CN109142727A

CN109142727A - 一种o型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109142727A
Application number: CN201811178968.8A
Authority: CN
Inventors: 陈豪泰; 张永光; 孙跃峰; 祁林林; 张�杰; 潘丽
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开了一种O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用，涉及生物检测技术领域。所述试剂盒包括：O型口蹄疫病毒抗原、包被酶标板、洗涤液、血清和抗体稀释液、底物显色液TMB、辣根过氧化物酶标二抗、终止液、O型口蹄疫病毒标准阴阳性血清；其中，所述酶标板以O型口蹄疫病毒146s包被。可以通过颜色变化来判定结果，溶液是蓝色为阳性，无色为阴性，本发明的用于检测O型口蹄疫病毒的抗体，具有高敏感性、特异性和重复性均良好的优点，且该试剂盒在室温下操作，适用于基层临床可视化检测。

Description

一种O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，本发明公开了一种O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒(FMDV)所致的急性的、热性的、高度接触性传染病，主要侵害偶蹄兽，经常在羊、牛、猪等动物中传播。发病时易感动物的唇和蹄部出现水疱，同时伴有发烧、食欲不振等症状，患病动物体重和产奶量大幅下降。口蹄疫病毒易通过空气传播，传染性强，流行快速，易感动物在抵抗力较弱的情况下也会导致死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍了养殖业的发展。

目前对于O型口蹄疫病毒抗体的诊断方法和疫苗免疫效果的评价方法只能在实验室完成，不适合基层检测，需要一种更为灵敏、快捷和简便的可视化的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种简便、快速及准确检测O型口蹄疫病毒抗体的试剂盒。

本发明第二个目的在于提供上述试剂盒的应用。

其具体技术方案为：

一种O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液、标准阳性和阴性血清；其中，所述包被酶标板是以O型口蹄疫病毒146s作为包被抗原。

作为优选,所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.2。

作为优选,所述血清稀释液为含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为含有过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

作为优选,所述终止液为SDS或者硫酸溶液。

作为优选,所述包被抗原的包被浓度为2μg/mL；所述包被酶标板经50g/L脱脂奶粉PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

作为优选,所述酶标二抗的稀释倍数为1:20000。

本发明所述O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒在口蹄疫诊断试剂制备过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的间接ELISA试剂盒，使用O型口蹄疫病毒146s为包被抗原，其浓度易于确定和控制，有利于该试剂盒的大量生产与成本控制。

本发明的试剂盒用于检测O型口蹄疫病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，该试剂盒操作简便、快速、成本低廉，可以在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为O型口蹄疫病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明实施提供了上述0型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测方法及其应用，所述检测方法包括以下步骤：

用血清稀释液以体积比1：40的比例稀释待检血清得到稀释血清；

酶标板每孔中加入100μ所述稀释血清，酶标板各添加标准阳性和阴性血清作为对照，于室温孵育1h，弃去反应孔中液体，再向每孔加入洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

酶标板每孔中加入100μL以体积比1:20000稀释后的酶标二抗，于室温孵育1h，弃去反应孔中液体，向每孔中加入洗涤液并洗涤3次，每次5分钟，弃洗涤液，最后一次拍干；

酶标板每孔中加入100μL底物TMB显色液，室温下作用20分钟，蓝色为阳性，无色为阴性。

酶标板每孔加入100μL硫酸终止液以终止显色反应；

用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度(OD)值；

根据OD值判定，当OD450值≥0.49时，判定O型口蹄疫病毒抗体水平为阳性，当OD450值＜0.49时，判定O型口蹄疫病毒抗体水平为阴性。

实施例1

1.样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

包被液为0.05M碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，PH为9.6；

样品稀释液为含50g/L脱脂奶粉的洗涤液；

洗涤液为含0.05％Tween-20的0.01M pH为7.2的磷酸盐缓冲液，其配方为：

NaCl：8.5g，NaH2PO4·2H2O：0.356g，NaH2PO4·12H2O：2.772g，将其混合后，再用蒸馏水溶解并定容至1000mL，再向其中加入0.5mL吐温-20得到上述洗涤液；

终止液为：配置1％SDS或者2M硫酸溶液。

2.抗原的最适包被浓度和血清的最适稀释度的确定

结果显示当抗原的稀释度为2.0μg/mL每孔，血清以1:40倍稀释，酶标二抗以1:20000倍稀释。

3.作用时间的优化

抗原的最佳封闭时间为20min，血清反应时间为1h，酶标二抗最佳孵育时间为40min，最佳显色时间为20min。

4.阴阳性标准临界值的确定

取20份O型口蹄疫病毒抗体为阴性的血清样品，按照确定的条件进行间接ELISA，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，计算OD₄₅₀的平均值(X)及标准方差(S)，阴阳性临界值＝X+3S；经统计学计算，20份阴性血清OD₄₅₀值的平均值X＝0.34，标准差s≈0.05，因此间接ELISA阴阳性临界值X+3S≈0.49，因此，当样品OD₄₅₀值≥0.49时，判定O型口蹄疫病毒抗体水平为阳性，当OD₄₅₀值＜0.49时，判定O型口蹄疫病毒抗体阴性。

5.操作程序的确定

按照以上各项所确定的最佳操作条件，确定的操作程序为：取出已包被并封闭好的ELISA板条，用血清稀释液将待检血清做1：40倍稀释，加入酶标板各孔，每孔100μL，各加一孔，O型口蹄疫病毒阴性、阳性血清各加两孔，室温作用1h；弃去孔内液体，每孔用洗涤液洗3次并拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μL酶标二抗，室温作用1h；弃去孔内液体，每孔用洗涤液洗涤3次并拍打，弃尽孔内液体；每孔加入100μLTMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物显色液后，室温避光显色20min，加入100μLSDS终止液；肉眼观察颜色，蓝色为阳性，无色为阴性。也可以加硫酸终止液，用酶标仪在450nm波长读取各孔OD值，判定结果。

实施例2

ELISA试剂盒的特异性试验：

按已建立的方法分别检测已知的猪瘟病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒和0型口蹄疫病毒阳性血清样品，阴性为无色，阳性为蓝色。

用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，确定该间接ELISA检测方法的特异性，检测结果表明，只有O型口蹄疫病毒阳性血清的OD₄₅₀>0.34，其他各分血清OD₄₅₀均小于0.1，说明该间接ELISA检测结果特异性良好。

本发明的试剂盒用于检测O型口蹄疫病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，该方法操作简便、快速、成本低廉，可以在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为O型口蹄疫病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被酶标板、洗涤液、血清稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液、标准阳性和阴性血清；其中，所述包被酶标板是以O型口蹄疫病毒146s作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液，pH为7.2。

3.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液为含有过氧化氢的四甲基联苯胺溶液。

4.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为SDS或者硫酸溶液。

5.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的包被浓度为2μg/mL；所述包被酶标板经50g/L脱脂奶粉PBST封闭，装入密封袋中置于4℃保存。

6.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗的稀释倍数为1:20000。

7.权利要求1所述O型口蹄疫病毒抗体的可视化快速检测试剂盒在口蹄疫诊断试剂制备过程中的应用。