需完善，其次筛选真实有效的检测分子工作量大且难度较高。解决以上问题及缺陷的意义为：构建以单抗隆抗体为诊断分子的检测方法，可以定量检测机体循环中特异性抗原的含量，避免假阳性的发生，更好的评估机体感染状态；其次可弥补我国针对片形吸虫病的低成本商业化试剂盒缺失问题，更好的推动国民健康及反刍兽养殖业的蓬勃发展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用。
本发明是这样实现的，一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，所述抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
步骤一，对小鼠进行免疫；
步骤二，构建杂交瘤细胞株；
步骤三，进行单克隆抗体制备及敏感性鉴定。
进一步，步骤一中，所述对小鼠进行免疫，包括：
分4次对小鼠进行免疫；在3次免疫结束7d后，尾静脉采小鼠血清；通过间接ELISA法测定血清中抗体滴度，对抗体反应最高的进行冲击免疫。
进一步，步骤二中，所述构建杂交瘤细胞株，包括：
(1)细胞融合实验采用GENMED聚乙二醇细胞融合试剂盒；提前24h制备饲养细胞，用HAT培养基重悬，按104个/孔平铺在96孔板中；在超净台内分离小鼠脾细胞，采用细胞筛研磨并用20％完全培养基重悬计数；
(2)将事前准备经计数后的SP 2/0细胞及小鼠脾细胞，按1:5的比例加入至50mL离心管中，300g离心10min，洗涤3次；加入37℃预热细胞融合剂，常温静置1min，加入终止液，300g离心10min，洗涤3次；吸弃上清，利用2％HAT培养基重悬细胞，加至预先制备含饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5％CO2培养；
(3)细胞融合后培养24h，观察细胞状态；待细胞团达肉眼可见后取上清，采用间接ELISA法检测鉴定，SP 2/0细胞培养上清做检测阴性对照；对阳性孔进行放大培养，且对强阳性孔进行亚克隆，期间对细胞及时冻存；亚克隆3次以上后，选取阳性值较高并且稳定的杂交瘤细胞株为最终的阳性杂交瘤细胞株。
进一步，步骤(2)中，SP 2/0为2×106个，小鼠脾细胞为1×107个。
进一步，步骤三中，所述单克隆抗体制备及敏感性鉴定，包括：
(1)准备8-10周龄BALB/c小鼠，注射前提前1周腹腔注射灭菌液体石蜡，500μL/只；将所制备阳性杂交瘤细胞株按1×106个/只打入小鼠腹腔；
(2)14d后，待小鼠腹部明显膨大，精神状态不佳时开始逐步抽取腹水；将杂交瘤细胞株上清和小鼠腹水稀释后，将杂交瘤细胞株上清及小鼠腹水通过间接ELISA法检测抗体效价。
进一步，步骤(2)中，所述杂交瘤细胞株上清按1:2、1:22、1:23至1:212稀释，所述小鼠腹水按1:10、1:102、1:103至1:108稀释。
进一步，步骤三中，所述单克隆抗体的鉴定，还包括单克隆抗体亚型鉴定，单克隆抗体特异性鉴定以及单克隆抗体识别抗原表位鉴定。
(1)利用GoatAnti-Mouse Ig抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型
PBS稀释rFgCat L1至浓度为2μg/mL，每孔100μL加入ELISA酶标板中，4℃孵育12h；PBST洗涤3次，加入1％BSA，100μL/孔，室温下放置1h，阻断自由结合位点；PBST洗涤3次，每空加入100μL杂交瘤上清，室温下轻摇孵育1h或4℃过夜；PBST洗涤3次，将经HRP标记的抗体亚型检测抗体，用1％BSA按1:250～1:500稀释，100μL/孔，轻摇孵育1h；PBST洗涤5次，加入显色液，室温静置20min；酶标仪读取各孔OD450nm值。
(2)采用常规Western-blot实验验证抗rFgCatL1单克隆抗体特异性
将FgESP、前后盘吸虫抗原、伊式锥虫抗原、弓形虫抗原进行SDS-PAGE电泳；一抗为抗rFgCatL1杂交瘤细胞上清，二抗为兔抗鼠-IgG酶标二抗；通过Image Lab软件查看结果。
(3)通过叠加ELISA实验，对7G6及5D5抗原识别表位进行鉴定
按2μg/mL浓度稀释天然FgESP包被酶标板；分别孵育两株单克隆抗体，所测得OD450nm值记为A1及A2；后将两株抗体等比例混合后孵育，所测OD450nm值记为A12；根据公式：AI(％)＝(A12-A1)/A2×100％；AI(％)大于30％证明两株抗体具有相加作用，识别不同抗原表位；其中，AI(％)小于30％证明两株抗体呈竞争作用，识别相同表位。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法制备得到的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的双抗体夹心ELISA的构建方法，所述双抗体夹心ELISA的构建方法包括：
