CN103513036B - 沙门氏菌的cleia检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

沙门氏菌的cleia检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开沙门氏菌的CLEIA检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括沙门氏菌抗体、辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体和含有对碘苯酚、鲁米诺和过氧化氢的化学发光溶液。相应检测方法将沙门氏菌抗体包被在96孔酶标板上作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体为检测抗体，以对碘苯酚为增强剂的鲁米诺-过氧化氢为化学发光溶液，建立检测沙门氏菌含量的双抗体夹心化学发光酶免疫检测方法。本发明方法灵敏度高，选择性好，易于操作，检测速度快，成本低廉，可实现沙门氏菌的大规模在线检测，适于在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。

Description

沙门氏菌的CLEIA检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种沙门氏菌的检测试剂盒及检测方法，更具体地说，是涉及一种利用化学发光酶免疫技术检测沙门氏菌的检测试剂盒及利用其所进行的检测方法。
背景技术
沙门氏菌（Salmonellaspp.）是一群寄生于人和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似，兼性厌氧。作为一种常见的食源性致病菌沙门氏菌污染畜禽肉、蛋类、生鲜奶等多数动物源性食品的情况相当普遍，并且也广泛存在于自然环境中，是微生物引起食物中毒的主要病原之一，在公共卫生学上意义重大。据报道，卫生部已发布国家标准《食品中致病菌限量》的征求意见稿，该标准拟自正式发布后6个月施行，这是我国首次制定食品中致病菌限量标准。其中，沙门氏菌在各类食品样品中不得检出这类病菌。
目前，国内外各公共卫生机构检测沙门氏菌仍采用传统培养检测方法，这种方法虽然结果准确，但整个过程复杂繁琐、耗时耗力，已明显不能满足日益发展的国际贸易的需要，也越来越成为相关检测部门的沉重负担。为了寻找新的高效、简便且准确的检测技术及方法，国内外学者进行了大量研究，在现有快速检测方法的基础上不断创新，常规的PCR方法虽然符合快速简便等要求，但是它易污染，假阳性高；而以免疫学、分子生物学为基础研究了一些较新的快速检测方法，并在实践中不断取得新进展。
化学发光酶免疫分析(Chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLEIA)是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物，HRP最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和过氧化氢作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系(HRP-过氧化氢-鲁米诺)为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长的时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于沙门氏菌的CLEIA检测试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法。该方法应当具有较高灵敏度，易于操作，检测速度快，成本低廉，并可实现大通量同步检测。
本发明所述的沙门氏菌的CLEIA检测试剂盒包括沙门氏菌抗体、辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体和化学发光溶液；所述化学发光溶液中含有对碘苯酚、鲁米诺和过氧化氢。
具体实施方式中，本发明的试剂盒所述的沙门氏菌抗体为羊或兔抗沙门氏菌抗体或沙门氏菌单克隆抗体。所述的辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体为用辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗沙门氏菌抗体或沙门氏菌单克隆抗体。
另一具体实施方式中，化学发光溶液中所含对碘苯酚、鲁米诺和过氧化氢的摩尔浓度分别为0.05～0.25mM、0.1～5mM和0.1～5mM。
本发明另一方面的目的在于提供一种沙门氏菌的CLEIA检测方法，该方法利用上述检测试剂盒，包括如下步骤：
①制备检测样品；
②沙门氏菌抗体包被；
③使步骤①制备的样品与步骤②所制备的包被的沙门氏菌抗体接触，并加入辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体和化学发光溶液，反应完成后，测定化学发光值并计算样品中沙门氏菌含量。
