CN108089005A - 一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒包括包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液，磁微粒固相抗体的包被浓度为1.0‑2.0μg/T；甲胎蛋白系列校准品采用PH为7.4的Tris稀释液基质，加入甲胎蛋白WHO标准品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成；辣根过氧化物酶采用过碘酸钠氧化法标记甲胎蛋白单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及洗液，洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。该发明磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒具有成本低、易自动化、制备方法简单、操作简单便捷且检测性能达到国际先进水平等优点。

Description

一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲胎蛋白（AFP）是人胎儿血清中的一种胚胎专一性甲种球蛋白，是单一多聚体肽键蛋白，由590个氨基酸组成，分子量约70KD，含糖4%，主要由胎肝和卵黄囊合成，其次是胃肠道粘膜，肾脏也可少量合成。
甲胎蛋白（AFP）是迄今为止发现的原发性肝癌最灵敏、最特异的肿瘤标志物，75-90%的原发性肝癌患者呈现水平升高。通过观察血清AFP的动态变化可了解患者病情进展状态。治疗后病人血清中AFP浓度的下降通常预示着成功的治疗，而AFP浓度上升则相反提示肿瘤组织的残留或复发。检测血清AFP含量是诊断原发性肝癌的重要手段之一。由于方法学的不断改进，使原发性肝癌的阳性检出率达到了85-90%以上。中国肝癌研究协会报导正常人血清AFP＜20ng/ml。而原发性肝癌患者血清AFP多数在500ng/ml左右。目前国内多采用年全国肝癌防治协作会议拟定的单项AFP诊断肝癌的标准：定量≥500ng/ml，持续一个月以上，并能排除妊娠，活动性肝病，生殖腺胚胎性肿瘤等。血液中甲胎蛋白AFP水平对于肿瘤的早期发现，病情的发展、治疗后的评价、监测复发和转移等方面都具有一定的应用价值,可以为患者争取治疗时间，延长患者生命。其临床诊断价值已得到广泛认可，随着试剂灵敏度的不断提高，其临床应用价值也更为广泛。
目前国内的检测主要是胶体金免疫层析试验、酶免疫法、固相放射免疫法、化学发光免疫法。
（1）胶体金免疫层析试验（GICA）以硝酸纤维素膜为载体进行层析检测的技术，其试剂稳定、易于保存，附有质控带可行质量监控，是适合基层单位检测，操作简易快速、无须仪器设备的良好检测方法，但灵敏度稍低，只适合初筛。
（2）固相试验（ELISA）为酶联免疫吸附实验，由于具备保存时间长、无危害及污染、试剂稳定、可自动化检测等优点，得以迅速推广应用，目前检测各种肝炎病毒抗原抗体仍为较普遍应用的重要诊断条件，但该方法灵敏度和线性范围仍然难以达到临床应用要求。
（3）固相放射免疫法（SPRIA）广泛应用于微量可溶性抗原抗体的检测，也可用于固体组织免疫组化的检测敏感度达到ng~fg/ml水平，但仍然存在一些不足，首先用于测定放射性粒子的记录仪器十分昂贵，而且因放射性对操作人员有一定的危害性，受半衰期限制，标本无法长期保存，这就限制了广泛应用，目前在中国的临床诊断市场上逐渐衰落。
（4）化学发光免疫法（CLIA）中以磁微粒化学发光法最有发展前景，磁微粒化学发光技术是将免疫磁珠体系、化学发光体系与免疫反应体系相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。它既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫操作的简便、快速特点，易于自动化操作，在测试中不使用有害的试剂，试剂保质期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作。
在国外，磁微粒化学发光技术方法兴起于世纪年代，目前在欧美等发达国家已经成为了临床实验室广泛使用的检测技术，己进入全自动化学发光时代。而国内刚处于市场导入阶段，目前在国内市场上推广的磁微粒化学发光诊断产品均为国外进口产品，如ROCHE、ABBOTT、BECKMAN公司等。我国在磁微粒化学发光检测技术上同欧美等发达国家相比还有很大差距，国内目前的化学发光技术主要基于微孔板为载体的技术，测试时间较长，不易自动化。目前磁微粒化学发光技术在国内的研究处于起步阶段。国内医疗甲胎蛋白磁微粒化学发光诊断检测仪器依赖进口是国内甲胎蛋白医疗检测成本昂贵的主要原因。因此，国内研制一种成本低、易自动化、操作简单便捷且检测性能达到国际先进水平的磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒是十分必要的。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒具有成本低、易自动化、制备方法简单、操作简单便捷且检测性能达到国际先进水平等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为。