采用包被缓冲液稀释单克隆抗体，包被至96孔板，100μL/孔；37℃孵育2.5h，4℃过夜；采用PBST洗涤3次，加入封闭液，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入阴阳性对照，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，加入抗rFgCatL1多克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；加入终止液，50μL/孔，并用酶标仪读取OD450nm。
进一步，所述双抗体夹心ELISA的构建方法，还包括：
(1)单抗包被浓度及抗rFgCat L1多抗稀释度的筛选
分别用0.4、2、10、50μg/mL四个浓度梯度的单抗包被96孔酶标板，抗rFgCat L1多克隆抗体按1.56、3.12、6.25、12.5、25μg/mL稀释，棋盘法加样，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件。
(2)酶标二抗最佳稀释度筛选
将山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗按1:125、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍比稀释，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件。
(3)最适封闭液筛选
封闭阶段，采用10％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、5％BSA、1％明胶分别进行封闭，计算P/N值，最大值所对应为最佳封闭液。
(4)显色时间筛选
加入显色液，37℃孵育10min、15min、20min、25min、30min、60min；计算P/N值最大值所对应条件为最佳显色时间。
(5)敏感性验证
将rFgCat L1进行梯度稀释，PBS作为阴性对照；通过所构建双抗体夹心ELISA检测方法计算各浓度下的OD450nm，得出最低抗原检测浓度，验证该方法敏感性。
(6)特异性验证
通过所构建夹心ELISA检测方法，对rFgCat L1及实验室保存有FgESP、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原、弓形虫抗原进行检测，并以PBS为阴性对照，验证方法特异性。
(7)阴阳临界值的筛选
选取20份阴性血清，通过所建测定其OD450nm，计算其平均值(X)及标准差(S)；阴阳临界值＝X+3S。
(8)临床样本检测
通过所构建的双抗夹心ELISA法，分别对实验室保存有经间接ELISA法检测为阳性的广西地区47份山羊血清及47份奶牛血清血清进行检测。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体，通过制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1(rFgCat L1)特异性单克隆抗体，构建双抗体夹心酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测方法。本发明利用前期所表达rFgCat L1免疫5只BALB/c小鼠。取其中抗体反应最高的小鼠，并分离脾细胞与SP 2/0细胞融合，构建阳性杂交瘤细胞株。结果显示：共获得8株阳性细胞株，其中两株强阳性株命名为5D5及7G6。对其进行多次亚克隆筛选及传代培养后，细胞株上清中分泌的抗体稳定，效价达29及210；所制备腹水效价分别达107及108。经鉴定两株抗体为IgG1型，轻链为Kappa型，均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretory product,ESP)。对比两株单抗的抗原结合敏感性，选择以7G6作为捕获抗体，抗rFgCatL1多克隆抗体作检测抗体建立夹心ELISA法。结果显示：7G6以2μg/mL浓度包被，抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL；酶标二抗稀释度为1:4000；5％脱脂奶粉封闭；显色时间为25min。经验证后该方法可识别最低抗原浓度为0.625μg/mL，并且不识别前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原及弓形虫抗原结合；确定阴阳临界值为：0.221。利用该方法检测了前期经间接ELISA法检测为阳性的47份水牛血清及47份山羊血清，阳性结果符合率达72.3％及78.7％。本发明成功制备抗rFgCatL1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗夹心ELISA检测法，为研发低成本、快速诊断试剂盒提供了良好的理论依据及物质基础。
