CN106496328A - 透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，属于生化手段测试技术领域。以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用Protein A亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti‑HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。将发明应用于透明质酸结合蛋白多克隆抗体的指标，具有稳定性好、纯度高等优点。

Description

透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，属于生化手段测试技术领域。

背景技术

透明质酸（Hyaluronic Acid），是一种由N-乙酰氨基葡萄糖β-D-葡糖糖醛酸交替聚合而成的高分子粘多糖，是结缔组织基质中的主要成分，HA由间质细胞合成，由淋巴进入血液循环，肝脏内皮细胞是摄取和降解HA的主要部位。近年研究发现肝脏细胞外基质与肝纤维化密切相关，ECM在肝脏内合成与降解之动态平衡一旦失调则可形成肝纤维化，甚则导致肝硬化。在ECM中，HA的作用日益受到重视，它的含量也是身体健康的一个标准，例如当肝损伤越严重时，它的含量升高等等。实验研究发现，慢迁肝、慢活肝、肝硬化患者血清HA含量逐步升高，HA不仅能反映肝纤维化，也能反映肝功能的损伤程度。

除了在肝脏发生纤维化的时候HA含量会发生变化外，肾脏纤维化的检测同样适用，实验表明慢性肾功能衰竭早期和中期的血清透明质酸值与肾脏纤维化病变正相关，在排除其余器官病变的情况下，HA可以作为肾组织纤维化的早、中期实验室指标。所以，结合运用较为普遍且廉价的血清学指标，作为早期评估肾纤维化发生、发展的临床无创性的诊断指标和疗效评价，有一定的临床诊断意义及较高的临床应用价值。

对体内物质含量的检测，可以通过该物质相应的抗体含量的检测来相应的表征体内该物质含量变化。因此，在免疫分析方法的建立过程中，抗体的制备是关键步骤、一般认为，分子量越大、结构越复杂的物质免疫原性越强。然而，目前人们所关注的很多物质，都属于小分子化合物，其分子量一般小于能直接用于免疫动物抗原分子的分子量下限（5000Da）。这些小分子化合物需要通过与某些载体蛋白分子结合 （称为全抗原）才能具有免疫原性，以诱导动物产生针对该小分子化合物的抗体。透明质酸免疫原性极弱，不能直接获得抗体，HABP（透明质酸结合蛋白）是近年来发现能与HA特异性结合的抗体，且极少与其他物质结合，且HA与HABP结合表现出功能的多样性可以用来作为HA的特异性抗体。所以，免疫分析检测时，利用HABP结合血清中的HA分子，使其形成复合物全抗原，通过全抗原的含量测定来表征体内HA含量的变化，以监测机体病理状况。

抗体是机体受到抗原刺激免疫细胞产生分泌的免疫物质。它主要是由效应B细胞（浆细胞）分泌的物质，当机体或者有外来的物质如病毒或者细菌等进入后，是免疫系统用来识别与鉴定的物质。实验发现，它存在于脊椎动物的血液，淋巴液等一些体液以及B细胞的细胞膜表面。抗体能够鉴定并识别出非自身机体产生的外来物的独特特征的能力，这种能被抗体识别出的外来的物质称为抗原物质。

近年来，用于疾病研究、诊断的抗体主要来源于哺乳动物的单克隆抗体和多克隆抗体。多克隆抗体是研究和应用最早的抗体，其制备方法简便而且经济。因为相对于单克隆抗体而言，多克隆在其制备和纯化上相对比较简单，而且可以在经过对机体的第一次免疫之后可以连续的得到相对较多的抗体的量。因此，在关于诊断疾病的方面，抗体得到了广泛的应用。而多克隆抗体制备方法简便，但所制备的抗体容易受到温度、pH等因素的影响，稳定性不佳。

基于此，做出本申请。

发明内容

针对现有抗体制备中所存在的上述缺陷，本申请提供一种纯度高、稳定性好的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用Protein A亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti-HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。

进一步的，作为优选：

所述的HABP作为抗原注射前，采用超声乳化法将其包被入佐剂中形成乳化物进行注射。具体乳化方法为：移取人源透明质酸结合蛋白HABP与佐剂并将混合物立即置于0 ℃冰浴，用超声波对其进行超声乳化，每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环，超声乳化完成后停止超声，乳化物仍置于冰浴中。