一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，包括包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液、甲胎蛋白系列校准品、辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及洗液。
所述磁微粒混悬液的磁微粒固相抗体的包被浓度为1.0-2.0μg/T。
所述甲胎蛋白系列校准品是采用PH为7.4的Tris稀释液基质，加入甲胎蛋白WHO标准品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成。
所述稳定剂为EDTA稳定剂。
所述辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体采用的标记方法为过碘酸钠氧化法。
所述洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
一种甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
第一步，包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备。
根据使用量秤取羧基磁微粒，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤羧基磁微粒，洗涤次数为4-6次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下进行活化，活化完成后，加磁场，静置是磁微粒与液体分开，弃去上清，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数2-3次；加入甲胎蛋白单克隆抗体进行包被，在酸性条件下静置反应，每10min摇匀一下；包被反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%BSA的封闭液进行封闭以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0.5mg/ml；
第二步，甲胎蛋白系列校准品的制备。
用PH7.4 0.5M Tris缓冲液加入1%牛血清白蛋白，再加入1%浓度的EDTA稳定剂配成校准品稀释液，甲胎蛋白WHO标准品用上述稀释液配制成标示浓度为的3000pg/ml、1000pg/ml、250pg/ml、50pg/ml、10pg/ml的一系列校准品；
第三步，辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体的制备。
（1）醛化酶溶液的制备。
秤取5mgHRP加入0.5ml PH为5.6的0.2M HAcB溶解后，加入0.06M过碘酸钠溶液0.5ml，4℃氧化15-30min，加乙二醇-氯化钠溶液0.5ml，室温作用20-30min，加入无水乙醇6.0ml混匀，1200-1500rpm离心10-15min左右，加水2.5ml溶解沉淀，即得醛化酶溶液，其浓度约为1mg醛化酶/0.5ml；
（2）醛化酶与抗体结合。
将甲胎蛋白单克隆抗体加入醛化酶溶液中，再加入0.5M PH9.6的碳酸盐缓冲液调节PH至8-9，于4-5℃，12-14h，加等量甘油混合后于-10度保存备用。
所述步骤第一步的活化剂浓度20-40mg/ml，活化时间1-2h。
所述步骤第一步的甲胎蛋白单克隆抗体包被浓度为1.0-2.0μg/T，包被时间2-3h。
所述步骤第一步制备的磁微粒混悬液置于常温保存，保存时间7-14天。
本发明的有益效果：
（1）本发明磁微粒甲胎蛋白化学发光检测试剂盒准确性均值在0.900-1.100范围内，灵敏度达到＜1.8ng/ml；剂量-反应曲线线性1.8-1000ng/ml；精密性批内变异系数（CV）＜10%，批间变异系数（CV）＜15.0%；对人血清白蛋白（500 ng/ml）、HCG（1000IU/ml）、PRL（500ng/ml）、50mg/dl胆红素、81mg/dl血红蛋白、3000mg/dl脂质均无交叉反应性。本发明检测试剂盒采用磁微粒化学发光法，选择高特异性和高灵敏度的单克隆抗体包被，检测灵敏度、特异性、稳定性等各项主要指标可以达到国内领先水平，跻身国际先进水平行列，且操作简便快速，易实现自动化操作，能够更好地满足国内临床使用需求。
（2）本发明磁微粒甲胎蛋白化学发光检测试剂盒将免疫磁珠体系、化学发光体系与免疫反应体系相结合，用于定量微量检测人血清中甲胎蛋白的含量。通过对原发性肝癌术前及术后监测、肝部良性疾病和其他肿瘤患者血清AFP合计例临床检验样本进行临床对比研究，结果显示，临床研究试剂盒与对照试剂盒相比，阴性符合率为97.85%，阳性符合率为98.32%，总符合率为98.04%，相关系数为0.9971。该研究系统顺利通过了中国药品生物制品检定所质量检定，各项性能指标优异。本发明磁微粒化学发光检测试剂盒操作简便快速，且易实现自动化操作，进入临床使用后在提高临床检测水平的同时还能大大降低现有检验成本，更好地满足国内临床使用需求。
