CN102692408A

CN102692408A - 透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

Info

Publication number: CN102692408A
Application number: CN2012101252208A
Authority: CN
Inventors: 白云鹏
Original assignee: Beijing North Institute of Biological Technology
Current assignee: BEIJING NORTH INSTITUTE OF BIOLOGICAL TECHNOLOGY
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2032-04-26
Also published as: CN102692408B

Abstract

本发明涉及一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸含量检测的化学发光法试剂盒，属免疫分析医学范畴。其采用固相包被及间接标记酶技术，从根本上解决了透明质酸试剂盒不能一步法检测的难题，可以让操作更方便，让检测更准确，让试剂更稳定。本发明试剂盒包括有校准品；包被板；酶结合物和化学发光底物液A和B。试剂盒中HA校准品和酶结合物的加样量均为50μl，一步法，反应时间1小时。通过严谨的方法学鉴定，确定了科学合理的正常值范围，并对临床测值结果与放免法试剂盒进行统计学比较，表明试剂盒具备灵敏度高，测值准确，重复性好，试剂稳定等诸多技术优点，值得市场的大力推广和应用。

Description

透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)含量检测的化学发光试剂盒。属于免疫分析医学范畴。

背景技术

近年来的临床医学陆续发现透明质酸含量变化与肿瘤的生长、浸润和扩散密切相关，尤其发现检测血清HA对诊断肿瘤有一定价值，可作为区分良、恶性肿瘤的一个重要指标。它还有助于肝病的诊断和鉴别诊断、病情判断和预后评估，还是抗纤维化药物治疗的一个非常重要的动态观察手段。

目前，HA的检测方法主要以放射免疫方法为主，文献CN1047391A公开了一种放射免疫方法检测透明质酸(H A)含量的方法。它将碘标记的HA(¹²⁵I-HA)与未知量标本中的H A共同竞争加入的透明质酸结合蛋白(HABP)，再用第一抗体、第二抗体将结合复合物沉淀下来，测其放射性计数，通过标准品的浓度-计数关系计算出拟合方程，根据样本放射性计数反推出其中的HA含量来。这是一种比较灵敏、准确的透明质酸检测方法。但是上述方法也存在一定的缺陷：一、加样步骤繁琐。整个实验包括三步加样和离心等过程，反应的总计时间达到2个多小时；二、试剂盒操作自动化程度低，试剂盒的有效期也很短。只有30-45天；三、使用¹²⁵I作为标记物，对环境产生放射性污染，对操作人员健康有潜在危害。

同样，在市场上也有一部分的HA化学放光和酶联检测试剂，据了解，它们大多数都是采用三步法反应模式，免疫反应的时间一般都要1.5-2个小时左右，可以说操作起来都比较繁琐。究其原因在于这些试剂盒都借助了HA与HABP之间的结合反应，而HABP是一个成分和结构比较复杂的蛋白，提纯工艺复杂，纯度也不会太高，且其与HA的结合力没有像抗原和抗体的结合力那么强，所以，一、不能用它直接包被，干扰因素比较多，造成试剂的重复性差。二、不能用它直接标记，HABP某些活性基团极易失活，造成试剂的稳定性差。

本发明从根本上解决了透明质酸试剂盒不能一步法检测的难题，可以让操作更方便，让检测更准确。其反应原理为：预先在固相载体(例如96孔微孔板)上包被HA，再依次加入校准品或样品和HA酶结合物，反应过程中固相包被HA与样本中的HA共同与限量的HABP-anti-HABP-HRP进行竞争性结合反应，经过一定的反应温度和反应时间，经洗涤除去某些游离成分，最终在固相板上形成HABP-anti-HABP-HRP的复合物。校准品或样本中的HA含量越高，在包被板上形成的复合物就越少。测定时，先洗去包被板中的液体，再加入发光底物液A和B，发光底物液中的化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，会释放等能级的光子，对光子进行测定从而实现定量分析。

