CN108872594A - 一种甲胎蛋白检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括包被有AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。本发明还涉及该试剂盒的制备方法。本发明的检测试剂盒具有检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用等优点。

Description

一种甲胎蛋白检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种甲胎蛋白检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
甲胎蛋白来源于胚胎内胚层衍生相关组织细胞，主要由胎儿干细胞、卵黄囊、胃肠道及生殖器官等产生，是胎儿主要的血清蛋白。随组织器官的成熟和分化，AFP水平逐渐下降。AFP属于类白蛋白家族，编码基因位于4号染色体q臂25区，编码产物是含有591个氨基酸的糖蛋白，分子量为68kpa。在哺乳动物胚胎发育时期，AFP可以结合并转运雌二醇、胆色素、铜离子等物质，并防止胎儿的雄性化。
研究证明，成人血清AFP升高与原发性肝癌有密切联系。2017年，中国原发性肝癌诊疗规范中推荐AFP联合B超作为早期筛查指标。作为肝癌诊断的重要指标，AFP诊断标准是，排除怀孕、慢性或活动性肝炎、肝硬化、睾丸或卵巢胚胎源性肿瘤的前提下，AFP≥400μg/L。AFP与肝癌预后的生存和复发密切相关，可作为早期肝癌病人术后预后的判断指标。治疗后持续增高不降的血清AFP水平往往提示预后不佳。AFP与B超、影像学检查及与其他肝癌肿瘤标志物的联合诊断价值。妊娠早中晚期孕妇血清AFP有其变化明显规律，以孕中期最高，分娩后1年左右降至正常水平，监测孕妇血清AFP可用于辅助诊断妊娠并发症及胎儿产前监测。甲胎蛋白在部分胃肠道肿瘤患者中升高。在非癌症性肝病中，AFP水平可出现一过性升高，多在3个月内降为正常，但肝硬化可呈持续低水平。总之，对成人血清AFP水平进行检测具有重要意义。
磁微粒化学发光法是免疫分析技术的新发展，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于时间免疫分辨荧光、免疫层析及ELISA方法，具有准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；目前磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。现有技术甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测甲胎蛋白的检测试剂盒；该试剂盒检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种甲胎蛋白检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液；
所述包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2000-1:6000的比例配制；
所述AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:1000-1:4500的比例配制而成；
作为一种改进的技术方案，所述AFP校准品和所述AFP质控品均由AFP标准品与校准品稀释液配制而成，所述AFP校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；
所述AFP质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
作为一种改进的技术方案，所述包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:4500的比例配制，所述AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4000的比例配制而成。
作为一种改进的技术方案，所述校准品稀释液为pH7.2-7.5的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有8-18g酪蛋白、20-35gNa2HPO4·12H2O、2-4g Na2H2PO4·2H2O、5-15mL的小牛血清和0.3-0.5mL的Proclin-300。
作为一种改进的技术方案，所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02-0.08％v/v的吐温-20和0.02-0.06g的NaN3；
所述标本稀释液为含有小牛血清和Proclin-300、pH为7.0-7.5的0.01-0.15M的磷酸盐缓冲溶液，其中所述小牛血清含量为200-205ml，Proclin-300含量为1-1.5mL。
作为一种改进的技术方案，所述底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.01-0.2mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.01-0.2mol/L的双氧水和0.2-0.7mol/L的硝酸；
所述底物液B为0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.1-0.6g/L氢氧化钠。
本发明的第二个目的在于：提供一种甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
一种甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备AFP磁性微球混悬液
将活化后的磁微粒加磁场，用pH5-6、浓度为0.01-0.05mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗后，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；加入AFP抗体，再加磁场，用含有吐温-20、PEG2000、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:2000-1:6000稀释，制得AFP磁性微球混悬液；
(2)制备AFP校准品及质控品
