CN102980884A - 胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，包括以下步骤：（a）制作带检测物质的样品稀释液、（b）抗体-抗原复合体的形成、（c）把步骤（b）的样品和步骤（b）所得到的抗体-抗原复合体进行分离、（d）抗体-抗原-抗体复合体的形成、（e）发光底物的添加和（f）测定标记的抗体的量，所述样品稀释液含有蛋白质和碱性物质，样品稀释液的pH在8.0~10之间。本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法通过含有蛋白质和碱性物质的样品稀释液，保证了试验结果的准确性，同时采用的发光底物成本低廉，而复合型增强剂使光信号增强而持久。

Description

胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法

技术领域

本发明涉及一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法。

背景技术

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori ，H.pylori）是一种在人的胃肠道上部发现的细菌，已经发现它与胃十二指肠疾病如消化性溃疡、胃炎和其它疾病有关。按来源把该细菌属弯曲杆菌属，然后根据有关它的超微结构和脂肪酸组分方面更详细的资料再分在螺杆菌属。

幽门螺旋杆菌的检测方法很多，常用方法有：

(1)细菌培养法。该方法是诊断幽门螺旋杆菌的“黄金标准”。该方法能直接证明H.pylori 的存在，无假阳性出现，同时还可作药敏试验。对不同菌株作遗传因子研究。但是，分离培养技术条件较高。且需一定的培养时间，可有假阴性出现，尚未能广泛开展。

(2)尿素酶试验。幽门螺旋杆菌能够产生大量很高活性的尿素酶，而其他细菌罕有如此高的尿素酶活性。基于此原理，多采用pH<6.0，一般情况下试剂颜色不变。如果胃内有H.pylori感染，当标本放人试剂中，H.pylori 所产生的尿素酶则分解尿素产生氨，使pH升高，导致剂酚红变色-粉红色。尿素酶试验方法简便实用、快速灵敏。能在1分钟内判断结果，且镜检完后就可及时治疗。

(3)组织病理学检查：方法较多，有HE染色、Warthin-Starry染色、Giemsa染色、石炭酸复红染色、Gimenez染色、吖啶橙染色、间接免疫光法、相差显微镜观察、无标记抗体PAP染色法、双特异抗体酶免疫染色法、寡核苷酸探针检查等方法。以Warthin-Starry染色、Gimenez染色效果最佳而常用。但是该检测方法繁琐费时，需要一定的技术，有一定的假阳性。

(4)呼气试验。感染H.pylori 的患者口服同位素标记的尿素溶液。则尿素分解后产生的同位素CO2 从肺呼出。

对于已经做胃肠镜检查后的所获得的胃黏膜活检标本，主要采用快速尿素酶法和病理检测两种方法检查可能存在的幽门螺旋杆菌。一般而言，这两个检测方法具有较高的一致性，但是，并不是可以相互取代，仍然有不一致的地方。不一致的原因可有：(1) H.pylori胃内分布有差异，快速尿素酶法是检测一块组织。存在标本取样能否取到的问题，而病理只是一块组织几块切片，取样的问题更为突出。(2)尿素酶活性和H.pylori的不一致。虽然H.pylori 能够产生大量很高活性的尿素酶，而其他细菌罕有如此高尿素酶活性。但是目前发现，抑酸药物、一些抗菌素等会影响尿素酶试验，而抑酸药物有可能为患者服用。(3)pH法，因为其他混杂的尿素酶，颜色判断的视觉误差等存在假阳性。(4)病理形态学上可有其他相似的螺杆菌、弧菌等干扰。

免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，我国免疫学的检测基本历经了放射免疫法（RIA）、酶联免疫法（ELISA）和化学发光免疫法（CLIA），化学发光免疫法（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同这处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。化学发光免疫法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，近年来临床上已应用于检测各种激素、肿瘤标志物、药物及其他微量生物活性物质，但是由于样本取样困难等原因很少应用于胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的检测，而传统的对于胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的检测不是很可靠，存在一定的假阳性，检测结果不准确，同时成本高。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种成本低廉，检测结果直观、准确的胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法。

