CN103499566B - T3化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T3化学发光体外诊断试剂盒，本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T3的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种T3检测试剂盒，具体涉及一种T3化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
甲状腺素(T4)与3,5,3'—三碘甲腺原氨酸(T3)是两种重要的甲状腺激素。T3主要产生于外周组织，由T4脱去的5'位上的碘基而成。正常人体内大约有80%的T3在外周组织转化产生，仅有约20%的T3直接由甲状腺分泌。极少量的T4也会脱碘形成没有生物活性的反T3(3,3',5'—三碘甲腺原氨酸)，不过在某些条件下，反T3的比例也会增加，例如手术紧张或心肌梗塞引起T3的产生减少.有大量的研究证明T3是最重要的甲状腺激素，并且一些研究者认为T4并无内在的活性。T3水平会因为甲状腺功能改变或T4外周代谢的而变化。甲状腺受到来自垂体的促甲状腺激素(TSH)的调控，而后者又受到下丘脑促甲状腺激素释放激素(TRH)的调节。同时，T3对垂体激素水平存在一种负反馈调节。在正常情况下，T3水平略微升高将抑制TSH的释放，而这种抑制不能通过增加TRH的剂量而改变。在血液中，T3、T4都以同血浆蛋白结合的形式存在，主要是与甲状腺结合球蛋白（TBG）结合；TBG同T4的亲合力要远大于同T3的亲合力。其他与T3结合的蛋白还有白蛋白和前白蛋白。血清中大约有80％的T3同TBG结合，有10％同白蛋白和前白蛋白结合，只有0.5％以游离形式存在（未与血清蛋白结合）。T3以前一直用放射免疫分析（RIA），放射免疫分析它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，因此能精确测定各种具有免疫活性的极微量的物质，但是放射免疫分析存在放射线辐射和污染等问题，用ELISA方法快速简便，既有放射免疫分析的优点，同时也减少了污染。
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和固相抗原竞争结合酶标抗体，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗体以同样的机会与固相抗原结合，竞争性地占去了酶标抗体与固相载体结合的机会，使酶标抗体与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗体，保温后，酶标抗体与固相抗原的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加发光液显色：参考管中由于结合的酶标抗体最多，信号值最高。参考管信号值与待测管信号值的大小，代表受检标本抗原的量。待测管信号值越低，表示标本中抗原含量越多。
由于半抗原都是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。
通常在市面上比较多的T3试剂盒有放免试剂盒以及ELISA试剂盒，放免试剂盒存在诸多的地方，包括以下方面：
一，放射性
某些放射性同位素由于半衰期短不利于储存和运输，同时由于放射性物质的污染对工作人员的健康以及环境也造成了一定的危害，需要特殊的防护以及废物处理等设备，大大的增加了成本。
二，灵敏度。通常ELISA试剂盒的分析灵敏度可达到10-13mol/L，固相放免试剂盒的分析灵敏度刻达到10-16mol/L。
三，有效期
一般来说，放免只能保存3个月，ELISA试剂盒保存6个月。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种T3化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法。本发明对于那些极性强，分子量小的半抗原无法包被于固相载体进行检测，提供了一种使用方便的试剂盒，解决了半抗原包被不佳的情况，便于快速、灵敏的进行T3的检测。
本发明的一种T3化学发光体外诊断试剂盒及其使用方法技术方案为，该T3化学发光体外诊断试剂盒，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原T3耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的T3抗原；酶结合物中含有T3酶标抗体。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
微孔板中含有的小分子耦联蛋白，是将小分子半抗原T3耦联载体蛋白BSA得到的小分子耦联蛋白。
所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原T3和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白。
将小分子半抗原T3和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为：
①平衡EDC，NHS至室温；
②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解；
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC；再室温反应10-20分钟；
④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA；
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T3，室温反应1.5-3小时；
⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T3；
⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
步骤②中活化缓冲液包括：0.1M的MES，0.5M的NACl，调节pH为6.0。