所述的抗血清制备时采用多次免疫法，更优选的，所述的抗血清制备采用四次免疫，第一次免疫时采用人源透明质酸结合蛋白HABP与完全佐剂形成的乳化物，第二次免疫采用人源透明质酸结合蛋白HABP与不完全佐剂形成的乳化物。

所述的抗分离抽取方式为：抽取全血，将其在4 ℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟后，去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。

所述的一级层析中，先填装抗体蛋白亲和柱，再加入煮好的琼脂糖，并加入proteon A 作为填料，移取血清，并将其稀释，加入亲和柱内，按1:1的比例加入结合/洗涤缓冲液反复清洗亲和层析柱内充填的物料，过滤出水相，当滤水相中蛋白质核酸测定波长趋近于0时，亲和层析柱内剩下的即为与填料Protein A 相结合的IgG，用洗脱液elutionbuffer 洗脱玻璃亲和柱内的混合物，即可得到亲和纯化后的IgG。

所述的二级层析中，向以CNBr预活化的琼脂糖为填料上加入透明质酸结合蛋白，使透明质酸结合蛋白与层析柱中的基质共价交联结合，形成层析柱，加入亲和纯化后的IgG，使IgG中的透明质酸结合蛋白多克隆抗体与琼脂糖填料中的透明质酸结合蛋白特异性结合，用洗涤缓冲液洗涤，去除交联聚合物中HABP的部分，分离出与蛋白特异性结合的抗体。

附图说明

图1为本申请中ELISA抗体检测（I加了TSG，II加了rHABP，CK为对照组，加了没有对兔子进行免疫时的血清）；

图2为本申请中纯化后ELISA抗体检测（I加了TSG，II加了rHABP ，CK为未注射抗原前的兔血清检测结果，作为对照组）

图3为HABP纯度检测电泳图；

图4为二次免疫血清电泳图；

图5为亲和层析电泳图；

图6为免疫亲和层析电泳图。

具体实施方式

以下以新西兰兔作为处理对象进行技术方案的说明。

1试验材料

1.1实验动物

实验用新西兰兔购自浙江省医学科学院，每天用专用饲料饲育兔子，早晚各一次，提供充足的饮用水。

人源透明质酸结合蛋白

实验用透明质酸结合蛋白（HABP1）由实验室前期克隆调控人源HABP1基因，并将基因转入大肠杆菌表达得到重组表达的HABP1。将蛋白在-80 ℃条件下加20%甘油保存。

主要试剂及配制

1.3.1 SDS-PAGE实验用试剂

分离胶缓冲液：在70 mL蒸馏水中加入三羟甲基氨基甲烷18.15 g，用盐酸调节pH，当在8.8时停止滴加，加蒸馏水定容摇匀至100 mL。

10%过硫酸铵溶液：取过硫酸铵10.00 g 加纯化水定容摇匀至100 mL

30%丙烯酰胺溶液：称取亚甲基双丙烯酰胺0.80 g和丙烯酰胺30.00 g加纯化水定容摇匀至100 mL，并且避光条件下保存。

浓缩胶缓冲液：在70 mL蒸馏水中加入三羟甲基氨基甲烷6.00 g，用盐酸调节pH，当在6.8时停止滴加，加蒸馏水定容摇匀至100 mL。

电泳缓冲液：天平称得甘氨酸144.00 g，三羟甲基氨基甲烷30.00 g和十二烷基硫酸钠10.00 g，将三者加入到蒸馏水中溶解，定容摇匀到1000 mL。需要使用时稀释10倍。

供试品缓冲液：天平称取十二烷基硫酸钠0.80 g，溴酚蓝2 mg和三羟甲基氨基甲烷 0.303 g，甘油4 mL，盐酸0.189 mL加蒸馏水溶解稀释定容摇匀到10 mL。