本发明的目的是这样实现的：

一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，包括以下步骤：

（a）制作带检测物质的样品稀释液

将含有幽门螺旋杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于样品稀释液；

（b） 抗体-抗原复合体的形成

把样品稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺旋杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；

（c）把步骤（b）的样品和步骤（b）所得到的抗体-抗原复合体进行分离；

（d）抗体-抗原-抗体复合体的形成

把步骤（c）得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体，并把抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应， 其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂（酶）进行标记；

（e）发光底物的添加

在含有抗体-抗原-抗体复合体的固体载体中添加发光底物；

（f）测定在酶催化作用下发光底物产生的光信号的量

所述样品稀释液含有蛋白质和偏碱性物质，样品稀释液的pH在8.0~10之间。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述步骤（a）中样品稀释液中的蛋白质为选自胎（小）牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的一种。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述步骤（a）样品稀释液中的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-（N-吗非啉）乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中碱性物质为pH大于8的缓冲液。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述步骤（a）样品稀释液中还设有胃蛋白酶抑制剂。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞中的一种。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其中步骤（d）中固体载体为酶标反应板或纤维素膜。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其中步骤（d）中检测剂选自辣根过氧化物酶。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其中步骤（d）中检测剂选自辣根过氧化物酶。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述步骤（e）中发光底物为鲁米诺（Luminol）底物，鲁米诺（Luminol）底物含有鲁米诺、过氧化氢和复合型增强剂。

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，所述复合型增强剂为对碘苯酚。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法通过含有蛋白质和碱性物质的样品稀释液，保证了试验结果的准确性，同时采用的发光底物成本低廉，而复合型增强剂使光信号增强而持久。

具体实施方式

本发明测定胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，具体操作步骤如下：

（a）制作带检测物质的样品稀释液

将含有幽门螺旋杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于含有蛋白质和碱性物质的样品稀释液，样品稀释液的pH在8~10为宜，其中pH=8的时候，检测的效果最好，另外还添加有胃蛋白酶抑制剂，胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞中的一种。

其中蛋白质是指选自胎（小）牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的其中一种蛋白质，增加蛋白质是为了提高非特异性。为对抗胃黏膜样品所含的酸性液体，样品缓冲液应含碱性物质，有助于降低胃黏膜样品中酸性物质对反应液pH值的改变，有助于提高pH值，从而降低胃黏膜中所含蛋白酶的活性，以及其他物质对反应的干扰。

其中样品稀释液为含有选自胎（小）牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的一种蛋白的样品稀释液。

样品稀释液内含有的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-（N-吗非啉）乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中碱性物质为pH大于8的缓冲液。配置碱性物质的方法是本技术领域技术人员所熟悉的。

（b） 抗体-抗原复合体的形成

把样品稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺旋杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；一般来说本发明使用了抗幽门螺旋杆菌的抗体，可以为单克隆抗体和多克隆抗体两种，但是目前常用的为多克隆抗体。这些抗体能够从致敏的动物的血清中获得。目前国内外已有多家公司可提供商品化的抗幽门螺旋杆菌的抗体，可以较经济的价格获得。中国专利(申请号97103112．6)已详细描述幽门螺旋杆菌抗体的制备方法。在此仅简述如下：把幽门螺旋杆菌抗原注射到哺乳动物如兔、羊等体内，多次注射适当剂量的抗原，验证试验动物已产生抗幽门螺旋杆菌抗体，取试验动物血清，经纯化即可得到所需抗体。许多样品稀释液以0.05％到2％之间范围浓度含有Triton X-100和／或Tween 20，加0~2.9％NaCL可改变缓冲体系的离子强度。这些变化通过降低形成中的弱的或非特异性反应来导致较好的特异性。

