ES2194782T5 - Procedimiento mejorado de detección de bacterias acidorresistentes del género Helicobacter en las heces - Google Patents

Procedimiento mejorado de detección de bacterias acidorresistentes del género Helicobacter en las heces Download PDF

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Description

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E00967861
15-05-2014
HP25.2m/2H10: sensibilidad y especificidad en ELISA sandwich (anticuerpo capturador pAK contra H. pylori)
CX2019
POSITIVO 0,59 positivo
CX2029
POSITIVO 0,52 positivo
CX0213
POSITIVO 0,04 negativo
CX294-1
POSITIVO 0,14 positivo
CX3098
POSITIVO 0,13 positivo
CX3146
POSITIVO 0,05 negativo
CX3148
POSITIVO 0,08 negativo
CX3234
POSITIVO 0,18 positivo
CX4003
POSITIVO 0,17 positivo
CX4006
POSITIVO 0,25 positivo
CXT001
POSITIVO 0,23 positivo
CXT002
POSITIVO 0,53 positivo
CXT003
POSITIVO 0,12 positivo
CXT004
POSITIVO 0,03 negativo
CXT005
POSITIVO 0,03 negativo
CXT006
POSITIVO 0,31 positivo
CXT007
POSITIVO 0,08 negativo
CX1008
NEGATIVO 0,29 positivo
CX1031
NEGATIVO 0,08 negativo
CX1049
NEGATIVO 0,7 positivo
CX1051
NEGATIVO 0,09 negativo
CX0142
NEGATIVO 0,03 negativo
CX0185
NEGATIVO 0,03 negativo
CX0189
NEGATIVO 0,08 negativo
CX0193
NEGATIVO 0,03 negativo
CX2010
NEGATIVO 0,08 negativo
CX2018
NEGATIVO 0,09 negativo
CX0220
NEGATIVO 0,03 negativo
CX0231
NEGATIVO 0,03 negativo
CX0258
NEGATIVO 0,02 negativo
CX3008
NEGATIVO 0,09 positivo
CX3011
NEGATIVO 0,08 negativo
CX3033
NEGATIVO 0,07 negativo
CX3035
NEGATIVO 0,09 negativo
Abreviaturas: pAK = anticuerpo policlonal; HP = H. pylori
Tabla 3
Caracterización de anticuerpos monoclonales contra catalasa
fusión/clon
isotipo WB (Ag) NWG (mg/ml) muestras de heces reconocidas correctamente
muestras pos.
muestras neg.
HP25.2m/2H10
IgG2a, κ + 1,5 17 de 25 14 de 17
HP25.6m/1G4
IgG1, κ + 1,5 4 de 5 2 de 2
HP25.6m/1B5
IgG1, κ + 3-6 3 de 5 2 de 2
HP25.6m/1H4
IgG1, κ + 3-6 2 de 5 2 de 2
HP25.6m/4E3
IgG1, κ + 6 2 de 5 2 de 2
HP25.6m/1A5
IgG1, κ + 6 2 de 5 2 de 2
HP25.6m/5E4
IgG1, κ - 1,5 1 de 5 2 de 2
HP25.6m/4A12
IgG1, κ - 1,5 1 de 5 2 de 2
HP25.6m/5F4
IgG1, κ - 1,5 1 de 5 2 de 2
Abreviaturas: Ag = antígeno; WB = Westernblot; NWG = límite de detección
5 Resultados
La tabla 3 recoge los resultados de la determinación de isotipo, de los análisis Westernblot, de la determinación del límite de detección y del reconocimiento de paciente para anticuerpos monoclonales (mAK) contra la catalasa. De los dados se desprende que un buen reconocimiento de la catalasa nativa con mAK no guarda relación con un buen
10 reconocimiento del paciente.
En el ensayo ELISA sandwich mixto, policlonal/monoclonal, el mAK HP25.2m/2H10 presentó una sensibilidad del 68 % y una especificidad del 82 %. Cabe esperar una mejora de la sensibilidad y de la especificidad con el uso de mAk
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15-05-2014
purificado (en lugar de sobrenadante de cultivo) en un sistema ELISA exclusivamente monoclonal. Para ello pueden utilizarse ya sea un anticuerpo monoclonal, dirigido contra el mismo epítope del antígeno (ver ejemplo 10), ya sea dos anticuerpos monoclonales distintos, dirigidos contra distintos epítopes del mismo antígeno (ver ejemplo 12), en calidad de anticuerpos capturadores y detectores.
Ejemplo 10
Detección de H. pylori en heces humanas mediante el ensayo ELISA (sistema exclusivamente monoclonal)
Para el ensayo se disponía de muestras de excrementos de pacientes de diez clínicas distintas o de consultas médicas gastroenterológicas, cuyo estado de infección con H. pylori se había determinado por ensayo respiratorio de urea-C13 y/o análisis histológicos de biopsias gástricas. Las muestras de excrementos a analizar se codificaron de modo que el personal del laboratorio no conocía de antemano el estado de infección.