步骤②中EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL。
步骤⑥中Tris为20-50mmol/L。
耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为：
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时；
③洗涤一次后，放入真空干燥箱4-6小时；
④真空封袋后，放入4度冰箱。
其中，步骤①中的包被液为，氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的混合水溶液，其中还可以含有防腐剂。
上述的T3化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀，37℃反应50-80分钟；
②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；
③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T3的量。
浓缩洗涤液加纯水稀释为洗涤液（例：20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液）。
本发明的有益效果为：本发明的试剂盒使用方便，本发明运用化学发光法定量检测，可以使其检测范围更加宽广，增加其灵敏度，精密度实验也优于一般的ELISA方法。而对比市面上的化学方法定量检测试剂盒，本发明试剂盒用的为间接法，通过包被小分子半抗原，采用竞争法检测T3。
小分子抗原，又称为半抗原，这些小分子本身没有免疫原性，当与载体结合后形成大分子，可以获得免疫原性。半抗原与载体形成的免疫原，当半抗原分子量极小，或则极性较大时，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板条上，使用BSA偶联小分子，可以形成较大的分子量，通过疏水作用就容易吸附于固相载体上，这样的方法灵敏度高，高度的特异性和灵敏性，能使分析过程简化。
EDC将T3和载体进行耦联。EDC能与载体蛋白BSA形成一种活泼的酯结构，半抗原T3的基团上有羧基基团，能使之与BSA-EDC反应，可以形成BSA-T3偶联物。
采用竞争法检测小分子半抗原T3，该方法的好处在于操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值（被抑制一半时抑制剂的浓度）较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，灵敏度和精确度较高。而采用包被抗体的方法很容易造成包被过量影响IC50值，并且小分子的标记通常不能采用经典的过碘酸钠法，需要采用其他的化学方法，EDC。NHS/EDC等，对酶的活性有一定的影响。
本发明的试剂盒还有以下特点：
1.非放射性化学发光试剂盒则完全抛弃了放射性同位素，因此不仅消除了对环境和操作者的危害，而且也使试剂的稳定性和有效期大大的延长。同时由于发光信号可以再短时间内自行消失，因此容易实现连续，动态，重复测定。
2.高灵敏度化学发光试剂盒的分析灵敏度可达到10-18mol/L。如果每次以加样量为50ul，按摩尔常数为6.02×1023计算，此时样本中仅有几十个待测分子，这个灵敏度已经达到了免疫检测技术的极限了。
3.长有效性化学发光完全抛弃了放射性同位素，因此彻底摆脱了半衰期的限制，使试剂的稳定性以及有效期大大的延长了。化学发光的试剂盒可以达到1年多。
附图说明：
图1所示为竞争法原理图；
图2所示为校准品趋势图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
材料：
活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0；
载体蛋白：BSA；
目的蛋白：小分子半抗原T3；
NHS；巯基乙醇；脱盐柱
将小分子半抗原T3和载体蛋白进行耦联，
①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为50mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为5mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T3），室温反应2小时。
⑥加入30mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T3）。
⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心4次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备：
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后，放入4度冰箱。
其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备：用T3抗原、样品稀释液（1%BSA溶解于PH7.4的PBS溶液中）分别配制浓度为0.5、2、10、35、60、100nmol/L的6个校准品、10、60nmol/L的2个质控品。
酶结合物制备：
用T3酶标抗体、酶稀释液（20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中）配制成一定浓度的酶结合物。
试剂盒的使用：
①分别向微孔板中加入50uL校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入100uL酶标抗体，分别与校准品、质控品和待测样本充分混匀，37℃反应60分钟。
②浓缩洗涤液加纯水稀释为1×洗涤液（例：20×浓缩洗涤液50ml+950ml的纯水即为1×洗涤液），加入洗涤液洗涤四次，每次加洗涤液量为350uL。
③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中T3抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果：
表1：校准品结果