（c）把步骤（b）的样品和步骤（b）所得到的抗体-抗原复合体进行分离。

（d）抗体-抗原-抗体复合体的形成

把步骤（c）得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体，并把抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应， 其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂进行标记；其中固体载体为酶标反应板或纤维素膜（如硝酸纤维素膜、混合纤维素膜）等，当然也可以是其他免疫学领域常见的固体载体。

上述的检测剂选自辣根过氧化物酶。把抗体结合在辣根过氧化物酶上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。

其中抗体-抗原复合体暴露给第二种多克隆抗体的一部分反应后形成抗体-抗原-抗体复合体，用磷酸盐缓冲液洗涤该抗体-抗原-抗体复合体，降低了交叉反应度或以其它方式提高该测定法的特异性。

（e）发光底物的添加

在含有抗体-抗原-抗体复合体的固体载体中添加发光底物，所述发光底物为鲁米诺（Luminol）底物，鲁米诺（Luminol）底物含有鲁米诺、过氧化氢和复合型增强剂，抗体-抗原-抗体复合体上的第二种多抗用辣根过氧化物酶标记，而辣根过氧化物酶能够催化过氧化氢的分解，让过氧化氢变成水和单氧，单氧再氧化鲁米诺让它发光。其中复合型增强剂使发光强度高，发光平台期长，可达30~60分钟。

（f）测定在过氧化物酶催化作用下产生的光信号的量。

本试验中涉及到的溶液配制：

（一）、常见碱性溶液配制

本发明涉及的采用碱性生物缓冲液的配制方法如下：

1、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）缓冲液

HEPES分子式：C8H18N2O4S分子量：238.3

每1000ml去离子水中加入2~5克HEPES，待溶后用lN NaOH 调pH至8.2~9.15范围之间，滤过除菌后使用。

2、硼砂－氯化钙缓冲液

取硼砂0.3~2g与氯化钙2~5 g，加水约800 ml溶解后，用1 mol/L盐酸溶液约2.5 ml调节pH值至8.0-9.5，加水稀释至1000 ml，即得。 

3、硼酸－氯化钾缓冲液(pH8.0~9.5)

取硼酸2.7~5.0 g，加0.1 mol/L氯化钾溶液500 ml使溶解，再加0.1 mol/L氢氧化钠溶液210 ml，即得。

4、甘氨酸缓冲液配制

甘氨酸缓冲液：6~8克甘氨酸、9~12克氯化钠溶于蒸馏水，用1mol/L氢氧化钠调节PH，蒸馏水补足至1升。

（二）、样品稀释液的配制

样品稀释液的配制方法如下：在上述碱性溶液100ml加上0.1~2.0g牛血清白蛋白（BSA），加入适量（终浓度为0.01%～0.02%）硫柳汞，再加上0.05~2％的Triton X-100和／或Tween 20。

（三）、包被缓冲液

将抗幽门螺旋杆菌抗体包被到微孔板（固相载体）

0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.6）：0.75 g 碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。

（四）、封闭缓冲液  用于包被后减少非特异性反应

0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.6）（同上）+2.0%BSA：2g牛血清白蛋白（BSA）加入100ml上述配好的0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.6）

（五）、0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.4）

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容至1000ml。

（六）、抗体稀释液  用于稀释各种抗体等

0.02mol/L PBS（pH7.4）+0.2%BSA：0.2g牛血清白蛋白（BSA）加入100ml上述配好的上述配好的0.02mol/L  PBS（pH7.4）中。

（七）、洗涤缓冲液  用于洗脱多余的未结合的抗原和抗体等。 

0.02mol/L PBS（pH7.4）+0.05%吐温20（Tween-20）：将50微升Tween-20加入上述配好的100ml 0.02mol/L PBS（pH7.4）中，震荡混匀。

（八）、发光底物

鲁米诺（Luminol）底物含有鲁米诺、过氧化氢和复合型增强剂。

（九）、酶标记抗幽门螺旋杆菌抗体的稀释

将（HRP）酶标记的抗幽门螺旋杆菌抗体用抗体稀释液按照适当比例稀释至工作浓度。本发明使用的是美国KPL公司的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺旋杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到0.1mg/ml。