Ensayo ELISA sandwich de heces con H. pylori (ELISA de tres etapas)
El recubrimiento de las placas ELISA (MaxiSorb; Nunc) se efectuó a 37ºC durante 1 h con 100 µl de una solución de mAK (20,0 µg de HP25.2m/2H10 / ml de tampón carbonato 0,1 M, pH 9,5). Para bloqueo de los sitios de fijación todavía libres se pipetearon a cada hoyo 200 µl de PBS 150 mM con un 0,2 % de gelatina de pescado (p/v) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación se realizó un doble lavado con 250 µl del tampón de lavado 1 (PBS con un 0,025 % de Tween). Se suspendieron los excrementos humanos en proporción 1:10 (p/v) con 150 mM de PBS añadiendo leche desnatada en polvo al 2 % y EDTA 1 mM. Para determinar el límite de detección del antígeno se añadió catalasa de H. pylori en concentraciones conocidas a la suspensión de excrementos de un paciente negativo en H. pylori. Se centrifugaron las suspensiones de muestras de heces a 7000 rpm durante 5 min. Se incubó en cada hoyo 100 µl del sobrenadante durante 1 h. Se vació la placa, se enjuagó y se lavó 4 veces con solución de lavado 2 (250 µl de PBS al que se añadió un 0,2 % de Tween). A continuación se añadieron 100 µl de una solución de mAK unido a biotina (1 µg/ml de HP25.2m/2H10-Bio en PBS; 0,1 % de BSA) y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min. La detección de los antígenos unidos se realizó por adición de un conjugado de estreptavidina con POD (Dianova). La POD hace virar en una primera etapa el sustrato incoloro TMB (Sigma) a un producto azul. Pasados de 5 a 10 minutos, con preferencia 10 minutos, se interrumpió la reacción enzimática por adición de ácido sulfúrico 1N (100 µl/hoyo). La intensidad de la reacción de color se midió en un lector ELISA (MWG Spektral). La medición se realiza a 455 nm frente a la longitud de onda de referencia de 620 nm, o de 630 nm.
Tabla 4
Detección de catalasa de H. pylori en heces mediante ensayo ELISA empleando el anticuerpo monoclonal HP25.2m/2H10 como anticuerpo capturador y detector
paciente
estado clínico ELISA-heces-HP OD(450630) paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD(450630)
1001
negativo 0,069 1003 positivo 0,475
1002
negativo 0,104 1013 positivo 4,087
1007
negativo 0,053 1014 positivo 0,105
1008
negativo 0,042 1015 positivo 2,469
1010
negativo 0,043 1028 positivo 0,096
1012
negativo 0,055 1029 positivo 4,466
1017
negativo 0,052 1037 positivo 2,485
1021
negativo 0,045 2001 positivo 0,083
1022
negativo 0,068 2003 positivo 0,817
1024
negativo 0,036 2005 positivo 1,508
1025
negativo 0,046 2008 positivo 4,247
1027
negativo 0,057 2009 positivo 1,597
1030
negativo 0,061 2016 positivo 2,651
1031
negativo 0,037 2022 positivo 0,135
1032
negativo 0,056 2029 positivo 3,953
1034
negativo 0,048 2032 positivo 3,400
1035
negativo 0,033 2035 positivo 3,384
1040
negativo 0,037 2039 positivo 0,053
1046
negativo 0,046 2040 positivo 4,602
2002
negativo 0,056 2041 positivo 0,200
2006
negativo 0,032 2042 positivo 4,592
2007
negativo 0,027 3146 positivo 1,742
2010
negativo 0,039 6014 positivo 2,572
2012
negativo 0,041 3149 positivo 0,989
E00967861
15-05-2014
paciente
estado clínico ELISA-heces-HP OD(450630) paciente estado clínico ELISA-heces-HP OD(450630)
2013
negativo 0,049 3153 positivo 4,590
2014
negativo 0,046 3570 positivo 4,567
2015
negativo 0,048 3577 positivo 4,566
2017
negativo 0,050 3215 positivo 4,540
2018
negativo 0,061 3219 positivo 4,486
2023
negativo 0,056 3220 positivo 4,518
2024
negativo 0,051 3231 positivo 4,706
2028
negativo 0,102 3234 positivo 4,567
2033
negativo 0,050 3235 positivo 4,616
2034
negativo 0,077 3241 positivo 3,671
2043
negativo 0,045 3243 positivo 4,582
3123
negativo 0,055 4003 positivo 4,700
3213
negativo 0,119 4005 positivo 0,401
3214
negativo 0,062 4006 positivo 4,694
3224
negativo 0,048 4018 positivo 4,142
3225
negativo 0,065 4019 positivo 2,366
3236
negativo 0,043 4020 positivo 1,468
4004
negativo 0,089 5001 positivo 4,490
5004
negativo 0,079 5002 positivo 3,917
5007
negativo 0,055 5003 positivo 4,321
5008
negativo 0,156 5006 positivo 4,826
5009
negativo 0,076 77 positivo 0,067
5010
negativo 0,073 5011 positivo 0,071
5012
negativo 0,051 53 positivo 4,773
5013