附图说明
图1本发明的检测原理示意图。
图2本发明的考核试剂盒与对比试剂盒对照图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒包括包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液，磁微粒固相抗体的包被浓度为1.0-2.0μg/T；甲胎蛋白系列校准品采用PH为7.4的Tris稀释液基质，加入甲胎蛋白WHO标准品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成；辣根过氧化物酶采用过碘酸钠氧化法标记甲胎蛋白单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及洗液，洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
本发明甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
第一步，包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备。
根据使用量秤取羧基磁微粒，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤羧基磁微粒，洗涤次数为4-6次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下进行活化，活化剂浓度20-40mg/ml，活化时间1-2h，活化完成后，加磁场，静置是磁微粒与液体分开，弃去上清，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数2-3次；加入甲胎蛋白单克隆抗体进行包被，包被浓度为1.0-2.0μg/T，包被时间2-3h，在酸性条件下静置反应，每10min摇匀一下；包被反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%BSA的封闭液进行封闭以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0.5mg/ml，磁微粒混悬液置于常温保存，保存时间7-14天。
第二步，甲胎蛋白系列校准品的制备。
用PH7.4 0.5M Tris缓冲液加入1%牛血清白蛋白，再加入1%浓度的EDTA稳定剂配成校准品稀释液，甲胎蛋白WHO标准品用上述稀释液配制成标示浓度为的3000pg/ml、1000pg/ml、250pg/ml、50pg/ml、10pg/ml的一系列校准品。
第三步，辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体的制备。
（1）醛化酶溶液的制备
秤取5mgHRP加入0.5ml PH为5.6的0.2M HAcB溶解后，加入0.06M过碘酸钠溶液0.5ml，4℃氧化15-30min，加乙二醇-氯化钠溶液0.5ml，室温作用20-30min，加入无水乙醇6.0ml混匀，1200-1500rpm离心10-15min左右，加水2.5ml溶解沉淀，即得醛化酶溶液，其浓度约为1mg醛化酶/0.5ml。
（2）醛化酶与抗体结合。
将甲胎蛋白单克隆抗体加入醛化酶溶液中，再加入0.5M PH9.6的碳酸盐缓冲液调节PH至8-9，于4-5℃，12-14h，加等量甘油混合后于-10度保存备用。
2、反应体系。
样本类型：血清；加样量：25微升样本+50微升磁微粒+50微升样本稀释液，37℃反应15分钟，洗涤6次，100微升酶结合物，37℃反应15分钟，洗涤6次；加入底物后在10分钟内测定。
3、实验前准备。
①取1瓶浓缩洗液按标签上标识的稀释比例要求稀释备用。 ②将恒温箱或水浴锅温度调至37℃，待温度稳定后使用。 ③将磁微粒混悬液充分混匀至无肉眼可见沉淀。
4、实验方法。
①取出一定量的反应容器，编号。根据实验要求加入25μl临床血清。
②摇匀磁微粒混悬液，每孔分别加入20μl。
③每孔分别加入50μl样本稀释液。
④将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15分钟。
⑤使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤6次。
⑥每孔分别加入酶标记物100μl l。
⑦将反应容器内溶液混合均匀，37℃温育15分钟。
⑧使用磁分离及洗涤设备，将反应容器中磁微粒用洗液洗涤6次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
⑨每孔加入发光底物A和发光底物B各50μl，振荡混匀后10分钟内测定。
5、性能检测。
（1）本发明试剂盒加速稳定性：按照上述操作方法分别对放置度4℃、37℃10天的整套试剂进行性能测试，确定试剂盒的性能指标,结果如下：
（2）本发明试剂盒实时稳定性：2-8℃存放14个月后进行性能测试，确定试剂盒的性能指标,结果如下：