具体地，本发明所述的沙门氏菌的CLEIA检测方法是化学发光酶免疫检测方法，该方法中以包被在96孔酶标板上的沙门氏菌抗体作为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体为检测抗体，以对碘苯酚为增强剂的鲁米诺-过氧化氢为化学发光溶液。其中所述的沙门氏菌抗体可以为单抗或多抗，优选羊或兔抗沙门氏菌抗体或沙门氏菌单克隆抗体。所述的化学发光溶液中，对碘苯酚、鲁米诺和过氧化氢的摩尔浓度分别为0.05～0.25mM、0.1～5mM和0.1～5mM。分别优选0.15mM，1.25mM，2.5mM。
更进一步，所述方法包括如下具体步骤：
①制备检测样品：
②包被捕获抗体：将浓度为2μg/mL的沙门氏菌抗体按照100μl/孔加入96孔酶标板中，于4℃冰箱中过夜包被，再用磷酸盐洗液PBST洗涤3次，拍干，每孔用200μl封闭溶液于37℃恒温箱中反应1小时，磷酸盐洗液PBST洗涤3次后将酶标板拍干待用；
③样品检测
每孔加入100μl步骤①所制备的检测样品，37℃恒温箱中反应2小时，用PBST洗涤三次，拍干；将浓度为1μg/mL的辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌检测抗体，按照100μl/孔加入到96孔酶标板中，放置37℃恒温箱反应1小时，用PBST洗涤三次，拍干；加入100μl/孔化学发光液，反应5min后，用多功能酶标仪测定化学发光值，发光计数值直接相关于样本中沙门氏菌的含量。
使用本发明所述的试剂盒及检测，应用了以碘苯酚为增强剂的鲁米诺-过氧化氢为化学发光体系，利用双抗体夹心模型免疫反应，实现定量样本中的沙门氏菌含量，提高了检测灵敏度。与ELISA测定法相比，灵敏度可显著提高一个数量级以上，且操作简便、快捷、可高通量进行，具有十分广泛的应用前景与开发价值。可以在食品沙门氏菌污染的监控中实现广泛应用。
附图说明
本发明附图1幅，为实施例中沙门氏菌灵敏度检测试验结果图。
具体实施方式
若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器均由商业途径获得，主要商品来源包括：
兔抗沙门氏菌抗体，Santa；辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体，Santa；BSA（牛血清白蛋白），Sigma；对碘苯酚，Sigma；鲁米诺，Sigma；过氧化氢，Sigma。
各种试剂的配制按照如下方法：
a.磷酸盐缓冲液（PBS）：用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠（NaCl），0.2g氯化钾（KCl），1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4）和0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4），用盐酸（HCl）调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，摇匀。
b.磷酸盐洗液(PBST)：用800mL蒸馏水溶解8g氯化钠（NaCl），0.2g氯化钾（KCl），1.44g磷酸氢二钠（Na2HPO4）和0.24g磷酸二氢钾（KH2PO4），用盐酸（HCl）调节溶液的pH值至7.4，加水至1L，再加入200μL的表面活性剂Tween20，摇匀。
c.捕获抗体：用PBS稀释使溶液中兔抗沙门氏菌抗体重量百分比浓度为2μg/mL。
d.辣根过氧化物酶标记的检测抗体：用PBS稀释使溶液中辣根过氧化物酶标记的兔抗沙门氏菌抗体重量百分比浓度为1μg/mL。
e.封闭溶液：用双蒸水稀释使溶液中BSA（牛血清白蛋白）重量百分比浓度为2%。
f.0.1M的Tris-HCl缓冲液：用800mL双蒸水溶解12.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），用盐酸（HCl）调节溶液的pH值至8.5，加水至1L，摇匀。
g.化学发光液：用0.1M的Tris-HCl缓冲液稀释使溶液中对碘苯酚溶液的摩尔浓度为0.05～0.25mM，鲁米诺溶液的摩尔浓度为0.1～5mM，过氧化氢的摩尔浓度为0.1～5mM。
起始原料应当是疑似沙门氏菌污染的畜禽肉、蛋类、生鲜奶等材料。
下述非限制性实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
检测所使用的原料样品为疑似沙门氏菌污染的牛肉样品。
取浓度为2μg/mL沙门氏菌抗体按照100μl/孔加入96孔酶标板中，于4℃冰箱中过夜包被，再用磷酸盐洗液PBST洗涤3次，拍干，每孔用200μl封闭溶液于37℃恒温箱中反应1小时，磷酸盐洗液PBST洗涤3次后将酶标板拍干待用；