negativo 0,057 70 positivo 1,084
5017
negativo 0,064 5016 positivo 0,101
5018
negativo 0,033 66 positivo 4,611
5019
negativo 0,017 67 positivo 0,589
5020
negativo 0,017 5029 positivo 0,675
5021
negativo 0,019 64 positivo 1,785
5022
negativo 0,020 58 positivo 0,304
5024
negativo 0,015 5039 positivo 3,391
5025
negativo 0,017 CXT 13 positivo 3,785
5027
negativo 0,022 6013 positivo 1,972
5028
negativo 0,021 CXT 12 positivo 0,157
5030
negativo 0,019 5048 positivo 1,695
5031
negativo 0,014 5050 positivo 0,490
5033
negativo 0,018 CXT 10 positivo 0,247
5034
negativo 0,013 5053 positivo 4,232
5035
negativo 0,018 5055 positivo 4,364
5036
negativo 0,031 CXT 9 positivo 2,455
5040
negativo 0,024 5058 positivo 3,886
5042
negativo 0,026 5059 positivo 4,450
5046
negativo 0,021 CXT 8 positivo 4,374
5052
negativo 0,020 5061 positivo 4,032
5056
negativo 0,523 CXT 7 positivo 0,647
5057
negativo 0,023 5069 positivo 1,079
5060
negativo 0,055 CXT 5 positivo 0,602
5063
negativo 0,022 5072 positivo 4,151
5064
negativo 0,017 5075 positivo 4,307
5065
negativo 0,035 5076 positivo 4,516
5066
negativo 0,024 CXT 4 positivo 0,268
5067
negativo 0,088 5078 positivo 1,022
5068
negativo 0,021 6001 positivo 4,441
6002
negativo 0,078 6004 positivo 4,296
6005
negativo 0,019 CXT 3 positivo 2,126
6008
negativo 0,013 6018 positivo 4,656
6019
negativo 0,034 6020 positivo 0,427
7005
negativo 0,025 7001 positivo 2,717
7006
negativo 4,556 CXT 2 positivo 4,479
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15-05-2014
Reconocimiento de paciente (detección de 27 muestras G4 positivas críticas y 17 muestras G0 clínicamente negativas; corte OD450-630 : 0,15
La combinación de anticuerpos HP25.6m/1B5 (anticuerpo capturador) y HP25.2m/2H10-POD (anticuerpo detector) resultó ser la más ventajosa para la detección de antígenos de H. pylori (catalasa) en las heces humanas debido al buen reconocimiento del paciente (detección correcta de 24 de las 27 muestras positivas en H. pylori y 14 de las 17 muestras negativas en H. pylori).
Ejemplo 12
Detección de H. pylori en heces humanas mediante ELISA de una sola etapa
Para el ensayo se disponía de muestras de heces de pacientes procedentes de diez clínicas distintas o de consultorios médicos gastroenterológicos, cuyo estado de infección, positivo o negativo en H. pylori, se había determinado por ensayo respiratorio de urea-C13 y/o análisis histológicos de biopsias gástricas.
Ensayo ELISA sandwich (de una sola etapa) de heces con H. pylori
El recubrimiento de la placa ELISA (MaxiSorb Lockwell; Nunc) se realizó durante una noche a 2-8ºC con 100 µl de una solución de mAK (2,0 µg de HP25.6m/1B5 / ml de tampón carbonato 0,1 M, pH 9,5). Las placas ELISA recubiertas de este modo se lavaron 2 veces con PBS y para bloquear los sitios de unión todavía libres se introdujeron en cada hoyo 200 µl de tampón de bloqueo (BSA del 0,3 %; sorbita al 20 % en PBS) y se incubó a 2-8ºC durante una noche. Se secaron estas placas ELISA con vacío, se secaron en estufa de aire forzado a 28ºC durante una noche y después se almacenaron con una bolsa de desecante a 2-8ºC.
Se suspendieron los excrementos de los pacientes en proporción 1:5 (0,1 g de muestra de heces + 500 µl de tampón de muestra) en tampón de muestra (PBS 150 mM + 0,5 % de suero animal + EDTA 1 mM + 0,1 % de detergente) durante 30 s (Vortex) y después se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min. Se aplicaron a cada hoyo de la placa 50 µl del sobrenadante (determinación por duplicado o por triplicado). A continuación se añadieron directamente a la suspensión de heces 50 µl del anticuerpo HP25.2m/2H10-dextrano-POD, marcado con POD y diluido con tampón de muestras. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en el agitador.
Después de cinco lavados con tampón de lavado (PBS 75 mM, 0,25 % de Tween) se añadió el sustrato de peroxidasa TMB (tetrametilbencidina), el sustrato monocomponente (Neogen), (100 µl/hoyo). Pasados 10 minutos se interrumpió la reacción enzimática por adición de ácido clorhídrico 1 N (100 µl/hoyo). La posterior medición de la intensidad de calor se realizó a 450 nm frente a la longitud de onda de referencia de 630 nm.