本发明利用单克隆抗体制备技术构建了5D5及7G6两株抗rFgCat L1特异性单克隆抗体。并构建了大片形吸虫双抗夹心ELISA检测方法。通过对FgESP进行倍比稀释上样检测，探究方法敏感性。结果显示该方法可识别最低抗原浓度达0.625μg/mL，敏感性较好。本发明成功制备抗rFgCat L1特异性单克隆抗体5D5及7G6，并构建大片形吸虫双抗体夹心ELISA检测方法。经验证该方法具备较好的敏感性，为研发低成本、快速诊断试剂盒提供了良好的理论依据及物质基础。
本发明利用所构建方法对经间接ELISA检测结果为阳性的47份广西地区山羊血清及47份广西地区奶牛血清进行检测发现，抗原检出率达78.7％及72.3％，与间接ELISA法检测结果有所出入。判断原因是间接ELISA法通过检测抗体判定疾病的发生，不能区分既往感染及现症感染，易出现假阳性。而本方法检测目的分子为循环抗原，对于疾病的确诊及病程的判断更具敏感性。后续实验除血清样品外，可同时收集机体粪便、乳液、唾液等临床样本，进一步验证其检测效果，为商业化检测试剂盒的研制增加新的研究思路及实验依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的SDS-PAGE鉴定纯化后5D5,7G6示意图；
其中：M：蛋白分子质量；1：纯化后5D5；2：纯化后7G6。
图2是本发明实施例提供的单克隆抗体亚型鉴定示意图。
图3是本发明实施例提供的5D5、7G6杂交瘤细胞上清Western-blot检测结果示意图。
图4是本发明实施例提供的显色时间确定示意图。
图5是本发明实施例提供的阴性血清检测结果示意图。
图6是本发明实施例提供的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体及其制备方法与应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图6所示，本发明实施例提供的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
S101，对小鼠进行免疫；
S102，构建杂交瘤细胞株；
S103，进行单克隆抗体制备及敏感性鉴定。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1、本发明通过制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1(rFgCat L1)特异性单克隆抗体，构建双抗体夹心酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent,ELISA)检测方法。本发明利用前期所表达rFgCat L1免疫5只BALB/c小鼠。取其中抗体反应最高的小鼠，并分离脾细胞与SP 2/0细胞融合，构建阳性杂交瘤细胞株。结果显示：共获得8株阳性细胞株，其中两株强阳性株命名为5D5及7G6。对其进行多次亚克隆筛选及传代培养后，细胞株上清中分泌的抗体稳定，效价达29及210；所制备腹水效价分别达107及108。经鉴定两株抗体为IgG1型，轻链为Kappa型，均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretoryproduct,ESP)。对比两株单抗的抗原结合敏感性，选择以7G6作为捕获抗体，抗rFgCatL1多克隆抗体作检测抗体建立夹心ELISA法。结果显示：7G6以2μg/mL浓度包被，抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL；酶标二抗稀释度为1:4000；5％脱脂奶粉封闭；显色时间为25min。经验证后该方法可识别最低抗原浓度为0.625μg/mL，并且不识别前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原及弓形虫抗原结合。确定阴阳临界值为：0.221。利用该方法检测了前期经间接ELISA法检测为阳性的47份水牛血清及47份山羊血清，阳性结果符合率达72.3％及78.7％。本发明成功制备抗rFgCatL1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗夹心ELISA检测法，为研发低成本、快速诊断试剂盒提供了良好的理论依据及物质基础。