用校准品稀释液将AFP标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，并以0.5mL/支对校准品和质控品进行分装、冻干；
(3)抗体的标记
a.预处理：取0.1-0.5mgAFP抗体，用0.05-0.2M、pH 7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-10℃透析10-20小时，得到AFP抗体溶液；
b.抗体标记：按照摩尔比10:1的比例取吖啶酯溶液和AFP抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液体积20-50％的1g/mL赖氨酸盐溶液反应20-60分钟，得到反应液；
c.纯化与收集：取反应液，在0.05-0.2M、pH 7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液中于2-8℃透析20-26小时，得到吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液；
(4)配制AFP示踪物工作液
将吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液与示踪物稀释液按照1:1000-1:4500的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNacl、0.2-0.8ml的吐温-20和2-6gNaN3进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01-0.2mol/L、pH 6.8-7.8磷酸盐缓冲液配制双氧水浓度为0.01-0.2mol/L和硝酸摩尔浓度为0.2-0.7mol/L的溶液；
底物液B：用0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液；
(7)配制标本稀释液
按照每1L pH7.4-7.6的PB缓冲液中还含有200-205mL的小牛血清和1-1.5ml的Proclin-300进行配制。
作为一种改进的技术方案，所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基、氨基、磺酰基任意一种活性基团的磁性微球。
作为一种改进的技术方案，所述步骤(4)中示踪物稀释液为pH7.5-7.8的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钾、0.1-1g的酪蛋白、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中标记缓冲液为0.1-0.15M、pH为7-9的CB缓冲液。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明是将双抗体夹心法免疫测定原理与超顺磁性纳米微球标记技术和直接化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方为该反应体系下的最优方案，相互配合使得本发明试剂盒线性范围宽，在1-1000ng/mL之间成良好的线性关系，其最大的可报告范围为0ng/mL-45000ng/mL，而且灵敏度高(最低检测限为0.8ng/mL)，准确度高(相关系数r为0.9998)，批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的AFP试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的AFP试剂盒相比至少缩短了30分钟，大大提高了检测效率。
本发明制备方法中采用吖啶酯类化合物标记抗体，吖啶酯类化合物通过化学反应使吖啶酯通过共价键与被标记的蛋白、多肽或核酸的氨基结合。通常标记物无本底发光，可用于检测低浓度或微量浓度的样品，且其发光效率高，使结合物具有化学发光活性强、免疫反应特异性高的特点。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括包被有AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物、浓缩洗涤液和底物液。
其中包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度为1:2000，AFP示踪物为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体，AFP示踪物工作液的浓度为1:1000；AFP校准品和质控品均为AFP标准品与校准品溶液配制而成，AFP校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；所述AFP质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
校准品溶液为pH7.2PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有8酪蛋白、20gNa2HPO4·12H2O、2g Na2H2PO4·2H2O、5mL的小牛血清和0.3mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液为0.04mol、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02％v/v的吐温-20和0.02g的NaN3；
标本稀释液为含有小牛血清和Proclin-300、pH为7.0、浓度为0.01M的磷酸盐缓冲溶液，其中小牛血清含量为200ml，Proclin-300含量为1mL。
底物液A为0.01/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.01mol/L的双氧水和0.2mol/L的硝酸；底物液B为0.01mol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.1g/L氢氧化钠。
其制备方法包括以下步骤：
(1)配制AFP磁性微球混悬液
将粒径为1.5μm的磁微粒用碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5-5.3的0.01mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为20mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入AFP抗体50μg,在25℃下搅拌2h，加磁场，静置2min，吸出上清液；