染色液：在200 mL蒸馏水中溶解2.50 g的考马斯亮蓝R250后加入冰醋酸100 mL和95%乙醇500 mL，加蒸馏水至1000 mL。

脱色液：量取冰醋酸75 mL和95%的乙醇55 mL混合加入蒸馏水定容摇匀到1000mL。

实验用试剂

包被缓冲液：天平称取碳酸氢钠2.93 g和碳酸钠1.59 g，溶解至1L水中。

洗涤缓冲液（PBST）：量取0.5 mL的0.05%吐温20，将其加入到PBS缓冲液中，定容摇匀至1000 mL。

PBS缓冲液：称取磷酸二氢钾固体0.27 g，十二水合磷酸氢二钾3.58 g，氯化钾0.2g和氯化钠8 g，溶解至1L水中。

封闭缓冲液：称取2%牛血清白蛋白2 g，加洗涤缓冲液溶解，定容摇匀至100 mL。

稀释液：称取0.1%牛血清白蛋白0.1 g，加PBS缓冲液溶解，定容摇匀至100 mL。

底物缓冲液：量取0.2 M磷酸氢二钠25.7 mL，0.1 M柠檬酸24.3 mL加入蒸馏水，定容摇匀至100 mL。

四甲基联苯胺（TMB）显色液：量取TMB（2 mg/mL水）0.05 mL，底物缓冲液0.95 ml，30%双氧水0.001 mL，将三者均匀混合，总体积为1 mL。

终止液（2 M硫酸）：将21.7 mL浓硫酸（18 M 约98%）逐滴加入到178.3 mL蒸馏水中，边加入边振荡，充分混合。

佐剂

Freund’s Adjuvant，complete和Freund’s Adjuvant，Incomplete购自Sigma公司。

2 试验方法

2.1本底血清留样，血清分离及储存

将兔子固定，用剪刀清理去掉兔子耳朵边缘的细毛，直至露出较明显的比较大的静脉，取血前用消毒酒精对取血部位进行消毒，小心从每只兔耳朵上的静脉用注射器抽取5毫升左右的全血。将上述全血分别用移液枪移取100微升分别装入250微升的离心管，再将离心管放入离心机，同时每根离心管的对面放置同样一根质量的水样离心管。盖上离心机的盖子，启动离心机，在4 ℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟。离心后去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。

检法测蛋白质纯度

2.2.1样品制备

用纯化水把供试品稀释至1 mg/ mL，移液枪移取20微升置于0.5 mL离心管中，并且加入同体积的2倍上样缓冲液进行振荡摇匀；沸水浴5分钟。

电泳槽安装

装配Bio-rad min 垂直电泳槽。

制备分离胶溶液

制备12%分离胶溶液，先加10 mL凝胶，4 mL30%丙烯酰胺，2.5 mL分离胶缓冲液，3.5 mL蒸馏水，0.05 mL的10%过硫酸铵，0.01 mL的TEMED，当加入TEMED后，振荡溶液并将混合液加入到玻板间隙，当到达一定高度后在上面加水封闭，等待分离胶聚合。

制备浓缩胶溶液

制备5%浓缩胶溶液时，先加5 mL凝胶。0.83 mL30%丙烯酰胺，1.25 mL浓缩胶缓冲液，2.83 mL蒸馏水，0.06 mL10%过硫酸铵，和0.006 mL的TEMED，等分离胶溶液聚合之后，去上层水溶液，加入浓缩胶溶液，插入梳子。

上样

浓缩胶聚合后，在电泳装置上固定凝胶后，拔出梳子，用电泳缓冲液将电泳槽内装满，加样孔加入蛋白Marker和样品各10 微升。

电泳

正确连接电极，接通电源，恒流电压下电泳，当看到溴酚蓝移到底部时，电泳停止。

染色

关闭电源后，取下玻板小心撬开，将凝胶放在装有染色液的塑料槽中浸没，摇床上染色至少30分钟。

脱色

倒去染色液，将凝胶放在脱色液中，放摇床上脱色，当蓝色基本看不见时停止脱色。

第一次免疫

2.3.1人源透明质酸结合蛋白与弗氏完全佐剂的混合

用移液枪移取500 μL人源透明质酸结合蛋白与500 μL的弗氏完全佐剂置于5 mL的试剂管中，同时立即将试管置于0 ℃冰浴中。冰浴槽移入超声细胞破碎机，用超声波对冰浴中的混合物进行超声乳化。超声细胞粉碎机设置成每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环。超声乳化完成后将冰浴槽取出，试管与乳化物仍置于冰浴中，检验混合是否均匀：在冰水混合物中加入混合物，并且在一分钟内没有出现扩散现象。