2、材料与方法
2.1主要材料
2.1.1生物材料
BALB/c小鼠，SPF级，6-8周龄雌鼠，购自湖南省长沙市天勤生物技术有限公司；SP2/0细胞株：广西大学动物科技学院动物寄生虫疾病与免疫学实验室，液氮保存；大片形吸虫感染水牛及山羊阳性血清：采自广西地区某养殖厂。
2.1.2主要试剂及仪器
细胞融合试剂盒：GENMED公司；DMEM基础培养基、胎牛血清、HAT等：BiologicalIndustry公司；青链霉素混合液(双抗)：Solarbio公司；单克隆抗体鉴定试剂盒：SouthernBiotech公司；特超敏ECL化学发光试剂盒，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗：碧云天生物技术公司。倒置显微镜：尼康仪器有限公司；超净工作台：苏净设备有限公司；二氧化碳培养箱：Forma Scientific公司；电热恒温水箱：北京长风有限公司；恒温培养箱：上海跃进医疗器械公司；-80℃超低温冰箱：Forma公司；细胞计数仪：美国伯乐公司；液氮罐：四川亚西橡塑机器有限公司。
2.2方法
2.2.1小鼠免疫
分4次对小鼠进行免疫。在3次免疫结束7d后，尾静脉采小鼠血清。通过间接ELISA法测定血清中抗体滴度，对抗体反应最高的进行冲击免疫，具体步骤见表1。
表1动物免疫步骤
Figure BDA0003096590870000091
2.2.2构建杂交瘤细胞株
细胞融合实验采用GENMED聚乙二醇细胞融合试剂盒。提前24h制备饲养细胞，用HAT培养基重悬，按104个/孔平铺在96孔板中；在超净台内分离小鼠脾细胞，采用细胞筛研磨并用20％完全培养基重悬计数。将事前准备经计数后的SP2/0细胞及小鼠脾细胞，按1:5的比例(SP 2/0：2×106个，小鼠脾细胞：1×107个)加入至50mL离心管中，300g离心10min，洗涤3次；加入37℃预热细胞融合剂，常温静置1min，加入终止液，300g离心10min，洗涤3次；吸弃上清，利用2％HAT培养基重悬细胞，加至预先制备含饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5％CO2培养。细胞融合后培养24h后，观察细胞状态；待细胞团达肉眼可见后取上清，采用间接ELISA法检测鉴定，SP 2/0细胞培养上清做检测阴性对照；对阳性孔进行放大培养，并且对强阳性孔进行亚克隆，期间对细胞及时冻存；亚克隆3次以上后，选取阳性值较高并且稳定的杂交瘤细胞株为最终的阳性杂交瘤细胞株。
2.2.3单克隆抗体制备及敏感性鉴定
准备8-10周龄BALB/c小鼠，注射前提前1周腹腔注射灭菌液体石蜡，500μL/只；将所制备阳性杂交瘤细胞株按1×106个/只打入小鼠腹腔；14d后，待小鼠腹部明显膨大，精神状态不佳时开始逐步抽取腹水；将杂交瘤细胞株上清(按1:2、1:22、1:23至1:212稀释)及小鼠腹水(按1:10、1:102、1:103至1:108稀释)通过间接ELISA法检测抗体效价。
2.2.4单克隆抗体亚型鉴定
利用GoatAnti-Mouse Ig抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。具体步骤：PBS稀释rFgCat L1至浓度为2μg/mL，每孔100μL加入ELISA酶标板中，4℃孵育12h；PBST洗涤3次，加入1％BSA，100μL/孔，室温下放置1h，阻断自由结合位点；PBST洗涤3次，每空加入100μL杂交瘤上清，室温下轻摇孵育1h或4℃过夜；PBST洗涤3次，将经HRP标记的抗体亚型检测抗体，用1％BSA按1:250～1:500稀释，100μL/孔，轻摇孵育1h；PBST洗涤5次，加入显色液，室温静置20min；酶标仪读取各孔OD450nm值。
2.2.5单克隆抗体特异性鉴定
采用常规Western-blot实验验证抗rFgCatL1单克隆抗体特异性：将FgESP、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原、弓形虫抗原进行SDS-PAGE电泳；一抗为抗rFgCatL1杂交瘤细胞上清，二抗为兔抗鼠-IgG酶标二抗；通过Image Lab软件查看结果。