Tabla 7
Cotejo de los resultados experimentales del ensayo ELISA monoetapa y del patrón oro en el análisis de un total de 199 muestras de heces
nº de muestra
Resultado ensayo respiratorio C13 Resultado biopsia gástrica Resultado ELISA monoetapa nº de muestra Resultado ensayo respiratorio C13 Resultado biopsia gástrica Resultado ELISA monoetapa
1001
n.d. negativo 0,033 444 n.d. positivo 0,241
1002
n.d. negativo 0,022 1003 n.d. positivo 0,446
1007
n.d. negativo 0,015 1013 n.d. positivo 3,809
1008
n.d. negativo 0,032 1014 n.d. positivo 0,316
1010
n.d. negativo 0,016 1015 n.d. positivo 2,693
1012
n.d. negativo 0,026 1028 n.d. positivo 0,959
1017
n.d. negativo 0,026 1029 n.d. positivo 4,336
1021
n.d. negativo 0,014 1037 n.d. positivo 2,152
1022
n.d. negativo 0,018 2005 positivo n.d. 1,289
1024
n.d. negativo 0,018 2008 n.d. positivo 3,814
1025
n.d. negativo 0,022 2009 positivo n.d. 1,050
1027
n.d. negativo 0,044 2016 n.d. positivo 1,564
1030
n.d. negativo 0,021 2029 positivo positivo 4,347
1031
n.d. negativo 0,014 2032 positivo positivo 2,661
1032
n.d. negativo 0,014 2035 n.d. positivo 3,632
1034
n.d. negativo 0,023 2039 positivo positivo 0,694
1035
n.d. negativo 0,088 2040 n.d. positivo 3,189
1040
n.d. negativo 0,058 2041 positivo positivo 1,195
1046
n.d. negativo 0,023 2042 positivo positivo 4,350
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15-05-2014
2002
n.d. negativo 0,019 3146 positivo n.d. 4,189
2008
n.d. negativo 0,017 3219 positivo positivo 4,267
2007
negativo n.d. 0,019 3220 positivo positivo 4,138
2010
n.d. negativo 0,070 3231 positivo positivo 4,332
2012
negativo n.d. 0,040 3234 positivo positivo 3,989
2013
negativo n.d. 0,040 3241 positivo positivo 1,580
2014
negativo n.d. 0,016 3570 positivo n.d. 4,147
2015
n.d. negativo 0,027 4003 n.d. positivo 4,140
2017
negativo negativo 0,034 4005 positivo positivo 0,298
2018
negativo negativo 0,030 4006 n.d. positivo 4,228
2023
n.d. negativo 0,031 4018 n.d. positivo 3,319
2024
negativo n.d. 0,023 4019 n.d. positivo 2,892
2028
n.d. negativo 0,049 4020 n.d. positivo 1,167
2033
negativo negativo 0,040 5001 n.d. positivo 4,438
2034
negativo negativo 0,083 5006 n.d. positivo 4,343
2043
n.d. negativo 0,083 5029 n.d. positivo 1,354
3123
negativo n.d. 0,013 5039 n.d. positivo 4.401
3213
n.d. negativo 0,035 5048 n.d. positivo 2,805
3224
negativo n.d. 0,014 5050 n.d. positivo 0,744
3225
n.d. negativo 0,025 5053 n.d. positivo 3,896
4004
n.d. negativo 0,044 5055 n.d. positivo 3,825
5004
n.d. negativo 0,045 5058 n.d. positivo 4,153
5007
n.d. negativo 0,014 5061 n.d. positivo 4,050
5008
n.d. negativo 0,015 5069 n.d. positivo 1,411
5009
n.d. negativo 0,028 5072 n.d. positivo 4,322
5010
n.d. negativo 0,058 5075 n.d. positivo 4,285
5012
n.d. negativo 0,030 5076 n.d. positivo 4,402
5013
n.d. negativo 0,031 5078 n.d. positivo 1,319
5017
n.d. negativo 0,027 5090 n.d. positivo 4,268
5018
n.d. negativo 0,033 5092 n.d. positivo 1,975
5019
n.d. negativo 0,010 5100 n.d. positivo 2,406
5020
n.d. negativo 0,192 5150 n.d. positivo 0,132
5021
n.d. negativo 0,023 6001 n.d. positivo 4,325
5022
n.d. negativo 0,017 6004 n.d. positivo 4,035
5024
n.d. negativo 0,011 6013 n.d. positivo 2,684
5025
n.d. negativo 0,015 6014 n.d. positivo 4,209
5027
n.d. negativo 0,026 6015 n.d. positivo 4,164
5028
n.d. negativo 0,020 6018 n.d. positivo 4,551
5030
n.d. negativo 0,033 6020 n.d. positivo 0,376
5031
n.d. negativo 0,013 6022 n.d. positivo 1,915
5033
n.d. negativo 0,014 6027 n.d. positivo 4,244
5035
n.d. negativo 0,028 6040 n.d. positivo 3,105
5036
n.d. negativo 0,022 6050 n.d. positivo 3,806
5040
n.d. negativo 0,024 6052 n.d. positivo 4,221
5042
n.d. negativo 0,053 6064 n.d. positivo 4,225