人源透明质酸结合蛋白与弗氏完全佐剂乳化物的注射

将实验兔取出小心固定，避免兔子挣扎，脊背朝上，选取脊柱两侧各四个注射点，给每一只兔子注射500微升制备的乳化物，8个点平均注射。

抗体的产生，全血样抽取、分离及储存

将经过透明质酸结合蛋白注射的兔子返回兔笼，在与之前同样条件下饲育两周，机体产生免疫功能从而产生抗体。之后将兔子固定，用剪刀清理去掉兔子耳朵边缘的细毛，直至露出较明显的比较大的静脉，取血前用消毒酒精对取血部位进行消毒，小心从每只兔耳朵上的静脉用注射器抽取5毫升左右的全血。将上述全血分别用移液枪移取100微升分别装入250微升的离心管，再将离心管放入离心机，同时每根离心管的对面放置同样一根质量的水样离心管。盖上离心机的盖子，启动离心机，在4 ℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟。离心后去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。

第二次免疫

2.4.1人源透明质酸结合蛋白与弗氏不完全佐剂的混合

用移液枪移取500 微升人源透明质酸结合蛋白与500 微升的弗氏不完全佐剂置于5mL的试剂管中，同时立即将试管置于0 ℃冰浴中。冰浴槽移入超声粉碎机，用超声波对冰浴中的混合物进行超声乳化。超声细胞粉碎机设置成每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环。超声乳化完成后将冰浴槽取出，试管与乳化物仍置于冰浴中待用。

人源透明质酸结合蛋白与弗氏不完全佐剂乳化物的注射

将实验兔取出小心固定，避免兔子挣扎，脊背朝上，选取脊柱两侧各四个注射点，给每一只兔子注射500微升制备的乳化物，8个点平均注射。

抗体的产生，全血样抽取、分离及储存

将经过透明质酸结合蛋白注射的兔子返回兔笼，在与之前同样条件下饲育10天，机体产生免疫功能从而产生抗体。之后将兔子固定，用剪刀清理去掉兔子耳朵边缘的细毛，直至露出较明显的比较大的静脉，取血前用消毒酒精对取血部位进行消毒，小心从每只兔耳朵上的静脉用注射器抽取5毫升左右的全血。将上述全血分别用移液枪移取100微升分别装入250微升的离心管，再将离心管放入离心机，同时每根离心管的对面放置同样一根质量的水样离心管。盖上离心机的盖子，启动离心机，在4 ℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟。离心后去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。

法对多克隆抗体的检验

2.5.1包被

将抗原（HABP）用包被液稀释至1-10 μg/mL左右，移取稀释液，在每反应孔中各加0.1mL，在4 ℃的条件下保存一夜。第二天，去除反应孔内溶液，洗涤缓冲液边振荡边冲洗。