2.2.6单克隆抗体识别抗原表位鉴定实验
参考万文徽实验方案进行叠加ELISA实验，对7G6及5D5抗原识别表位进行鉴定。具体方案为：按2μg/mL浓度稀释天然FgESP包被酶标板；分别孵育两株单克隆抗体，所测得OD450nm值记为A1及A2；后将两株抗体等比例混合后孵育，所测OD450nm值记为A12；根据公式：AI(％)＝(A12-A1)/A2×100％；AI(％)大于30％证明两株抗体具有相加作用，识别不同抗原表位。AI(％)小于30％证明两株抗体呈竞争作用，识别相同表位。
2.2.7双抗夹心ELISA方法的构建
具体步骤：采用包被缓冲液稀释单克隆抗体，包被至96孔板，100μL/孔；37℃孵育2.5h，4℃过夜；采用PBST洗涤3次，加入封闭液，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入阴阳性对照，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，加入抗rFgCatL1多克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；加入终止液，50μL/孔，并用酶标仪读取OD450nm。
2.2.7.1单抗包被浓度及抗rFgCat L1多抗稀释度的筛选
分别用0.4、2、10、50μg/mL四个浓度梯度的单抗包被96孔酶标板，抗rFgCat L1多克隆抗体按1.56、3.12、6.25、12.5、25μg/mL稀释，棋盘法加样，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件。
2.2.7.2酶标二抗最佳稀释度筛选
将山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗按1:125、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍比稀释，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件。
2.2.7.3最适封闭液筛选
封闭阶段，采用10％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、5％BSA、1％明胶分别进行封闭，计算P/N值，最大值所对应为最佳封闭液。
2.2.7.4显色时间筛选
加入显色液，37℃孵育10min、15min、20min、25min、30min、60min。计算P/N值最大值所对应条件为最佳显色时间。
2.2.8敏感性验证
将rFgCat L1进行梯度稀释，PBS作为阴性对照。通过所构建双抗体夹心ELISA检测方法计算各浓度下的OD450nm，得出最低抗原检测浓度，验证该方法敏感性。
2.2.9特异性验证
通过所构建夹心ELISA检测方法，对rFgCat L1及实验室保存有FgESP、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原、弓形虫抗原进行检测，并以PBS为阴性对照，验证方法特异性。
2.2.10阴阳临界值的筛选
选取20份阴性血清，通过所建测定其OD450nm，计算其平均值(X)及标准差(S)。阴阳临界值＝X+3S。
2.2.11临床样本检测
通过所构建的双抗夹心ELISA法，分别对实验室保存有经间接ELISA法检测为阳性的广西地区47份山羊血清及47份奶牛血清进行检测。
3、结果
3.1小鼠免疫结果
终免后小鼠状态良好，未出现死亡现象。三免后采集小鼠血清，经间接ELISA法检测，结果显示4只小鼠血清抗体滴度均大于104，达到细胞融合要求。4免后对小鼠进行剖解观察，免疫后小鼠脾脏组织较未免疫小鼠有明显增大。
3.2阳性杂交瘤细胞株构建结果
第25天后观察，细胞长势良好，融合细胞孔数达116个(总孔数为384个)；抽取细胞上清，通过间接ELISA法检测，结果显示：共有8株杂交瘤细胞上清呈阳性反应，其中5D5及7G6呈现强阳性反应，对其进行亚克隆培养，见表2；亚克隆培养结果显示，2株细胞上清阳性反应稳定，可进行扩大培养并冻存，见表3；5D5及7G6经传代培养及冻存后，细胞上清检测阳性值趋于稳定，可用于大量制备抗体，见表4。
表2 rFgCatL1阳性克隆筛选结果
Figure BDA0003096590870000131
表3连续亚克隆后杂交瘤分泌抗体稳定性
Figure BDA0003096590870000132
表4连续传代后杂交瘤分泌抗体稳定性
Figure BDA0003096590870000133
3.3抗体制备及敏感性检测结果