用pH值为7.0、含0.1％v/v的吐温-20、1.0％m/v的牛血清白蛋白和0.01％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:2000稀释，制得AFP磁性微球混悬液；
(2)制备AFP校准品及质控品
用校准品稀释液(pH7.2PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有8酪蛋白、20gNa2HPO4·12H2O、2g Na2H2PO4·2H2O、5mL的小牛血清和0.3mL的Proclin-300)将AFP标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，并以0.5mL/支对校准品和质控品进行分装、冻干；
(3)抗体的标记
a.预处理：取0.15mgAFP抗体，用0.05M、pH 7.5的碳酸盐缓冲溶液于2℃透析10小时，得到AFP抗体溶液；
b.抗体标记：按照摩尔比10:1的比例取吖啶酯溶液和AFP抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液(为0.1M、pH为7的CB缓冲液)体积20％的1g/mL赖氨酸盐溶液反应20分钟，得到反应液；
c.纯化与收集：取反应液，在0.05M、pH 7.5的碳酸盐缓冲溶液中于2℃透析20小时，得到吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液；
(4)配制AFP示踪物工作液
将吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8g牛血清白蛋白、5g氯化钾、0.1g的酪蛋白、0.02％v/v的Proclin-300和0.3％v/v的AES)按照1:1000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7gNacl、0.2ml的吐温-20和2g NaN3进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01mol/L、pH 6.8磷酸盐缓冲液配制双氧水浓度为0.01mol/L和硝酸摩尔浓度为0.2mol/L的溶液；
底物液B：用0.01mol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度0.1g/L的氢氧化钠溶液。
实施例2
一种甲胎蛋白检测试剂盒，包括包被有AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。
其中包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:4500的比例配制；AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4200的比例配制而成；AFP校准品和AFP质控品均由AFP标准品与校准品稀释液配制而成，AFP校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；AFP质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:4500的比例配制，AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4000的比例配制而成。
校准品稀释液为pH7.2的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有14g酪蛋白、25gNa2HPO4·12H2O、3g Na2H2PO4·2H2O、10mL的小牛血清和0.4mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液为0.05mol、pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04％v/v的吐温-20和0.04g的NaN3；
标本稀释液为含有小牛血清和Proclin-300、pH为7.3的0.013M的磷酸盐缓冲溶液，其中所述小牛血清含量为200ml，Proclin-300含量为1.3mL。
底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.015mol/L、pH7.3的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.015mol/L的双氧水和0.4mol/L的硝酸；底物液B为0.05mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.3g/L氢氧化钠。
其制备方法包括以下步骤：
(1)配制AFP磁性微球混悬液
将粒径为2.5μm的磁微粒用N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5.3-5.5的0.015mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为40mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入AFP抗体100μg,在25℃下搅拌3h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液；
用pH值为7.4、含0.12％v/v的吐温-20、1.2％m/v的牛血清白蛋白和0.015％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:4500稀释，制得AFP磁性微球混悬液；
(2)制备AFP校准品及质控品
用校准品稀释液(校准品稀释液为pH7.2的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有14g酪蛋白、25gNa2HPO4·12H2O、3g Na2H2PO4·2H2O、10mL的小牛血清和0.4mL的Proclin-300)将AFP标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，并以0.5mL/支对校准品和质控品进行分装、冻干；
(3)抗体的标记
a.预处理：取0.3mgAFP抗体，用0.01M、pH 7.8的碳酸盐缓冲溶液于4℃透析16小时，得到AFP抗体溶液；