封闭

在上述已包被反应孔中各加入0.3 mL封闭液，在37℃的情况下保存2小时，然后用缓冲液洗涤。

加样

各反应孔加入样品各0.1 mL，在37℃情况下1个小时后缓冲液洗涤。

加一抗

在每个反应孔加入0.1 mL新稀释的血清溶液，放在37℃条件下1小时，然后加缓冲液洗涤。

加酶标二抗

在每个反应孔加入0.1 mL新稀释的酶标抗体溶液，在37℃条件下保存1小时，然后用缓冲液洗涤5次。

加底物液显色

每反应孔加0.1 mL TMB液，在黑暗37℃条件下放置10分钟充分变色。

终止反应

反应孔加2M硫酸各0.05 mL。

结果判定

将96孔板放在白的背景上，观察反应孔颜色变化，具体见图1所示。

第三次免疫，第四次免疫及抗体检验

同第二次免疫与抗体检验。

法测定未知抗体效价

2.7.1包被

将抗体（一抗）用包被液稀释至蛋白质含量为1~10 μg/mL，每板反应孔中加稀释液0.1mL，温度4℃下保存至过夜。第二天将孔内溶液倾去用洗涤液振荡冲洗3次。

封闭

将0.3mL封闭液加入上述已经包被的反应孔在37℃条件下培育2小时后洗涤。

加样

在反应孔中加入0.1mL抗原在37℃环境下培育1.5小时。然后洗涤。

加一抗

将新稀释的抗体各取0.1mL加入各反应孔中在37℃环境下培育1.5小时。然后洗涤。

加酶标二抗

将新稀释的酶标抗体各取0.1mL加入各反应孔中37℃环境下培育1小时后洗涤5次。

加底物液显色

分别取0.1mL刚配制的TMB显色液加入各反应孔中37℃黑暗条件下培育15分钟使其变色充分。

终止反应

各反应孔中加入两2M硫酸0.05mL。

结果判定

白色背景上观察96孔板内有无颜色变化，具体参见图2。

透明质酸结合蛋白多克隆抗体的纯化

2.8.1亲和纯化IgG

填装抗体蛋白亲和柱^[9]，在底部呈锥形的玻璃柱内加入约2g煮好的琼脂糖，加入100 μL上海生工生产的proteon A 作为填料，移液管移取20μL制备所得的含有IgG的血清，并将其稀释100倍，加入亲和柱内。按1:1的比例加入结合/洗涤缓冲液。

用2mL wash buffer 洗涤液反复清洗亲和层析柱内充填的物料，并通过玻璃亲和柱的锥形底部过滤出水相，并用Bio-Rad蛋白质核酸测定仪测定滤出的水相中蛋白质含量（测试波长为280nm），直至水相中蛋白质核酸测定波长趋近于0。此时，玻璃亲和层析柱内剩下的即为与填料Protein A 相结合的IgG，用洗脱液elution buffer 洗脱玻璃亲和柱内的混合物，即可得到IgG。

免疫亲和纯化获得透明质酸结合蛋白多克隆抗体

亲和纯化后获得的IgG中，含65~75%的血清中抗体成分，其中包括了实验需要制备的透明质酸结合蛋白多克隆抗体，因此，用免疫亲和纯化来获取所需的透明质酸结合蛋白多克隆抗体。

在以CNBr预活化的琼脂糖为填料的试剂管中，加入透明质酸结合蛋白，使透明质酸结合蛋白与层析柱中的基质共价交联结合，形成层析柱。加入亲和纯化后的IgG，使IgG中的透明质酸结合蛋白多克隆抗体与琼脂糖填料中的透明质酸结合蛋白特异性结合。用2mLwash buffer 洗涤缓冲液洗涤，去除交联聚合物中HABP的部分，分离出与蛋白特异性结合的抗体。

聚丙烯酰氨凝胶电泳法对抗体纯度的测定

2.9.1 制备SDS聚丙烯酰胺凝胶

制备12%分离胶10mL：将1000μL30%的丙烯酰胺、2600μL分离胶缓冲液、100μL 10% SDS、100μL 10%过硫酸铵、3200μL蒸馏水混匀后加入4μLTEMED再次快速混匀，以匀速贴壁的方式缓慢灌装入垂直板中至离槽边缘3cm处移液管移取蒸馏水2mL并立即加在胶上待凝胶聚合后去除水相并用滤纸吸去残留的水分。

制备5%浓缩胶6 mL：将1000μL 30%丙烯酰胺、20μL浓缩胶缓冲液、60μL 10%SDS、60μL 10%过硫酸铵、3400μL蒸馏水混匀立即加入6μL TEMED灌入垂直板至离槽边缘0.5cm处插入梳子凝胶聚合后加入电泳缓冲液并移去梳子。

将琼脂糖剥离取出玻璃板用夹子固定在电泳槽内倒入电泳缓冲液。

样品预处理

0.5mL样品加入0.5mL上样缓冲液置沸水中5min。

上样

第一个孔加入标准蛋白质溶液5μL，第二个第三个孔中分别用移液枪移取一次免疫和二次免疫时的样品各5μL。

电泳

70V 条件下电泳进入分离胶后改为100V 电泳至染色液距离胶底部1cm处停止。

固定

取下凝胶置于培养皿的固定液中轻摇约10分钟倒去固定液。

染色脱色

用55℃预热的染色液将凝胶浸没约半小时后回收染色液并用清水冲去多余染色液加脱色液一小时脱色一次。电泳自动成像仪拍照。

结果分析

3.1 人源透明质酸结合蛋白多克隆抗体纯度电泳检测

在对兔子进行免疫注射之前，首先要对HABP的纯度进行检测，检测结果如图3所示。图3中电泳之前先对HABP进行稀释处理，初始的HABP浓度约为1.25 mg/mL，稀释1000倍。图3中M为Mark，其分子大小如图左侧数据所示。