本试剂盒的突出技术优势具体在于：

(1)采用化学发光定量测定方法，充实了透明质酸的免疫检测手段，进一步突出了方法学具有的灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，试剂稳定性好等优点。本发明试剂盒所有组分从缓冲液到原材料再到制备条件均经过了最优化筛选与配比，大大提高了试剂盒的的灵敏度，特异性，检测范围和准确性。试剂盒的底物系统使用鲁米诺(Luminol)/过氧化氢/辣根过氧化物酶(HRP)/对碘苯酚(p-iodophenol)底物发光系统，其在精心配比的Tris-HCL缓冲液中延长了底物系统发光持续时间，1小时内对样品的测定值变化在10％以内，大大提高了测定结果的稳定性。

同时，本试剂盒适用于开放式化学发光检测仪器，更有利于其进一步推广和应用。

(2)液体试剂可直接使用，无需提前配制；可拆卸板条最大满足实验设计要求。

(3)一步法反应，操作极为简单，只需向微孔中连续加入校准品或样本及HA酶结合物，反应1小时即可。

(4)间接法形成酶结合物，从根本上解决辣根过氧化物酶直接标记HABP存在的不稳定、易失活的问题，试剂盒的稳定性大大改善，有效期可以达到6个月，而且测定结果的重复性也明显提高。

(5)采用LogX-(1-B/B₀)拟合方法进行数据处理，避免个别低值血样发光值偏出标准曲线范围，无法计算的弊病。

本试剂盒在具备了灵敏度高，测值准确，重复性好，试剂稳定，有效期长，等技术优势的基础上，科学性、创新性地解决了HA酶促法(化学发光和酶联法)试剂普遍存在的技术难题，大大简化了操作步骤，令其独特品质在国内的HA非放试剂中名列前茅。

发明内容

一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)含量检测的化学发光试剂盒。

本发明所提供的检测透明质酸的化学发光试剂盒包括：1)HA校准品2)HA包被板3)HA酶结合物4)化学发光底物液A和化学发光底物液B。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA校准品内含有经准确定值的HA抗原。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA包被板上包被有与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)。

上述本发明的试剂盒中，所述的用于HA包被板的HA-BSA其制备方法如下：准确称取5mg HA抗原，溶解于2ml 0.1mol/L pH 5.6磷酸盐缓冲液(PB)加10mg牛血清白蛋白，溶解后加5mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)4℃反应17-20小时，装入透析袋于1000ml 0.01mol/L pH7.4PB中透析，换液4次，取出冻存于-15℃以下备用。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物是由透明质酸结合蛋白(HABP)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的HABP抗体分别按体积比1∶2000和1∶6500稀释到酶稀释液中(含50mmol/L PB，0.25％BSA，10％丙三醇)，经过4℃20小时二者充分反应后配制而成。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中HABP的制备方法如下：取新鲜牛鼻软骨，洗净后切成小块，加入4mol/L盐酸胍，制成均浆，4℃提取30小时，抽提液13000g离心1小时，上清液对水透析，冷冻干燥后即得HABP粗品，HABP粗品1.6g，溶于25ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.3)中，加入5mg胰蛋白酶，于37℃温育2小时，加入1mg大豆胰蛋白酶拟制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g盐酸胍，用0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液补足体积至50ml，与亲和层析凝胶混合，置于透析袋中，对蒸馏水透析，4℃过夜，透析后将凝胶装柱，依次用1mol/L和3mol/L的氯化钠(NaCl)梯度洗脱未吸附物及杂蛋白，然后用4mol/L盐酸胍洗脱，分步收集洗脱液，各组份分别取少量与碘标记HA(¹²⁵I-HA)反应，合并与¹²⁵I-HA有结合的组份，对水透析后，用PEG20000进行浓缩成3mg/ml，冻存于-15℃以下保存。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中HABP抗体的制备方法如下：采用常规免疫法将HABP按照0.5mg/kg的免疫剂量融合完全佐剂多点注射到大耳白实验用兔子的背部皮下，间隔15天后相同方法、相同免疫剂量注射HABP融合的不完全佐剂，共免疫5次，颈动脉取血，分离出血清，测定血清滴度，硫酸铵2次分级沉淀得到兔IgG，透析于2000ml 50mmol/L pH7.4PB缓冲液中过夜，透析4次后取出，冻存于-15℃以下备用。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA酶结合物中酶标记HABP抗体的制备方法如下：采用改良高碘酸钠氧化法将HABP抗体与辣根过氧化物酶(HRP)联结：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO4)溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，对1mmol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg HABP抗体在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4PB透析，4℃过夜。