小鼠腹水纯化后可见除抗体外无明显杂蛋白。如图1所示抗体重链大致在50ku左右，轻链大致为20ku。经单克隆抗体鉴定试剂盒鉴定，结果显示，5D5及7G6两株抗体亚型均为IgG1型，轻链均为Kappa型，如图2所示。
3.4单克隆抗体敏感性检测结果
经间接ELISA法检测，结果显示：5D5及7G6两株细胞株细胞上清敏感达到29及210；5D5小鼠腹水敏感性达107，7G6小鼠腹水敏感性可达108，见表5。
表5间接ELISA测定抗体敏感性结果
Figure BDA0003096590870000134
3.5单克隆抗体特异性检测结果
根据Western-blot检测，结果显示，两株单抗均可与天然FgESP抗原反应，而不与前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原、弓形虫抗原反应，如图3所示。
3.6双抗夹心ELISA方法的构建结果
通过间接ELISA法检测5D5及7G6的抗原识别表位，结果显示A12＜30％，5D5及7G6识别相同表位。根据结果3.4可知，7G6抗原捕获能力优于5D5，确定其作为捕获抗体，抗rFgCat L1多克隆抗体作为检测抗体进行大片形吸虫病双抗体夹心ELISA法的构建。
3.6.17G6包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体稀释度的筛选结果
经棋盘法筛选7G6抗体包被浓度及抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度。结果显示：当7G6包被浓度在2μg/mL，抗rFgCat L1多克隆抗体浓度为25μg/mL时，所得结果P/N值最高，并且此时阴性对照值低于0.1，有利于更好的区分阴阳性。以此结果为后续检测条件，见表6。
表6 7G6和抗rFgCatL1多克隆抗体最佳稀释度
Figure BDA0003096590870000141
3.6.2酶标二抗稀释度筛选
通过倍比稀释山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗，显示当稀释度为1：4000时，P/N最高，选择该稀释度为最终条件，见表7。
表7酶标二抗稀释度选择
Figure BDA0003096590870000142
3.6.3封闭液及显色时间筛选结果
经对比5％BSA、5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉及1％明胶的包被效果，显示5％脱脂奶粉作为封闭液时P/N最高，此条件下本底值较低，更易区分阴阳性，所以选择5％脱脂奶粉为最终封闭液，见表8；根据孵育不同时间，OD标阳及OD标阴的结果表明，在孵育20min时，OD值开始趋于稳定，并且25min时的P/N达到最高。所以确定最终的底物显色时间为25min，如图4所示。
表8最佳封闭液选择
Figure BDA0003096590870000151
3.7敏感性检测结果
通过稀释rFgCat L1，并以PBS做阴性对照验证双抗夹心ELISA法的敏感性，结果显示：所能测的抗原浓度最低值为0.625μg/mL，见表9。
表9敏感性实验结果
Figure BDA0003096590870000152
3.8阴阳临界值确定结果
筛选20份阴血清测定阴阳性临界值。根据图5结果，20份阴性血清平均值(X)为0.154，标准差(S)为0.025。阴阳临界值为X+3S＝0.221，即所测样品OD450nm＞0.221即可判定为阳性。
3.9临床样本检测结果
通过所构建双抗夹心ELISA法对经间接ELISA法检测后的47份山羊阳性血清及47份奶牛阳性血清进行二次检测，结果显示山羊阳性血清的抗原检出率为78.7％，奶牛阳性血清的抗原检出率为72.3％，均存在一定的差异，见表10。
表10临床样本检测结果
Figure BDA0003096590870000153
4、讨论
我国国土面积位居世界第三位，地处北温带、热带和亚热带地区，自然条件优越。特别是南方地区，气候温和湿润，适宜中间宿主(椎实螺)生存，所以片形吸虫病感染在我国也是愈发严重。根据1988-1992年之间的全国寄生虫疾病调查情况显示，全国人感染片形吸虫病数量可达12万以上，主要城市涉及16个省份。到了2004年，数量已多达31个省市发现了片形吸虫感染病例，对我国食品安全及人民健康都造成了极大的损害。