5046
n.d. negativo 0,018 6065 n.d. positivo 4,210
5052
n.d. negativo 0,015 7001 n.d. positivo 2,584
5056
n.d. negativo 1,919 7002 n.d. positivo 4,245
5057
n.d. negativo 0,015 7003 n.d. positivo 2,236
5060
n.d. negativo 0,027 7020 n.d. positivo 0,038
5063
n.d. negativo 0,010 8026 n.d. positivo 0,013
5064
n.d. negativo 0,010 8033 n.d. positivo 1,269
5066
n.d. negativo 0,020 9001 n.d. positivo 3,765
5067
n.d. negativo 0,041 9002 n.d. positivo 4,049
5068
n.d. negativo 0,017 9003 n.d. positivo 3,674
6002
n.d. negativo 0,024 9006 n.d. positivo 0,992
6005
n.d. negativo 0,023 9007 n.d. positivo 0,052
6008
n.d. negativo 0,054 9008 n.d. positivo 4,165
6009
n.d. negativo 0,065 9009 n.d. positivo 0,033
6017
n.d. negativo 0,024 9014 n.d. positivo 4,042
6024
n.d. negativo 0,050 9017 n.d. positivo 4,276
6026
n.d. negativo 0,017 9018 n.d. positivo 0,44
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marcado con POD). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en el agitador. Después de cinco lavados con tampón de lavado (PBS 75 mM, 0,25 % de Tween) se añadió el sustrato de peroxidasa TMB (tetrametilbencidina), el sustrato monocomponente (Seramun), (100 µl/hoyo). Pasados 10 minutos se interrumpió la reacción enzimática por adición de ácido sulfúrico 1 M (100 µl/hoyo). La posterior medición de la intensidad de calor
5 se realizó a 450 nm frente a la longitud de onda de referencia de 630 nm.
Tabla 8
ELISA sandwich (monoetapa optimizado) de heces con H. pylori
10 Detección de catalasa de H. pylori en heces con ELISA monoetapa optimizado, empleando anticuerpos monoclonales HP25.6m/1B5; HP25.2m/2H10
paciente nº
resultado histológico ELISA heces HP paciente nº resultado histológico ELISA heces HP
CX 7042
negativo 0,022 CX 10001 negativo 0,011
CX 12070
negativo 0,018 CX 7040 negativo 0,014
CX 9138
negativo 0,013 CX 9048 negativo 0,017
CX 12080
negativo 0,015 CX 6075 negativo 0,024
CX 12076
negativo 0,071 CX 10016 negativo 0,024
CX 7028
negativo 0,019 CX 9073 negativo 0,015
CX 9046
negativo 0,013 CX 9081 negativo 0,036
CX 12077
negativo 0,025 CX 12007 negativo 0,034
CX 9109
negativo 0,012 CX 9122 negativo 0,078
CX 9120
negativo 0,018 CX 9069 negativo 0,025
CX 9144
negativo 0,014 CX 9091 negativo 0,029
CX 12032
negativo 0,017 CX 10012 negativo 0,034
CX 2067
negativo 0,037 CX 10027 negativo 0,07
CX 8010
negativo 0,017 CX 10009 negativo 0,023
CX 12027
negativo 0,043 CX 10014 negativo 0,021
CX 12085
negativo 0,012 CX 9040 negativo 0,038
CX 2105
negativo 0,016 CX 9090 negativo 0,027
CX 9029
negativo 0,028 CX 12006 negativo 0,026
CX 9101
negativo 0,013 CX 9060 negativo 0,013
CX 9119
negativo 0,073 CX 10031 negativo 0,023
CX 9129
negativo 0,022 CX 9075 negativo 0,019
CX 9174
negativo 0,029 CX 5131 negativo 0,032
CX 12079
negativo 0,016 CX 9054 negativo 0,016
CX 12092
negativo 0,031 CX 9070 negativo 0,022
CX 2066
negativo 0,043 CX 12099 negativo 0,014
CX 5115
negativo 0,022 CX 9050 negativo 0,038
CX 7035
negativo 0,076 CX 9086 negativo 0,017
CX 9024
negativo 0,018 CX 10013 negativo 0,036
CX 9136
negativo 0,014 CX 12062 negativo 4
CX 12065
negativo 0,017 CX 6063 negativo 3,537
CX 12084
negativo 0,014 CX 9133 positivo 0,023
CX 2044
negativo 0,028 CX 9188 positivo 0,017
CX 7032
negativo 0,048 CX 9192 positivo 0,014
CX 8011
negativo 0,014 CX 2048 positivo 0,548
CX 8050
negativo 0,015 CX 2078 positivo 0,296
CX 9056
negativo 0,014 CX 8009 positivo 0,695
CX 6067
negativo 0,016 CX 9145 positivo 1,778
CX 9041
negativo 0,036 CX 9076 positivo 0,09
CX 9157
negativo 0,021 CX 9072 positivo 0,024
CX 12042
negativo 0,014 CX 5148 positivo 0,213
CX 9134
negativo 0,016 CX 11004 positivo 0,477
CX 9160
