CN102095847A

CN102095847A - 一种检测人血清中透明质酸含量的方法

Info

Publication number: CN102095847A
Application number: CN200910250476XA
Authority: CN
Inventors: 吕东川
Original assignee: Beijing North Institute of Biological Technology
Current assignee: Beijing North Institute of Biological Technology
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2011-06-15

Abstract

本发明涉及一种用放射免疫分析方法检测人血清、体液或组织匀浆中的透明质酸的方法。本发明使用固相包被以及铕标记透明质酸结合蛋白(HABP-Eu³⁺)的方法，不需要第一抗体、第二抗体等试剂，加样简单，反应快速，试剂货架期长，对环境无污染，铕与HABP结合稳定，存放时间可大于12个月，无放射性污染。

Description

一种检测人血清中透明质酸含量的方法

技术领域

本发明涉及一种用放射免疫分析方法检测人血清、体液或组织匀浆中的透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)的方法。

背景技术

如文献CN 1047391A中所公开的，该文献公开了一种检测血清、体液或组织匀浆中透明质酸(HA)含量的灵敏、准确、快速的方法。它将未知量标本中加入定量透明质酸结合蛋白(HABP)，再加入碘标记透明质酸使之与标本反应所剩的HABP结合，再用第一抗体、第二抗体将HABP沉淀下来，测其放射性后定标其浓渡。血清HA的检测有助于肝病的诊断和鉴别诊断、病情判断和预后估价。该方法及其试剂盒也为HA与疾病关系的科研和临床应用提供了必要的方法和物质基础。HABP所结合的125I-HA与标本中HA含量呈负相关。

但是上述方法的存在如下不足一、使用试剂过多，加样步骤繁琐，反应时间长；二、使用125I作为标记物，灵敏度低，试剂的货架期短，对环境产生放射性污染。

发明内容

本发明使用固相包被以及铕标记透明质酸结合蛋白(HABP-Eu3+)的方法，不需要第一抗体、第二抗体等试剂，加样简单，反应快速，试剂货架期长，对环境无污染。

本发明预先在固相载体(例如96孔微孔板)上包被有HA，反应体系中与样本中的HA共同与限量的HABP-Eu3+在适宜的条件下进行竞争性结合反应，形成一种HA-HABP-Eu3+结合物。校准品或样本中的HA含量越高，在包被板上形成的HA-HABP-Eu3+结合物就越少。加样时只需向微孔中连续加入样本及HABP-Eu3+，反应1小时即可完成。测定时，先洗去包被板中的液体，再加入增强液，使结合在包被板上的Eu3+解离下来，并与增强液中的一些成分螯合形成新的螯合物。Eu3+的荧光强度随样本中HA浓度的增加而减少。铕与HABP结合稳定，存放时间可大于12个月，无放射性污染。

附图说明

附图1为本发明检测方法的流程图

具体实施方式

实施例一：

1)包被板的制作：与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)用0.01M磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)按一定比例稀释制成包被液，等体积加入微孔板的各孔中，4℃放置过夜。弃去包被液，加入等体积的封闭液(0.01M PB，5-10％蔗糖，0.5-1％BSA，pH7.4)，4℃放置过夜。弃去封闭液，自然干燥后，用铝箔袋真空密封后可长期保存。

2)检测操作过程：

a.向微孔板各孔中加入等体积HA校准品或待测样本。

b.向微孔板各孔中加入等体积HABP-Eu3+。

c.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应60分钟。

d.吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，末次洗板后将板拍干。

e.各孔中加入等体积增强液。

f.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应5-10分钟。

g.将微孔板放入时间分辨仪上检测各孔荧光值。

3)数据处理：

a.联机处理：由电脑自动处理得出结果。建议使用log-logit或四参数数据处理模式。

b.手工作图或计算器处理：

i.百分结合率计算：设0校准管计数为B0，各校准品管或样本管计数为B，则百分结合率计算公式如下：B/B0＝B/B0×100％

ii.logit计算：各校准品管或样本管的logit值计算公式如下：

logit＝(B/B0)/(1-B/B0)

iii.手工作图：以校准品浓度取1g值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上，或以校准品浓度为横坐标对应的B/B0为纵坐标在log-logit坐标纸上画出校准曲线(理想化时是一条直线)。根据待测样品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。

iv.计算器处理：使用有线性拟合功能的计算器可以比较方便地计算出样品浓度值，具体操作方法请查阅计算器的使用说明书。

上述实施例中的与HA偶联的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它适宜包被的材料，如塑料试管、塑料珠等替代；用于HABP标记的铕(Eu)可以被其它镧系元素的三价金属离子钐(Sm)、镝(Dv)、锝(Te)等替代，也可以被酶或其它荧光物质、化学发光标记物替代，并用相应的仪器进行检测。

Claims

1.一种检测人血清中透明质酸含量的方法：

步骤如下：

1)制作包被板：与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)用0.01M磷酸盐缓冲液，pH值7.4，按一定比例稀释制成包被液，等体积加入微孔板的各孔中，4℃放置过夜，弃去包被液，加入等体积的封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液、5-10％蔗糖、0.5-1％BSA pH值7.4，4℃放置过夜，弃去封闭液，自然干燥后，用铝箔袋真空密封；

2)检测操作步骤：

a.向微孔板各孔中加入等体积HA校准品或待测样本；

b.向微孔板各孔中加入等体积HABP-Eu3+；

c.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应60分钟；

d.吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，末次洗板后将板拍干；

e.各孔中加入等体积增强液；

f.将微孔板放入振荡器上，室温振荡反应5-10分钟；

g.将微孔板放入时间分辨仪上检测各孔荧光值；

2.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法：

与HA偶联的BSA用其它蛋白或者多肽替代。

3.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法：

上述微孔板用塑料试管或塑料珠适宜包被的材料替代。

4.如权利要求1所述的一种检测人血清中透明质酸含量的方法：

用于HABP标记的铕(Eu)用其它镧系元素的三价金属离子钐(Sm)、镝(Dv)或锝(Te)替代，或者被酶或其它荧光物质或化学发光标记物替代，并用相应的仪器进行检测。