单克隆抗体技术发明于20世纪70年代发明，由于其针对免疫疾病方面的优越性，已经广泛应用于疾病诊断及治疗等多方面领域。针对片形吸虫病的诊断研究，单克隆抗体因具备较好的抗原结合敏感性及特异性，被认为是较理想的诊断材料。本发明利用单克隆抗体制备技术构建了5D5及7G6两株抗rFgCat L1特异性单克隆抗体。并构建了大片形吸虫双抗夹心ELISA检测方法。通过对FgESP进行倍比稀释上样检测，探究方法敏感性。结果显示该方法可识别最低抗原浓度达0.625μg/mL，敏感性较好。
利用所构建方法对经间接ELISA检测结果为阳性的47份广西地区山羊血清及47份广西地区奶牛血清进行检测发现，抗原检出率达78.7％及72.3％，与间接ELISA法检测结果有所出入。判断原因是间接ELISA法通过检测抗体判定疾病的发生，不易区分既往感染及当症感染，易出现假阳性。而本方法检测目的分子为循环抗原，对于疾病的确诊及病程的判断更具敏感性。后续实验除血清样品外，可同时收集机体粪便、乳液、唾液等临床样本，进一步验证其检测效果，为商业化检测试剂盒的研制增加新的研究思路及实验依据。
本发明成功制备抗rFgCat L1特异性单克隆抗体5D5及7G6，并构建大片形吸虫双抗体夹心ELISA检测方法。经验证该方法具备较好的敏感性，为研发低成本、快速诊断试剂盒提供了良好的理论依据及物质基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
步骤一，对小鼠进行免疫；
步骤二，构建杂交瘤细胞株；
步骤三，进行单克隆抗体制备及敏感性鉴定。
2.如权利要求1所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述对小鼠进行免疫，包括：
分4次对小鼠进行免疫；在3次免疫结束7d后，尾静脉采小鼠血清；通过间接ELISA法测定血清中抗体滴度，对抗体反应最高的进行冲击免疫。
3.如权利要求1所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述构建杂交瘤细胞株，包括：
(1)细胞融合实验采用GENMED聚乙二醇细胞融合试剂盒；提前24h制备饲养细胞，用HAT培养基重悬，按104个/孔平铺在96孔板中；在超净台内分离小鼠脾细胞，采用细胞筛研磨并用20％完全培养基重悬计数；
(2)将事前准备经计数后的SP 2/0细胞及小鼠脾细胞，按1:5的比例加入至50mL离心管中，300g离心10min，洗涤3次；加入37℃预热细胞融合剂，常温静置1min，加入终止液，300g离心10min，洗涤3次；吸弃上清，利用2％HAT培养基重悬细胞，加至预先制备含饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5％CO2培养；
(3)细胞融合后培养24h，观察细胞状态；待细胞团达肉眼可见后取上清，采用间接ELISA法检测鉴定，SP 2/0细胞培养上清做检测阴性对照；对阳性孔进行放大培养，且对强阳性孔进行亚克隆，期间对细胞及时冻存；亚克隆3次以上后，选取阳性值较高并且稳定的杂交瘤细胞株为最终的阳性杂交瘤细胞株。
4.如权利要求3所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，SP 2/0为2×106个，小鼠脾细胞为1×107个。
5.如权利要求1所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述单克隆抗体制备及敏感性鉴定，包括：
(1)准备8-10周龄BALB/c小鼠，注射前提前1周腹腔注射灭菌液体石蜡，500μL/只；将所制备阳性杂交瘤细胞株按1×106个/只打入小鼠腹腔；
(2)14d后，待小鼠腹部明显膨大，精神状态不佳时开始逐步抽取腹水；将杂交瘤细胞株上清和小鼠腹水稀释后，将杂交瘤细胞株上清及小鼠腹水通过间接ELISA法检测抗体效价。
6.如权利要求5所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述杂交瘤细胞株上清按1:2、1:22、1:23至1:212稀释，所述小鼠腹水按1:10、1:102、1:103至1:108稀释。
7.如权利要求1所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述单克隆抗体的鉴定，还包括单克隆抗体亚型鉴定，单克隆抗体特异性鉴定以及单克隆抗体识别抗原表位鉴定；
(1)利用GoatAnti-Mouse Ig抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型