negativo 0,015 CX 2093 positivo 0,271
CX 9171
negativo 0,042 CX 12060 positivo 1,205
CX 9025
negativo 0,017 CX 7053 positivo 2,436
CX 9150
negativo 0,014 CX 11006 positivo 0,13
CX 2050
negativo 0,013 CX 8001 positivo 4
CX 2057
negativo 0,021 CX 2100 positivo 1,539
E00967861
15-05-2014 E00967861
paciente nº
resultado histológico ELISA heces HP paciente nº resultado histológico ELISA heces HP
CX 9184
negativo 0,018 CX 5113 positivo 0,583
CX 11021
negativo 0,009 CX 7029 positivo 0,155
CX 7043
negativo 0,024 CX 10020 positivo 1,335
CX 7036
negativo 0,016 CX 2099 positivo 3,403
CX 7047
negativo 0,015 CX 12018 positivo 0,927
CX 9064
negativo 0,06 CX 7037 positivo 4
CX 8002
negativo 0,015 CX 2083 positivo 3,896
CX 9115
negativo 0,016 CX 4001 positivo 0,678
CX 9189
negativo 0,063 CX 5125 positivo 4
CX 9195
negativo 0,015 CX 9049 positivo 0,588
CX 12059
negativo 0,028 CX 5112 positivo 1,797
CX 8015
negativo 0,015 CX 9142 positivo 3,122
CX 9137
negativo 0,052 CX 7044 positivo 2,155
CX 9187
negativo 0,015 CX 2109 positivo 3,786
CX 9047
negativo 0,017 CX 8012 positivo 4
CX 9166
negativo 0,019 CX 4011 positivo 3,376
CX 12064
negativo 0,031 CX 10049 positivo 2,98
CX 2070
negativo 0,018 CX 5128 positivo 3,348
CX 6081
negativo 0,05 CX 10038 positivo 3,652
CX 9104
negativo 0,013 CX 12067 positivo 2,928
CX 9167
negativo 0,017 CX 4029 positivo 3,087
CX 9196
negativo 0,027 CX 2104 positivo 2,655
CX 9066
negativo 0,016 CX 11003 positivo 0,786
CX 10010
negativo 0,012 CX 9065 positivo 1,324
CX 9061
negativo 0,014 CX 12048 positivo 2,409
CX 9170
negativo 0,013 CX 12051 positivo 4
CX 11012
negativo 0,03 CX 10015 positivo 4
CX 2064
negativo 0,024 CX 7024 positivo 4
CX 5101
negativo 0,025 CX 12091 positivo 4
CX 7021
negativo 0,045 CX 5126 positivo 3,834
CX 9105
negativo 0,013 CX 7057 positivo 4
CX 12016
negativo 0,019 CX 5120 positivo 1,935
CX 6070
negativo 0,013 CX 11002 positivo 0,378
CX 2101
negativo 0,021 CX 11011 positivo 4
CX 8014
negativo 0,016 CX 2102 positivo 2,452
CX 9169
negativo 0,014 CX 2103 positivo 3,091
CX 12088
negativo 0,017 CX 11010 positivo 1,905
CX 9121
negativo 0,033 CX 5108 positivo 3,58
CX 9023
negativo 0,055 CX 9130 positivo 2,499
CX 12071
negativo 0,022 CX 11008 positivo 3,367
CX 10003
negativo 0,028 CX 9194 positivo 4
CX 12047
negativo 0,02 CX 12028 positivo 3,671
CX 9089
negativo 0,017 CX 4016 positivo 2,546
CX 9107
negativo 0,032 CX 4013 positivo 4
CX 2061
negativo 0,03 CX 9135 positivo 4
CX 11013
negativo 0,014 CX 11001 positivo 4
CX 9092
negativo 0,017 CX 2106 positivo 2,71
CX 12021
negativo 0,049 CX 2094 positivo 4
CX 12024
negativo 0,023 CX 9082 positivo 1,769
CX 9125
negativo 0,019 CX 5123 positivo 3,773
CX 2107
negativo 0,025 CX 6076 positivo 4
CX 9039
negativo 0,032 CX 9155 positivo 4
CX 12046
negativo 0,013 CX 7030 positivo 3,661
CX 11024
negativo 0,053 CX 9128 positivo 4
CX 12012
negativo 0,015 CX 12035 positivo 4
CX 12040
negativo 0,028 CX 10023 positivo 3,426
CX 2087
negativo 0,027 CX 2060 positivo 4
CX 9028
negativo 0,018 CX 12041 positivo 4
15-05-2014 E00967861
paciente nº
resultado histológico ELISA heces HP paciente nº resultado histológico ELISA heces HP
CX 9176
negativo 0,014 CX 9045 positivo 1,382
CX 10007
negativo 0,019 CX 9096 positivo 1,653
CX 12089
negativo 0,012 CX 2056 positivo 4
CX 7048
negativo 0,041 CX 12002 positivo 2,441
CX 9114
negativo 0,019 CX 6061 positivo 0,018
CX 12019
negativo 0,028 CX 11020 positivo 4
CX 7033
negativo 0,081 CX 9147 positivo 3,758
CX 9067
negativo 0,016 CX 9078 positivo 3,686
CX 9108
negativo 0,165 CX 5147 positivo 4
CX 9197
negativo 0,016 CX 7023 positivo 4
CX 5133
negativo 0,219 CX 9131 positivo 4
CX 9094
negativo 0,041 CX 9156 positivo 4