| 梯度(nmol/L) | 0.5 | 2 | 10 | 35 | 60 | 100 |
| 信号值 | 3452 | 2681 | 1650 | 696 | 400 | 74 |
表2：待测样本结果
| 样本值 | 信号值 | 检测值 |
| 3.86 | 1752 | 3.37 |
| 9.01 | 1320 | 7.99 |
| 10.25 | 1086 | 12.76 |
| 5.22 | 1699 | 3.74 |
| 25.15 | 803 | 22.47 |
| 1.96 | 2012 | 2.00 |
| 2.68 | 1942 | 2.30 |
| 7.26 | 1225 | 9.66 |
| 16.32 | 1006 | 14.97 |
| 1.31 | 2154 | 1.51 |
其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=3.1，样本值与本发明试剂盒检测值相关性：97.69%
实施例2
材料：
活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0
载体蛋白：BSA；
目的蛋白：小分子半抗原T3
NHS；巯基乙醇；脱盐柱
将小分子半抗原T3和载体蛋白进行耦联，
①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为55mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T3），室温反应2小时。
⑥加入20mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T3）。
⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心3次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备：
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后，放入4度冰箱。
其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。
试剂盒的使用：
①依次往微孔板中加入50uL校准品（或样本），100uL酶标（抗原），充分混匀，37℃反应60分钟。
②洗涤五次，每次加样量为350uL。
③然后加入发光液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出待测样本中T3抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果：
表3：校准品结果
| 梯度(nmol/L) | 0.5 | 2 | 10 | 35 | 60 | 100 |
| 信号值 | 3662 | 2712 | 1803 | 782 | 391 | 88 |
表4：待测样本结果
| 样本值 | 信号值 | 检测值 |
| 1.58 | 2011 | 2.01 |
| 3.62 | 1762 | 3.30 |
| 2.15 | 2003 | 2.04 |
| 4.22 | 1598 | 4.58 |
| 30.05 | 569 | 35.88 |
| 0.84 | 2815 | 0.40 |
| 2.87 | 2033 | 1.92 |
| 50.21 | 452 | 45.34 |
| 9.79 | 1337 | 7.72 |
| 2.61 | 1774 | 3.22 |
其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=3.1，样本值与检测值相关性：98.67%。
实施例3
材料：
活化缓冲液：0.1MMES，0.5MNACl，pH6.0
载体蛋白：BSA；
目的蛋白：小分子半抗原T3
NHS；巯基乙醇；脱盐柱
将小分子半抗原T3和载体蛋白进行耦联方法为，
①平衡EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），NHS（N-羟基丁二酰亚胺）至室温。
②将EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45mg/mL，BSA（牛血清白蛋白）用活化缓冲液溶解，终浓度为5.0mg/mL。
③将200uLEDC溶液与500uLBSA溶液混合后，加入200uLNHS溶液，室温反应15分钟，后加入100uLEDC。再反应15分钟。
④加入1.4uL巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白（EDC-BSA）。
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的蛋白（小分子半抗原T3），室温反应2小时。
⑥加入50mmol/LTris终止反应，得到耦联蛋白（BSA-T3）。
⑦加入脱盐柱，脱盐柱先以1000g，2min将里面的储存液排出，然后加入0.01MPBS以同样的转速离心2次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物。
试剂盒微孔板制备：
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液200uL。37度放置2小时。
③洗涤一次后，放入真空干燥箱5小时。
④真空封袋后，放入4度冰箱。
其中，步骤①中的包被液为，1L纯水中含有氯化钠8.5g，磷酸二氢钠0.58g，磷酸氢二钠5.8g。
校准品、质控品制备和酶结合物制备同实施例1。
试剂盒的使用：
①依次往微孔板中加入50uL校准品（或样本），100uL酶标（抗原），充分混匀，37℃反应60分钟。
②洗涤四次，每次加样量为350uL。
③然后加入发光液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据得出校准品或样本中T3抗原的量。
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶温度剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20。