上述本发明的试剂盒中，所述的化学发光底物液A的制备方法为：6mmol/L过氧化氢，50mmol/L pH7.1Tris-HCL缓冲液；化学发光底物液B的制备方法为：4mmol/L Luminol，1.2mmol/L p-iodophenol，50mmol/L pH8.6Tris-HCl缓冲液。

上述本发明的试剂盒中，所述的数据拟合方法为以校准品的标示浓度的Log值为横坐标，以(1-B/B₀)值为纵坐标的数学拟合方程。

上述本发明的试剂盒中，所述的HA校准品和HA酶结合物的加样量均为50μl，一步法，反应时间为1小时。

上述本发明的试剂盒中，所述的与HA偶联的BSA可以被其它蛋白或多肽替代；微孔板可以被其它适宜包被的材料，如塑料试管、塑料珠等替代；用于标记的辣根过氧化物酶可以被碱性磷酸酶或其它荧光物质、化学发光标记物替代，并用相应的仪器进行检测。

附图说明

附图1为本发明检测方法的流程图

附图2：本发明与北方所放射免疫试剂盒测值相关性比较图

具体实施方式

实施例1：制备本发明的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

一、HA校准品的制备。

1、50mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)：

Na₂HPO₄·12H₂O 14.5克

NaH₂PO₄·2H₂O 1.48克

溶解于1000ml去离子水中，测其pH值为7.4。

标准品稀释液中加5％小牛血清。

2、将HA浓抗原准确稀释成25，50，100，200，400，800ng/ml几个浓度，S0为校准品稀释液，共7瓶。

二、HA包被板的制备

缓冲液1：包被液

50mmol/L pH7.4PB

缓冲液2：封闭液

50mmol/L pH7.4PB

10％蔗糖

0.5％BSA

0.1％防腐剂。

包被板的制备：将HA-BSA按比例稀释到50mmol/L pH7.4PB包被液，100μl/孔加到微孔板中，2～8℃放置过夜，扣干。加入封闭液150μl/孔，2～8℃放置过夜，弃去封闭液，扣干，待其自然干燥后，用铝箔袋真空密封后备用。

三、浓缩洗涤液的制备。

配方为：

15％NaCl

1％吐温(Tween 20)

50mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液

混合均匀，分别按20ml/瓶分装，2-8℃储存。

实施例2：本发明的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的操作方法。

以上实施例1制备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的具体操作方法为：

a.向微孔板各孔中加入50μl HA校准品或待测样本。

b.向微孔板各孔中加入50μl HA酶结合物。

c.将微孔板放置振荡器上，室温振荡反应60分钟。

d.弃去微孔板内液体，每孔加入洗涤液，静置30秒钟后吸干或甩干。如此反复洗涤5次。结束后在纸上将微孔板扣干。

e.每孔各加入50μl(1滴)底物液A和底物液B，加样完毕后将微孔板震荡混合。

f.在室温(14～28℃)环境下避光反应10分钟后在微孔发光仪上测量各孔发光值。

实施例3本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的方法学鉴定按照本领域常规制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果见

表1。

表1试剂盒的方法学鉴定结果

说明本发明试剂盒的准确性，特异性，精密性，灵敏度和稳定性是完全合格的。

实施例4本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒正常值的确定。

正常参考值指正常人(或动物)的某种生理常数，由于个体差异使这些生理常数有一定的波动范围，因此一般采用正常参考值范围的概念。即要保证大多数正常的观察值都在该范围内，习惯上可包括正常人的80％、90％、95％、99％等，最常用的是95％。就是说，如果正常百分界限采用95％，则在正常参考值范围之外尚有5％。在确定正常值时，首先要保证样本的数量足够大(一般n≥100)，在数据处理时则可近似用样本均数X和样本标准差S代替总体均数和总体标准差来计算正常值范围。本试剂盒随机取350份健康体检人血清，用实施例1制备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒进行检测，统计求得350份样品的平均值av，标准偏差SD，同时以平均值加2倍SD作为正常值的上限。如下表2所示。