胃粘膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法的操作流程：

一、酶标反应板的包被和封闭（即操作步骤的b~d的过程），本过程在直接将步骤b~d作为一个整体进行处理。

包被：用上述的包被缓冲液将抗幽门螺旋杆菌抗原的第一种多克隆抗体稀释到适当浓度，抗幽门螺旋杆菌抗原的第一种多克隆抗体使用的是美国KPL公司的抗人幽门螺旋杆菌抗体，按照说明书的方法稀释到10μg/ml。每孔加入上述稀释好的抗体100μl，用薄膜包好放于4度保存过夜。

封闭：次日，将上述微孔板甩干，每孔加100μl前述配好的封闭缓冲液，用薄膜包好放于4度保存过夜。次日，将微孔板甩干，晾干，密封，备用。

二、检测带检测物质的样品稀释液

1、待测胃黏膜样品及阳性对照和阴性对照用前述的样品稀释液作1：4稀释后，于前述已包被好的微孔板中每孔加入100ul，置湿盒中37℃作用30分钟。

取出微孔板甩干，用前述配制好的洗涤缓冲液洗涤，洗涤3-5次，每次3-5分钟。

2、将上述已稀释好的辣根过氧化物酶标记的抗人幽门螺旋杆菌抗体以每孔100ul加入到微孔板中，置湿盒中37℃作用30分钟。

取出微孔板甩干，用前述配制好的洗涤缓冲液洗涤，洗涤3-5次，每次3-5分钟。扣干。

3、底物发光

于微孔板中每孔各加入50ul前述已配制的发光底物。

4、检测

置室温5-10分钟，用仪器测量RLU。

Claims (10)

1.一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法包括以下步骤：

（a）制作带检测物质的样品稀释液

将含有幽门螺旋杆菌的一种胃黏膜样品悬浮于样品稀释液；

（b） 抗体-抗原复合体的形成

把样品稀释液中的胃黏膜样品与抗幽门螺旋杆菌抗原的第一种多克隆抗体接触以形成抗体-抗原复合体；

（c）把步骤（b）的样品和步骤（b）所得到的抗体-抗原复合体进行分离；

（d）抗体-抗原-抗体复合体的形成

把步骤（c）得到的分离后的抗体-抗原复合体暴露于抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体，并把抗幽门螺旋杆菌抗原的第二种多克隆抗体的一部分与复合体反应， 其中所述的第一种多克隆抗体和第二种多克隆抗体中的其中一种多克隆抗体结合在一种固体载体上，而另一种多克隆抗体用一种检测剂进行标记；

（e）发光底物的添加

在含有抗体-抗原-抗体复合体的固体载体中添加发光底物；

（f）测定发光底物产生的光信号的量

其特征是：所述样品稀释液含有蛋白质和碱性物质，样品稀释液的pH在8.0~10之间。

2.根据权利要求1所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述步骤（a）中样品稀释液中的蛋白质为选自胎（小）牛血清、正常山羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶和牛血清白蛋白中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述步骤（a）样品稀释液中的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-（N-吗非啉）乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中碱性物质为pH大于8的缓冲液。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述步骤（a）样品稀释液中还设有胃蛋白酶抑制剂。

5.根据权利要求4所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞中的一种。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：其中步骤（d）中固体载体为酶标反应板或纤维素膜。

7.根据权利要求1或2或3所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：其中步骤（d）中检测剂选自辣根过氧化物酶。

8.根据权利要求4所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：其中步骤（d）中检测剂选自辣根过氧化物酶。

9.根据权利要求1或2或3所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述步骤（e）中发光底物为鲁米诺（Luminol）底物，鲁米诺（Luminol）底物含有鲁米诺、过氧化氢和复合型增强剂。

10.根据权利要求9所述的一种胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法，其特征是：所述复合型增强剂为对碘苯酚。