b.抗体标记：按照摩尔比10:1的比例取吖啶酯溶液和AFP抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液(为0.1M、pH为7.5的CB缓冲液)体积30％的1g/mL赖氨酸盐溶液反应40分钟，得到反应液；
c.纯化与收集：取反应液，在0.01M、pH 7.8的碳酸盐缓冲溶液中于5℃透析24小时，得到吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液；
(4)配制AFP示踪物工作液
将吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有10g牛血清白蛋白、5g氯化钾、0.5g的酪蛋白、0.03％v/v的Proclin-300和0.6％v/v的AES)按照1:4000的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
配制1L pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，然后再称量9g NaCl、量取0.5mL吐温-20、2gNaN3加入Tris-HCl缓冲液中，即得浓缩洗涤液；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：使用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液作为基础缓冲液，其中含有浓度为0.1mol/的双氧水和浓度为0.3mol/L的硝酸；
底物液B：使用0.1mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液作为基础缓冲液，其中含有浓度为3％(v/v)氢氧化钠溶液；
(6)标本稀释液
按照每1L pH7.4的PB缓冲液中还含有15-30mL的小牛血清和0.7-0.8％v/v的Proclin-300进行配制；
(7)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、示踪物工作液、校准品、质控品、浓缩洗涤液、底物液A和底物液B的分装。
实施例3
一种甲胎蛋白检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被有AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液。其中包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:6000的比例配制；AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4500的比例配制而成；AFP校准品和所述AFP质控品均由AFP标准品与校准品稀释液配制而成，AFP校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；AFP质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
校准品稀释液为pH7.5的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18g酪蛋白、20-35gNa2HPO4·12H2O、4g Na2H2PO4·2H2O、15mL的小牛血清和0.5mL的Proclin-300。浓缩洗涤液为0.06mol、pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.08％v/v的吐温-20和0.06g的NaN3；
标本稀释液为含有小牛血清和Proclin-300、pH为7.5的0.15M的磷酸盐缓冲溶液，其中小牛血清含量为205ml，Proclin-300含量为1.5mL。
底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.2mol/L、pH7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.2mol/L的双氧水和0.7mol/L的硝酸；底物液B为0.1mol/L、pH7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.6g/L氢氧化钠。
其制备方法包括以下步骤：
(1)配制AFP磁性微球混悬液
将粒径为3μm的磁微粒用碳二亚胺进行活化，室温下搅拌30min，加磁场，静置1-3min,吸出上清液，用pH值为5.5-6的0.02mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗三次，并用该溶液按照浓度为60mg/mL将磁微粒进行悬浮；
每毫升吗啉乙磺酸溶液中加入AFP抗体150μg,在25℃下搅拌5h，加磁场，静置2-6min，吸出上清液；
用pH值为7.5、含0.15％v/v的吐温-20、1.5％m/v的牛血清白蛋白和0.02％v/vProclin-300的磷酸盐缓冲液清洗3-5次，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球初溶液，并用该溶液将所述磁性微球初溶液按1:6000稀释，制得AFP磁性微球混悬液；
(2)制备AFP校准品及质控品
用校准品稀释液(为pH7.5的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18g酪蛋白、35gNa2HPO4·12H2O、4g Na2H2PO4·2H2O、15mL的小牛血清和0.5mL的Proclin-300)将AFP标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，并以0.5mL/支对校准品和质控品进行分装、冻干；
(3)抗体的标记
a.预处理：取0.5mgAFP抗体，用0.2M、pH 9.0的碳酸盐缓冲溶液于10℃透析20小时，得到AFP抗体溶液；
b.抗体标记：按照摩尔比10:1的比例取吖啶酯溶液和AFP抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液(0.15M、pH为8.5的CB缓冲液)体积50％的1g/mL赖氨酸盐溶液反应60分钟，得到反应液；
c.纯化与收集：取反应液，在0.2M、pH 9.0的碳酸盐缓冲溶液中于8℃透析26小时，得到吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液；