每孔加入100μl待检测样品，37℃恒温箱中反应2小时，用PBST洗涤三次，拍干；将浓度为1μg/mL的辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌检测抗体，按照100μl/孔加入到96孔酶标板中，放置37℃恒温箱反应1小时，用PBST洗涤三次，拍干；加入100μl/孔化学发光液，反应5min后，用多功能酶标仪测定化学发光值，发光计数值直接相关于样本中沙门氏菌的含量。所述化学发光液中含有对碘苯酚溶液的摩尔浓度为0.15mmol/L，鲁米诺溶液的摩尔浓度为1.25mM，过氧化氢的摩尔浓度为2.5mM。
实施例2
按照实施例1的方法检测疑似沙门氏菌污染的牛肉样品。
除将碘苯酚浓度分别设定为0.05mM，0.1mM，0.15mM，0.25mM和0.5mM；其他组分浓度不变，经化学发光酶免疫分析测定，考察对碘苯酚浓度变化对化学发光液发光性能的影响。检测结果如下表所示：
结果显示：当对碘苯酚摩尔浓度为0.15mM时，S/N达到最高，因此，对碘苯酚浓度为0.15mM时其对化学发光体系的增强效果最佳。
实施例3
按照实施例1的方法检测疑似沙门氏菌污染的牛肉样品。
将体系中鲁米诺浓度分别设定为0.625mM，1.25mM，2.5mM，5mM，10mM；其它组分浓度不变，经化学发光酶免疫分析测定，考察鲁米诺浓度变化对化学发光液发光性能的影响。检测结果如下表所示：
结果显示，当鲁米诺摩尔浓度为1.25mM时，S/N达到最高，因此鲁米诺摩尔浓度为1.25mM是化学发光液的发光性能最佳。
实施例4
按照实施例1的方法检测疑似沙门氏菌污染的牛肉样品。
将体系中过氧化氢浓度分别设定为0.625mM，1.25mM，2.5mM，5mM，10mM，其他组分浓度不变，经酶促化学发光免疫分析考察不同氧化剂浓度对鲁米诺化学发光增强效果的影响。检测结果如下表所示：
结果显示，当过氧化氢摩尔浓度为2.5mM时，S/N达到最高，因此过氧化氢浓度为2.5mM时发光增敏液的发光性能最佳。
实施例5
按照实施例1的方法检测，设定沙门氏菌浓度分别为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL的人工阳性样本和人工阴性样本为待检测样品。
包被捕获抗体：取2μg/mL的沙门氏菌抗体100μl加入96孔酶标板中，于4℃冰箱中过夜包被，再用磷酸盐洗液PBST洗涤3次，拍干，用200μl封闭溶液于37℃恒温箱中反应1小时，磷酸盐洗液PBST洗涤3次后将酶标板拍干待用；
检测：加入上述制备的不同浓度的沙门氏菌人工样本各100μl，每个不同浓度做8个重复，37℃恒温箱中反应2小时，用PBST洗涤三次，拍干；将1μg/mL的辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌检测抗体，100μl/孔加入到96孔酶标板中，放置37℃恒温箱反应1小时，用PBST洗涤三次，拍干；加入100μl/孔化学发光液，反应5min后，用多功能酶标仪测定化学发光值，发光计数值直接相关于样本中沙门氏菌的含量。结果如图1所示，检测出限不高于105CFU/mL。比已建立的同条件的ELISA检测方法更灵敏。
实施例6
以实施例1的方法检测方法，以GB4789.4-2010为对照方法，自2012年9月至2013年6月期间所采集的疑似沙门氏菌污染样品进行检测，这些样品包括牛肉样品25例、鸡肉样品18例、牛奶样品7例、鸡蛋样品19例。
结果表明，采用实施例1的方法检测出2例牛肉样品，1例鸡蛋样品受沙门氏菌污染，与GB4789.4-2010检测结果一致。

Claims (4)

1.沙门氏菌的CLEIA检测试剂盒，包括沙门氏菌抗体、辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体和化学发光溶液；
所述化学发光溶液中含有0.15mM对碘苯酚、1.25mM鲁米诺和2.5mM的过氧化氢。
2.沙门氏菌的CLEIA检测方法，使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：
①制备检测样品；
②沙门氏菌抗体包被；
③使步骤①制备的样品与步骤②所制备的包被的沙门氏菌抗体接触，并加入辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体和化学发光溶液，反应完成后，测定化学发光值并计算样品中沙门氏菌含量。
3.权利要求2所述的沙门氏菌的CLEIA检测方法，其特征在于所述的包被捕获抗体包括如下步骤：将浓度为2μg/mL的沙门氏菌抗体按照100μl/孔加入96孔酶标板中，于4℃冰箱中过夜包被，再用磷酸盐洗液PBST洗涤3次，拍干，每孔用200μl封闭溶液于37℃恒温箱中反应1小时，磷酸盐洗液PBST洗涤3次后将酶标板拍干待用。
4.权利要求2所述的沙门氏菌的CLEIA检测方法，其特征在于所述的步骤③中辣根过氧化物酶标记沙门氏菌抗体浓度为1μg/mL。
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