CX 10021
negativo 0,019 CX 10019 positivo 3,438
CX 12090
negativo 0,012 CX 12026 positivo 3,941
CX 9116
negativo 0,018 CX 9079 positivo 3,628
CX 10037
negativo 0,019 CX 4023 positivo 4
CX 12049
negativo 0,016 CX 9031 positivo 3,273
CX 12093
negativo 0,026 CX 5116 positivo 4
CX 9097
negativo 0,02 CX 9077 positivo 3,929
CX 9183
negativo 0,025 CX 4012 positivo 4
CX 11023
negativo 0,066 CX 5106 positivo 3,648
CX 5114
negativo 0,061 CX 12095 positivo 4
CX 9161
negativo 0,017 CX 10002 positivo 3,698
CX 2068
negativo 0,027 CX 11005 positivo 4
CX 8005
negativo O,025 CX 9093 positivo 4
CX 9179
negativo 0,015 CX 11014 positivo 3,465
CX 12001
negativo 0,028 CX 9051 positivo 4
CX 9062
negativo 0,022 CX 10028 positivo 3,799
CX 9118
negativo 0,013 CX 4017 positivo 4
CX 6071
negativo 0,027 CX 9182 positivo 4
CX 9035
negativo 0,016 CX 9099 positivo 4
CX 10006
negativo 0,017 CX 12022 positivo 4
CX 9095
negativo 0,018 CX 2079 positivo 3,884
CX 9199
negativo 0,016 CX 9102 positivo 3,524
CX 10018
negativo 0,019 CX 2076 positivo 3,593
CX 12008
negativo 0,018 CX 9177 positivo 4
CX 9052
negativo 0,015 CX 9088 positivo 2,14
CX 9181
negativo 0,014 CX 6072 positivo 4
CX 12058
negativo 0,055 CX 7038 positivo 4
CX 9030
negativo 0,023 CX 9123 positivo 4
CX 9059
negativo 0,015 CX 12074 positivo 4
CX 10005
negativo 0,028 CX 9055 positivo 4
CX 10039
negativo 0,018 CX 9036 positivo 4
CX 9190
negativo 0,015 CX 6078 positivo 4
CX 9164
negativo 0,016 CX 2069 positivo 3,778
CX 10044
negativo 0,023 CX 9043 positivo 3,727
CX 9110
negativo 0,027 CX 12050 positivo 3,516
CX 9127
negativo 0,018 CX 5119 positivo 4
CX 12013
negativo 0,022 CX 9113 positivo 4
CX 5105
negativo 0,017 CX 9068 positivo 3,857
CX 9178
negativo 0,037 CX 2092 positivo 4
CX 10024
negativo 0,015 CX 10050 positivo 4
CX 2098
negativo 0,038 CX 9053 positivo 3,874
15-05-2014
paciente nº
resultado histológico ELISA heces HP paciente nº resultado histológico ELISA heces HP
CX 10008
negativo 0,015 CX 4015 positivo 3,784
CX 10034
negativo 0,016 CX 12075 positivo 3,717
CX 9162
negativo 0,513 CX 9027 positivo 3,718
CX 12023
negativo 0,023 CX 9080 positivo 4
CX 2091
negativo 0,225 CX 9098 positivo 4
CX 12034
negativo 0,022 CX 9112 positivo 4
CX 12039
negativo 0,019 CX 9175 positivo 4
CX 9085
negativo 0,022 CX 9063 positivo 4
CX 10029
negativo 0,03 CX 12020 positivo 4
CX 11022
negativo 0,031 CX 9158 positivo 4
CX 2073
negativo 0,035 CX 9198 positivo 3,874
CX 12017
negativo 0,017 CX 9165 positivo 4
CX 9141
negativo 0,024 CX 9034 positivo 3,874
CX 10026
negativo 0,014 CX 12055 positivo 3,754
CX 12003
negativo 0,038 CX 6074 positivo 4
CX 7049
negativo 0,028 CX 6082 positivo 4
CX 9026
negativo 0,026 CX 6069 positivo 4
CX 10011
negativo 0,012 CX 9193 positivo 4
CX 9124
negativo 0,02 CX 9149 positivo 4
CX 12015
negativo 0,029 CX 9106 positivo 4
CX 10022
negativo 0,021
corte: OD450-640: 0,15 n = 357
histología
positivo
negativo
ELISA heces con HP
positivo 141 6
negativo
7 203
5 sensibilidad: 95 %; intervalo de confianza (95%): 90,5 - 98,1 % especificidad: 97 %; intervalo de confianza (95%): 93,9 - 98,0 %
Resultado
10 En la tabla 8 se recogen los resultados de análisis de muestras de heces negativas y positivas en H. pylori (primer diagnóstico) mediante un ensayo ELISA sandwich. Para la detección del antígeno catalasa de H. pylori en la muestra de heces se utilizaron los anticuerpos monoclonales (anticuerpo capturador: HP25.6m/1B5; anticuerpo detector: HP25.2m/2H10-POD). El análisis de las muestras de heces con un sistema ELISA exclusivamente
15 monoclonal, basado en el mAK específico de la catalasa recién mencionada, tiene una sensibilidad del 95 % y una especificidad del 97 %.