实验结果：
表5：校准品结果
| 梯度(nmol/L) | 0.5 | 2 | 10 | 35 | 60 | 100 |
| 信号值 | 3328 | 2697 | 1799 | 732 | 366 | 79 |
表6：待测样本结果
| 样本值 | 信号值 | 检测值 |
| 12.78 | 1245 | 9.28 |
| 147.86 | 107 | 90.40 |
| 2.01 | 2065 | 1.80 |
| 5.01 | 1235 | 9.47 |
| 8.22 | 1125 | 11.80 |
| 3.61 | 1784 | 3.16 |
| 1.26 | 2688 | 0.52 |
| 7.12 | 1157 | 11.07 |
| 6.44 | 1601 | 4.56 |
| 16.58 | 806 | 22.34 |
其中样本值为罗氏411仪器测得，cutoff=3.1，样本值与检测值相关性：98.82%。
由以上实施例可见，本发明试剂盒操作简单，一步完成，包被一般不会出现过量包被造成IC50值（被抑制一半时抑制剂的浓度）较高，并且游离的抗原更容易和标记的抗体进行反应，检测范围更加宽广，检测灵敏度和精确度较高。
Claims (1)
1.一种T3化学发光体外诊断试剂盒，其特征在于，包括微孔板、校准品、质控品、酶结合物、发光底物液和浓缩洗涤液；其中微孔板中含有小分子半抗原T3耦联载体蛋白得到的小分子耦联蛋白；校准品与质控品为已知浓度的T3抗原；酶结合物中含有T3酶标抗体；
发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A含有鲁米诺，发光底物液B含有辣根过氧化物酶稳定剂、过氧化氢；浓缩洗涤液中含有氯化钠和吐温-20；
所述的小分子耦联蛋白，为使用EDC将小分子半抗原T3和载体蛋白BSA进行耦联得到的小分子耦联蛋白；
将小分子半抗原T3和载体蛋白BSA进行耦联具体方法为：
①平衡EDC，NHS至室温；
②将EDC、NHS、BSA分别用活化缓冲液溶解；活化缓冲液包括：0.1M的MES，0.5M的NaCl，调节pH为6.0；EDC用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，NHS同样用活化缓冲液溶解，终浓度为45-55mg/mL，BSA用活化缓冲液溶解，终浓度为4.5-5.5mg/mL；
③将2-4体积份的EDC溶液与5-10体积份BSA溶液混合后，加入与EDC等量的NHS溶液，室温反应10-20分钟，后再加入1-2体积份的EDC；再室温反应10-20分钟；
④加入巯基乙醇终止EDC反应，得到活化蛋白EDC-BSA；
⑤加入与活化蛋白等摩尔的目的小分子半抗原T3，室温反应1.5-3小时；
⑥加入Tris终止反应，得到耦联蛋白BSA-T3；Tris为20-50mmol/L；
⑦加入脱盐柱，将里面的储存液排出，然后加入PBS以同样的转速离心3-5次后，加入反应的耦联蛋白，离心后，即为耦联产物；
耦联好的蛋白包被方式制备试剂盒，步骤为：
①将含有定量小分子耦联蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小时；
②甩干板条，加入封闭液，37度放置2小时；
③洗涤一次后，放入真空干燥箱4-6小时；
④真空封袋后，放入4度冰箱；
所述的T3化学发光体外诊断试剂盒的使用方法，
①分别往微孔板中加入校准品、质控品和待测样本，再往微孔板中加入酶结合物，充分混匀，37℃反应50-80分钟；
②加入洗涤液洗涤3-6次，每次加洗涤液量为300-400uL；
③然后向微孔板中加入发光底物液，放入化学发光分析仪中读数，计算数据，得出待测样本中小分子半抗原T3的量;
所述T3为3,5,3'—三碘甲腺原氨酸，EDC为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺。
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| CN101054410A (zh) * | 2005-03-29 | 2007-10-17 | 河南科技学院 | 鸡ibdv vp2蛋白中和性b细胞抗原表位ⅲ及其应用 |
| CN102095882A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 游离三碘甲状腺原氨酸化学发光定量检测试剂盒 |
| CN102692408A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-09-26 | 北京北方生物技术研究所 | 透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒 |
| CN103217414A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-07-24 | 江苏创生生物技术有限公司 | 血清中3,5,3’-三碘甲腺原氨酸的化学发光免疫测定方法 |
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2013
- 2013-09-06 CN CN201310403122.0A patent/CN103499566B/zh active Active
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Denomination of invention: T3 chemiluminescence in vitro diagnostic kit and its use method Effective date of registration: 20230113 Granted publication date: 20160224 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch Pledgor: SHANGHAI YULONG MEDICAL LABORATORY CO.,LTD. Registration number: Y2023310000007 |