如图3所示，左侧组的上样量为30微升，右侧组的上样量为15微升，经过电泳后出现4条条带，4条条带都属于HABP，TSG的分子量大约为40KD，rHABP的分子量约为30KD，rHABP的颜色比TSG深，说明HABP中rHABP的量相对TSG的要多。左侧组与右侧组相比较颜色也比较深，是由于上样量不同造成。除此之外，实验结果中未显示其他条带，说明除HABP外不含有其他蛋白，所以此蛋白为纯HABP。

第二次免疫后血清电泳检测

将第二次免疫后得到的血清稀释10万倍后电泳得到如图4所示的结果。M条带为参照条带，左侧组的结果是同一只兔子没有免疫和注射500微升rHABP二次免疫后的电泳结果。右侧组的结果是另一只兔子没有免疫和注射1000微升rHABP二次免疫后的电泳结果。

从图4中可以看出，同一只兔子免疫前后相比较，免疫后相应条带要比免疫前深，免疫前条带接近于没有。对两只兔子比较，可以发现都有相应条带出现。所以可以看出蛋白中含有IgG，在25KD左右的是IgG的轻链（图4中B点之间），重链IgG则在50KD左右（图2中A点之间）。

透明质酸结合蛋白多克隆抗体纯度测定结果分析

图5为IgG亲和纯化后的结果，图5中左侧M部分为标准蛋白的电泳染色图谱，1和2处分别上样量为25μL和10μL的离心滤过后血清蛋白的电泳染色后的图谱，3~9处为IgG与亲和柱内填料的交联聚合物洗脱后的电泳图谱。

从图5中可以看出，在洗脱液洗脱三次后，锥形底玻璃柱内与填料交联的IgG被全部洗脱出来，至第9次时为完全的洗脱液。洗脱出的IgG分子质量大小约为150kD，其中单条重链约为50kD，单条轻链约为25kD。经比较，纯化出的透明质酸结合蛋白多克隆抗体相对分子质量与血清中IgG内总的蛋白质相对分子质量无明显差异，洗脱液洗脱后显色条与血清标准蛋白洗脱后的条带相一致，表明活性部分没有损失。

经Bio-rad核酸蛋白质检测仪，在波长为280nm处检测，三次洗脱出的IgG的浓度分别为1.4 mg/mL、0.9 mg/mL、0.3 mg/mL。

图6为IgG免疫亲和纯化后电泳染色图谱，M为标准蛋白质电泳染色图谱，1~3段分别为亲和纯化中elution buffer 洗脱液前三次洗脱之后，通过免疫亲和纯化获得的IgG中透明质酸结合蛋白多克隆抗体的电泳染色后图谱。

由该图谱可知，透明质酸结合蛋白多克隆抗体质量大小约为150 kD，其中单条重链为50kD，单条轻链为25kD，且显色条带和相对应的蛋白质相对分子质量与亲和纯化中的显色条带相一致，表明免疫亲和纯化过程中，纯化得到的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的活性部分没有损失，能覆盖IgG中大部分的透明质酸结合蛋白多克隆抗体。

法抗体检测结果

图1、图2分别为不同浓度梯度的抗体稀释后加显色剂后的颜色。结果表明：抗体稀释度越高，颜色越深，即抗原与抗体结合的越多。表明免疫后兔子血清中含有透明质酸结合蛋白抗体。

透明质酸是一种显酸性的多糖物质，它在生物体内的含量，是反应生物体健康状况的一个指标。在目前的临床医学和日常生活中有着广泛的应用。同样，通过透明质酸结合蛋白多克隆抗体能够很好的反应出生物体中透明质酸的含量。对于透明质酸的研究，在国内还是存在相当大的发展空间。

本次实施例主要是以兔子为载体来制备透明质酸结合蛋白多克隆抗体，并对其进行纯化处理。兔子拥有良好的免疫系统，所以当注射抗原之后，机体内可以产生相对应的抗体。为了确保实验的结果的有效性，注射前要做好消毒工作，以免注射过程中对兔子产生不必要的损伤和感染。本次实验首先对实验前后的血清检测结果进行对比，以更好的显示抗体的产生。本实验经历的时间相对较长，然而无论是抗原还是抗体都属于蛋白，容易遭到各种因素的破坏，所以对有些实验的条件也有许多相对严格的要求。