结果显示试剂盒在2-8℃储存14个月后各项性能指标仍符合要求，只是发光值随时间的延长有所降低，这与加速稳定性的试验结果相一致，为保证试剂盒在实际应用中的有效性和安全性,我们确定试剂盒的有效期为12个月。
（3）临床研究。
对1173例临床检验样本进行对比检测，结果显示，本发明考核试剂盒与对照试剂盒相比，阴性符合率为97.85%，阳性符合率为98.32%，总符合率为98.04%，相关系数为0.9971。可以用于临床含量的检测。
对比试剂盒是郑州安图绿科生物工程有限公司生产的甲胎蛋白定量测检测剂盒，注册证号为国药准号S20050091。本发明考核试剂盒与对比试剂盒的检测结果进行回归分析，二者测定结果的相关性较好，相关系数R为0.9943，相关曲线如图2所示。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。。

Claims (10)

1.一种磁微粒甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液、甲胎蛋白系列校准品、辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及洗液。
2.根据权利要求1所述的甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述磁微粒混悬液的磁微粒固相抗体的包被浓度为1.0-2.0μg/T。
3.根据权利要求1所述的甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述甲胎蛋白系列校准品是采用PH为7.4的Tris稀释液基质，加入甲胎蛋白WHO标准品、牛血清白蛋白及稳定剂配制而成。
4.根据权利要求3所述的甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为EDTA稳定剂。
5.根据权利要求1所述的甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体采用的标记方法为过碘酸钠氧化法。
6.根据权利要求1所述的甲胎蛋白化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述洗液为含有稳定剂和表面活性剂的磷酸盐缓冲液。
7. 一种根据权利要求1所述的甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤如下：
第一步，包被有甲胎蛋白单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
根据使用量秤取羧基磁微粒，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤羧基磁微粒，洗涤次数为4-6次，用过量的EDC和NHS在酸性条件下进行活化，活化完成后，加磁场，静置是磁微粒与液体分开，弃去上清，用PH为7.6的0.01M的PBS缓冲液洗涤以洗去多余的活化剂，洗涤次数2-3次；加入甲胎蛋白单克隆抗体进行包被，在酸性条件下静置反应，每10min摇匀一下；包被反应结束后加磁场，静置使磁微粒与液体分开，弃去上清，用含有1%BSA的封闭液进行封闭以保存磁微粒，使磁微粒的最终浓度为0.5mg/ml；
第二步，甲胎蛋白系列校准品的制备
用PH7.4 0.5M Tris缓冲液加入1%牛血清白蛋白，再加入1%浓度的EDTA稳定剂配成校准品稀释液，甲胎蛋白WHO标准品用上述稀释液配制成标示浓度为的3000pg/ml、1000pg/ml、250pg/ml、50pg/ml、10pg/ml的一系列校准品；
第三步，辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白单克隆抗体的制备
（1）醛化酶溶液的制备
秤取5mgHRP加入0.5ml PH为5.6的0.2M HAcB溶解后，加入0.06M过碘酸钠溶液0.5ml，4℃氧化15-30min，加乙二醇-氯化钠溶液0.5ml，室温作用20-30min，加入无水乙醇6.0ml混匀，1200-1500rpm离心10-15min左右，加水2.5ml溶解沉淀，即得醛化酶溶液，其浓度约为1mg醛化酶/0.5ml；
（2）醛化酶与抗体结合
将甲胎蛋白单克隆抗体加入醛化酶溶液中，再加入0.5M PH9.6的碳酸盐缓冲液调节PH至8-9，于4-5℃，12-14h，加等量甘油混合后于-10度保存备用。
8.根据权利要求7所述的甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤第一步的活化剂浓度20-40mg/ml，活化时间1-2h。
9.根据权利要求7所述的甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤第一步的甲胎蛋白单克隆抗体包被浓度为1.0-2.0μg/T，包被时间2-3h。
10.根据权利要求7所述的甲胎蛋白定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤第一步制备的磁微粒混悬液置于常温保存，保存时间7-14天。
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