(4)配制AFP示踪物工作液
将吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液与示踪物稀释液(pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有11g牛血清白蛋白、6g氯化钾、1g的酪蛋白、0.04％v/v的Proclin-300和1.0％v/v的AES)按照1:4500的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有10gNacl、0.8ml的吐温-20和2-6g NaN3进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.2mol/L、pH 7.8磷酸盐缓冲液配制双氧水浓度为0.2mol/L和硝酸摩尔浓度为0.7mol/L的溶液；
底物液B：用0.1mol/L、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度0.6g/L的氢氧化钠溶液。
实施例4
一种检测甲胎蛋白的试剂盒检测甲胎蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
(2)用纯化水将浓缩洗涤液进行40倍稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
(3)用蒸馏水溶解校准品、质控品，静置15分钟后混匀使用；
(4)将AFP校准品、质控品及待测样本置于相应板架上，设定相关测定参数为：磁性微球的加量为50μL，样本、校准品、质控品的加液量为50μL，示踪物工作液的加液量为50μL，设定温育时间为25分钟，循环清洗次数为三次，每次应用洗涤液用量为400μL，底物液A设定的加液量为50μL，振荡混匀时间为20秒，底物液B设定的加液量为50μL，立即检测，信号收集时间为0.1-4秒；
(5)根据各标准溶液发光值，借助全自动化学发光免疫分析仪的分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线计算出样本中AFP的浓度。
实施例5
一种甲胎蛋白检测试剂盒(实施例2)的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)
10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。经验证，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。
表1 试剂盒最低检测限的测定
结论：测定的AFP样本稀释液的平均发光值M＝4025.10，SD＝238.63，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.8ng/mL(<1ng/mL)，符合要求。
(2)试剂盒的剂量-反应曲线的线性
复孔测定试剂盒的校准品(浓度依次为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL和1000ng/mL的校准品进行两孔测定)，用四参数进行拟合，本试剂盒的剂量-反应曲线的线性检测结果见表2。
表2 试剂盒剂量-反应曲线的线性
结论：测定的AFP剂量-反应曲线线性相关系数(r)为：0.9998(>0.9900)，符合要求。
(3)试剂盒的准确度
检测浓度为20ng/mL和400ng/mL的校准品，每个浓度校准品检测3次，计算测定结果的均值M，本试剂盒的准确度检测结果见表3。
表3 试剂盒的准确度
编号 20ng/mL 400ng/mL
1 19.66 372.15
2 21.32 410.12
3 20.07 428.89
平均值 20.35 403.72
Bias％ 1.75％ 0.93％
结论：测定的20ng/mL和400ng/mL准确度校准品的相对偏差(Bias％)分别为：1.75％和0.93％，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)均<15.0％，符合要求。
(4)试剂盒的精密度
a、分析内精密度：浓度分别为20ng/mL和400ng/mL的校准品重复检测，本试剂盒的分析内精密度检测结果见表4。
表4 试剂盒分析内精密度的测定
编号 20ng/mL 400ng/mL
1 21.82 420.18
2 20.07 388.28
3 19.72 389.78
4 18.59 438.63
5 21.66 380.58
6 20.89 393.75
7 21.43 385
8 20.95 416.95
9 21.13 423.33
10 19.87 412.2
CV 4.96％ 4.89％
结论：测定的20ng/mL和400ng/mL精密度校准品的分析内变异系数(CV)分别为：4.96％和4.89％(均<8.0％)，符合要求。
b、批间精密度：用3个批号的试剂盒分别检测浓度为20ng/mL和400ng/mL的校准品，各重复10次，本试剂盒的分析间精密度检测结果见表5。
表5 试剂盒批间精密度的测定
结论：测定的20ng/mL和400ng/mL精密度校准品的批间变异系数(CV)分别为：4.45％和2.76％(均<20.0％)，符合要求。
从上述测定的数据可以看出，本发明设计的一种甲胎蛋白检测试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等各项质量参数均处于领先地位。
实施例6
一种甲胎蛋白检测试剂盒的临床检测实例如下：
采用本发明试剂盒对240例检测样本进行检测，其中阳性样本约80例，阴性样本约160例(体检后经证实无糖尿病、银屑病、迟发性过敏反应及无缺血性心肌病等疾病、3个月内无皮肤伤口及骨折的人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)，检测结果见表6。
表6 AFP考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,239，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
AFP考核试剂与对比试剂阳性符合率为96.25％，阴性符合率为99.375％，总符合率为98.33％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被AFP抗体的磁性微球混悬液、AFP校准品、AFP质控品、AFP示踪物工作液、浓缩洗涤液、底物液和标本稀释液；