表2试剂盒正常值结果

结果表明，本发明试剂盒的正常值的上限为小于等于100.0ng/ml。

实施例5本发明透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒北方所放射免疫试剂盒临床检测结果一致性的比较。

使用实施例1制备的透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒和北京北方生物技术研究所生产的透明质酸放射免疫分析药盒(批准文号为：国药准字S20083010)测定160例临床样品，其中阳性病例达到10％以上。严格按试剂盒说明书操作，对检验的结果进行t测验，相关系数r分析和四格表统计分析。结果见表3。

表3本发明试剂盒与放免试剂盒测值结果一致性比较结果

综上所述，本发明试剂盒与放免试剂盒的测定结果具有很高的一致性。说明两种方法具有同等的使用价值。

Claims

1.一种一步法检测透明质酸(HA)的化学发光试剂盒，其特征在于试剂盒包括：1)HA校准品2)HA包被板3)HA酶结合物4)化学发光底物液A和化学发光底物液B。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的HA包被板上包被有与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的HA-BSA按照如下方法制备：准确称取5mg HA抗原，溶解于2ml 0.1mol/L pH 5.6磷酸盐缓冲液(PB)加10mg牛血清白蛋白，溶解后加5mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)4℃反应17-20小时，装入透析袋于1000ml 0.01mol/L pH7.4PB中透析，换液4次，取出冻存于-15℃以下备用。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的HA酶结合物是由透明质酸结合蛋白(HABP)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的HABP抗体分别按体积比1∶2000和1∶6500稀释到酶稀释液中(含50mmol/L PB，0.25％BSA，10％丙三醇)，经过4℃20小时二者充分反应后配制而成。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中HABP的制备方法如下：取新鲜牛鼻软骨，洗净后切成小块，加入4mol/L盐酸胍，制成均浆，4℃提取30小时，抽提液13000g离心1小时，上清液对水透析，冷冻干燥后即得HABP粗品，HABP粗品1.6g，溶于25ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.3)中，加入5mg胰蛋白酶，于37℃温育2小时，加入1mg大豆胰蛋白酶拟制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g盐酸胍，用0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液补足体积至50ml，与亲和层析凝胶混合，置于透析袋中，对蒸馏水透析，4℃过夜，透析后将凝胶装柱，依次用1mol/L和3mol/L的氯化钠(NaCl)梯度洗脱未吸附物及杂蛋白，然后用4mol/L盐酸胍洗脱，分步收集洗脱液，各组份分别取少量与碘标记HA(¹²⁵I-HA)反应，合并与¹²⁵I-HA有结合的组份，对水透析后，用PEG 20000进行浓缩成3mg/ml，冻存于-15℃以下保存。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于其中HABP抗体的制备方法如下：采用常规免疫法将HABP按照0.5mg/kg的免疫剂量融合完全佐剂多点注射到大耳白实验用兔子的背部皮下，间隔15天后相同方法、相同免疫剂量注射HABP融合的不完全佐剂，共免疫5次，颈动脉取血，分离出血清，测定血清滴度，硫酸铵2次分级沉淀得到兔IgG，透析于2000ml 50mmol/L pH7.4PB缓冲液中过夜，透析4次后取出，冻存于-15℃以下备用。

7.如权利要求4，5或6所述的试剂盒，其特征在于其中酶标记HABP抗体的制备方法如下：采用改良高碘酸钠氧化法将HABP抗体与辣根过氧化物酶(HRP)联结：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO₄)溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mmol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg HABP抗体在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4PB透析，4℃过夜。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的化学发光底物液A的制备方法为：6mmol/L过氧化氢，50mmol/L pH7.1Tri s-HCL缓冲液；化学发光底物液B的制备方法为：4mmol/L Luminol，1.2mmol/L p-iodophenol，50mmol/L pH8.6Tris-HCl缓冲液。