其中对于抗体稳定性影响最显著的一个因素是温度，本申请从一开始没有免疫兔子时取出的血清，要完好保存到几次免疫后进行检测时，并对各阶段的pH进行特殊限定，保证其中蛋白不发生变质，避免影响实验结果。同时，在透明质酸结合蛋白与佐剂的混合中，如果混合乳化时不能够充分的混匀，那么将会影响抗体能否很好的产生，直接造成抗体的有无，与此同时还对混匀时超声细胞粉碎机的正确条件进行控制，当机体产生免疫后对血清的处理也比较关键。

常规的乳化方法主要采用研磨法、注射器混合法，其中研磨法抗原损失较大，注射器混合法抗原损失少但容易致乳化不完全，而本申请采用的超声乳化法中，对超声法乳化的时间和频率进行特殊设置，避免因超声过度而引发自由基，对抗原和抗体产生未知的损害。

亲和纯化结果受诸多因素的影响，如抗体制备过程中，离心机离心力的大小决定了分离出血清量的多少，若分离不完全，则分离出的血清偏少，相应的血清中免疫球蛋白及所包含的抗体的量偏少，最终导致纯化结果偏低。所需纯化的抗体的初始浓度决定了最后纯化的结果，免疫亲和层析的效果一般为1000到10000倍，若所需纯化物质的量极低，则需与其他纯化方法相结合，因此本申请中采取了先亲和层析，再使用免疫亲和层析。洗脱液的流速也会影响免疫亲和层析分离效果,洗脱速度通常要保持恒定，若洗脱速度过快，则样品残留过多，分离不完全，纯化结果偏低，洗脱速度过慢，则分离时间过长，延长实验进度。同时还要控制适宜的洗脱液的浓度，若洗脱液浓度较大，则洗脱次数减少，但可能导致洗脱次数过少而致部分抗体残留，若洗脱液浓度过低，抗体较难以分离，相应的洗脱次数增多，增加了分离时间。

ELISA法检验后，各反应孔的颜色都有变深，说明机体有透明质酸结合蛋白多克隆抗体产生，经检测达八十万倍稀释度。

Claims (8)

1.透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以HABP作为抗原进行注射，制备HABP抗血清，对该抗血清进行分离并采用二级层析法对该抗血清进行纯化，二级层析法包括一级层析和二级层析，所述的一级层析采用Protein A亲和层析填料，将抗血清中IgG分离纯化；二级层析采用CNBr预活化的琼脂糖填料，将HABP挂柱后，从一级纯化分离的IgG中分离Anti-HABP，即得透明质酸结合蛋白多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的HABP作为抗原注射前，采用超声乳化法将其包被入佐剂中形成乳化物进行注射。

3.如权利要求2所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的乳化方法为：移取HABP与佐剂并将其立即置于0 ℃冰浴下进行超声乳化，每超声10秒钟后停止超声30秒，重复超声20个循环，超声乳化完成后停止超声，乳化物仍置于冰浴中。

4.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的抗血清制备时采用多次免疫法。

5.如权利要求1或4所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的抗血清制备采用四次免疫，第一次免疫时采用人源透明质酸结合蛋白HABP与完全佐剂形成的乳化物，第二次免疫采用人源透明质酸结合蛋白HABP与不完全佐剂形成的乳化物。

6.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的抗血清分离抽取方式为：抽取全血，将其在4 ℃的条件下以每分钟4000转的速度离心10分钟后，去掉上清液，将下层血清置于-20℃条件下保存。

7.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的一级层析中，先填装抗体蛋白亲和柱，再加入煮好的琼脂糖，并加入proteon A 作为填料，移取血清，并将其稀释，加入亲和柱内，按1:1的比例加入结合/洗涤缓冲液反复清洗亲和层析柱内充填的物料，过滤出水相，当滤水相中蛋白质核酸测定波长趋近于0时，亲和层析柱内剩下的即为与填料Protein A 相结合的IgG，用洗脱液elution buffer 洗脱玻璃亲和柱内的混合物，即可得到亲和纯化后的IgG。

8.如权利要求1所述的透明质酸结合蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的二级层析中，向以CNBr预活化的琼脂糖为填料上加入透明质酸结合蛋白，使透明质酸结合蛋白与层析柱中的基质共价交联结合，形成层析柱，加入亲和纯化后的IgG，使IgG中的透明质酸结合蛋白多克隆抗体与琼脂糖填料中的透明质酸结合蛋白特异性结合，用洗涤缓冲液洗涤，去除交联聚合物中HABP的部分，分离出与蛋白特异性结合的抗体。