所述包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2000-1:6000的比例配制；
所述AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:1000-1:4500的比例配制而成。
2.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述AFP校准品和所述AFP质控品均由AFP标准品与校准品稀释液配制而成，所述AFP校准品的浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL；
所述AFP质控品的浓度为20ng/mL、400ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述包被AFP抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:4500的比例配制，所述AFP示踪物工作液为吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液按照其与示踪物稀释液1:4000的比例配制而成。
4.根据权利要求2所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述校准品稀释液为pH7.2-7.5的PB缓冲液，且每1L缓冲液中还含有8-18g酪蛋白、20-35gNa2HPO4·12H2O、2-4gNa2H2PO4·2H2O、5-15mL的小牛血清和0.3-0.5mL的Proclin-300。
5.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.02-0.08％v/v的吐温-20和0.02-0.06g的NaN3；
所述标本稀释液为含有小牛血清和Proclin-300、pH为7.0-7.5的0.01-0.15M的磷酸盐缓冲溶液，其中所述小牛血清含量为200-205ml，Proclin-300含量为1-1.5mL。
6.根据权利要求1所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述底物液包括底物液A和底物液B,所述底物液A为0.01-0.2mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.01-0.2mol/L的双氧水和0.2-0.7mol/L的硝酸；
所述底物液B为0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液，且该缓冲溶液中含有0.1-0.6g/L氢氧化钠。
7.一种如权利要求1所述甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：
(1)制备AFP磁性微球混悬液
将活化后的磁微粒加磁场，用0.1-0.2M、pH5-6的吗啉乙磺酸缓冲液清洗后，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮；加入AFP抗体，再加磁场，用含有吐温-20、PEG2000、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:2000-1:6000稀释，制得AFP磁性微球混悬液；
(2)制备AFP校准品及质控品
用校准品稀释液将AFP标准品按一定的比例稀释成系列校准品，其校准品浓度范围为0ng/mL-1000ng/mL；按照上述操作制备浓度为20ng/mL、400ng/mL的质控品，并以0.5mL/支对校准品和质控品进行分装、冻干；
(3)抗体的标记
a.预处理：取0.1-0.5mgAFP抗体，用0.05-0.2M、pH 7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液于2-10℃透析10-20小时，得到AFP抗体溶液；
b.抗体标记：按照摩尔比10:1的比例取吖啶酯溶液和AFP抗体溶液，加入标记缓冲液，再加入标记缓冲液体积20-50％的1g/mL赖氨酸盐溶液反应20-60分钟，得到反应液；
c.纯化与收集：取反应液，在0.05-0.2M、pH 7.5-9.0的碳酸盐缓冲溶液中于2-8℃透析20-26小时，得到吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液；
(4)配制AFP示踪物工作液
将吖啶酯标记的AFP单克隆抗体溶液与示踪物稀释液按照1:1000-1:4500的比例配制；
(5)配制浓缩洗涤液
按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNacl、0.2-0.8ml的吐温-20和2-6g NaN3进行配制；
(6)配制底物液A和底物液B
底物液A：用0.01-0.2mol/L、pH 6.8-7.8磷酸盐缓冲液配制双氧水浓度为0.01-0.2mol/L和硝酸摩尔浓度为0.2-0.7mol/L的溶液；
底物液B：用0.01-0.1mol/L、pH 6.8-7.8的磷酸盐缓冲溶液配制含有浓度0.1-0.6g/L的氢氧化钠溶液；
(7)配制标本稀释液
按照每1L pH7.4-7.6的PB缓冲液中还含有200-205mL的小牛血清和1-1.5ml的Proclin-300进行配制。
8.根据权利要求7所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述磁微粒为粒径1-3μm，且表面包裹有羧基、氨基、磺酰基任意一种活性基团的磁性微球。
9.根据权利要求7所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中示踪物稀释液为pH7.5-7.8的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g牛血清白蛋白、5-6g氯化钾、0.1-1g的酪蛋白、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0％v/v的AES。
10.根据权利要求7所述的一种甲胎蛋白检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中标记缓冲液为0.1-0.15M、pH为7-9的CB缓冲液。
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