Ejemplo 14
20 Curso de erradicación / control de erradicación
El control de erradicación solo es posible a través de la detección directa de antígenos de H. pylori y no de anticuerpos en el suero, ya que los anticuerpos de H. pylori siguen estando presentes en la sangre incluso durante muchos meses después de la infección. Por lo tanto y a diferencia del ensayo serológico del H. pylori, el ensayo
25 ELISA sandwich de las heces brinda la posibilidad de evaluar con éxito una erradicación.
En la figura 9 se presenta el curso de un tratamiento de erradicación de un paciente positivo en H. pylori después de la ingestión de omeprazol, metronidazol y claritromicina. 6 días después del tratamiento no se detecta ya ningún antígeno de H. pylori en las heces.
30
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15-05-2014
En la tabla 9 se presentan los resultados del ensayo ELISA de heces de HP en un estudio de erradicación. Las muestras de heces se recogieron de 4 a 6 semanas después de finalizada la terapia de erradicación. Como ensayo de referencia se empleó el ensayo respiratorio C13. La ejecución del ensayo se realizó con arreglo al ejemplo 12 (ELISA monoetapa).
5 Tabla 9
Control de erradicación - Detección de catalasa de H. pylori en heces mediante ensayo ELISA monoetapa. Toma de muestras 4-6 semanas después de la terapia de erradicación
10
Paciente nº
Ensayo respiratorio C13 ELISA heces HP, OD450-630 nm
131
negativo 0,024
132
negativo 0,012
138
negativo 0,024
147
negativo 0,016
148
negativo 0,014
149
negativo 0,019
151
negativo 0,018
154
negativo 0,012
155
negativo 0,011
158
negativo 0,013
159
negativo 0,023
161
negativo 0,025
165
negativo 0,013
166
negativo 0,014
167
negativo 0,183
168
negativo 0,016
172
negativo 0,015
177
negativo 0,015
180
negativo 0,146
182
negativo 0,026
187
negativo 0,014
188
negativo 0,017
194
negativo 0,020
195
negativo 0,015
199
negativo 0,013
205
negativo 0,035
206
negativo 0,020
213
negativo 0,018
215
negativo 0,014
216
negativo 0,034
217
negativo 0,014
219
negativo 0,014
223
negativo 0,086
224
negativo 0,020
227
negativo 0,139
245
negativo 0,094
246
negativo 0,120
250
negativo 0,019
251
negativo 0,042
253
negativo 0,034
265
negativo 0,033
256
negativo 0,041
270
negativo 0,053
271
negativo 0,033
275
negativo 0,040
283
negativo 0,036
284
negativo 0,018
296
negativo 0,170
303
negativo 0,064
308
negativo 0,029
310
negativo 0,025
E00967861
15-05-2014
311
negativo 0,013
312
negativo 0,049
315
negativo 0,021
318
negativo 0,037
319
negativo 0,044
320
negativo 0,057
322
negativo 0,019
324
negativo 0,017
326
negativo 0,154
327
negativo 0,016
328
negativo 0,015
329
negativo 0,266
330
negativo 0,035
331
negativo 0,013
337
negativo 0,015
338
negativo 0,051
339
negativo 0,021
350
negativo 0,037
353
negativo 0,019
356
negativo 0,023
357
negativo 0,025
358
negativo 0,057
359
negativo 0,023
360
negativo 0,073
366
negativo 0,018
367
negativo 0,018
368
negativo 0,029
369
negativo 0,028
152
positivo 0,365
156
positivo 0,264
160
positivo 3,851
162
positivo 2,021
169
positivo 0,112
179
positivo 0,573
181
positivo 2,886
186
positivo 2,084
196
positivo 0,282
220
positivo 0,905
240
positivo 2,837
252
positivo 1,606
278
positivo 3,173
300
positivo 0,840
325
positivo 3,898
334
positivo 2,946
361
positivo 0,269
161/1799
positivo 0,263
En comparación con el ensayo de referencia, el estudio (97 pacientes) posee una sensibilidad del 94 % y una especificidad del 95 % (corte: OD450-630: 0,15).
5 En el ejemplo 14 se pone de manifiesto que el ensayo ELISA de heces de HP es idóneo no solo para la detección en un primer diagnóstico del H. pylori, sino también para el control de erradicación y para la documentación del curso o evolución de la erradicación.
Ejemplo 15
10 Clonación y determinación de secuencias de las regiones funcionales variables de inmunoglobulinas de líneas celulares de hibridoma
La totalidad del RNA se aisló a partir de líneas celulares de hibridoma que generan anticuerpos con arreglo a
15 Chomczynski (Chomczynski, 1987). El cDNA correspondiente se sintetizó con arreglo a métodos estándar (Sambrook y col., 1989). Las regiones de DNA, que codifican la cadena corta kappa y el segmento Fd de cadena larga (VH o bien CH1) de los anticuerpos en cuestión, se amplificaron con PCR. Para ello se aplicó el conjunto de
imagen18
imagen19

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  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
    imagen4
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