PBS稀释rFgCat L1至浓度为2μg/mL，每孔100μL加入ELISA酶标板中，4℃孵育12h；PBST洗涤3次，加入1％BSA，100μL/孔，室温下放置1h，阻断自由结合位点；PBST洗涤3次，每空加入100μL杂交瘤上清，室温下轻摇孵育1h或4℃过夜；PBST洗涤3次，将经HRP标记的抗体亚型检测抗体，用1％BSA按1:250～1:500稀释，100μL/孔，轻摇孵育1h；PBST洗涤5次，加入显色液，室温静置20min；酶标仪读取各孔OD450nm值；
(2)采用常规Western-blot实验验证抗rFgCatL1单克隆抗体特异性
将FgESP、前后盘吸虫抗原、伊式锥虫抗原、弓形虫抗原进行SDS-PAGE电泳；一抗为抗rFgCatL1杂交瘤细胞上清，二抗为兔抗鼠-IgG酶标二抗；通过Image Lab软件查看结果；
(3)通过叠加ELISA实验，对7G6及5D5抗原识别表位进行鉴定
按2μg/mL浓度稀释天然FgESP包被酶标板；分别孵育两株单克隆抗体，所测得OD450nm值记为A1及A2；后将两株抗体等比例混合后孵育，所测OD450nm值记为A12；根据公式：AI(％)＝(A12-A1)/A2×100％；AI(％)大于30％证明两株抗体具有相加作用，识别不同抗原表位；其中，AI(％)小于30％证明两株抗体呈竞争作用，识别相同表位。
8.一种应用如权利要求1～7任意一项所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备方法制备得到的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体。
9.一种应用如权利要求8所述的抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的双抗体夹心ELISA的构建方法，其特征在于，所述双抗体夹心ELISA的构建方法包括：
采用包被缓冲液稀释单克隆抗体，包被至96孔板，100μL/孔；37℃孵育2.5h，4℃过夜；采用PBST洗涤3次，加入封闭液，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入阴阳性对照，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤4次，加入抗rFgCatL1多克隆抗体，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，加入山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；加入终止液，50μL/孔，并用酶标仪读取OD450nm。
10.如权利要求9所述的双抗体夹心ELISA的构建方法，其特征在于，所述双抗体夹心ELISA的构建方法，还包括：
(1)单抗包被浓度及抗rFgCat L1多抗稀释度的筛选
分别用0.4、2、10、50μg/mL四个浓度梯度的单抗包被96孔酶标板，抗rFgCat L1多克隆抗体按1.56、3.12、6.25、12.5、25μg/mL稀释，棋盘法加样，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件；
(2)酶标二抗最佳稀释度筛选
将山羊抗兔IgG(H+L)酶标二抗按1:125、1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍比稀释，计算P/N值，最大值所对应条件为最佳检测条件；
(3)最适封闭液筛选
封闭阶段，采用10％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、5％BSA、1％明胶分别进行封闭，计算P/N值，最大值所对应为最佳封闭液；
(4)显色时间筛选
加入显色液，37℃孵育10min、15min、20min、25min、30min、60min；计算P/N值最大值所对应条件为最佳显色时间；
(5)敏感性验证
将rFgCat L1进行梯度稀释，PBS作为阴性对照；通过所构建双抗体夹心ELISA检测方法计算各浓度下的OD450nm，得出最低抗原检测浓度，验证该方法敏感性；
(6)特异性验证
通过所构建夹心ELISA检测方法，对rFgCat L1及实验室保存有FgESP、前后盘吸虫抗原、伊氏锥虫抗原、弓形虫抗原进行检测，并以PBS为阴性对照，验证方法特异性；
(7)阴阳临界值的筛选
选取20份阴性血清，通过所建测定其OD450nm，计算其平均值(X)及标准差(S)；阴阳临界值＝X+3S；
(8)临床样本检测
通过所构建的双抗夹心ELISA法，分别对实验室保存有经间接ELISA法检测为阳性的广西地区47份山羊血清及47份奶牛血清血清进行检测。
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