CN108484773B - 一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途 - Google Patents

一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途，其中透明质酸纳米抗体是针对透明质酸表位的纳米抗体，包括具有SEQ ID 15或SEQ ID 16所示氨基酸序列的VHH链。本发明透明质酸纳米抗体具有非常高的亲和力，这种高亲和力特性赋予了该纳米抗体在检测透明质酸时的高灵敏度，使其具有更小的最低检测限与最低定量限，从而可以采用竞争法ELISA和夹心法ELISA的原理更优地应用于临床上血清中透明质酸的检测。

Description

一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途
技术领域
本发明涉及一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途，属于生物医学或生物制药技术领域。
背景技术
肝纤维化是目前全世界发病率与死亡率居高不下的主要原因之一。肝星形细胞的激活和异常增殖导致细胞外基质成分的大量分泌和累积，例如III型前胶原肽(PIIINP)、透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、VI型胶原(CVI)、粗纤维调节素(CXIV，Undulin)、层粘素(LN)、细胞粘合素C(Tenascin)等，是最终导致进展性肝纤维化的主要原因之一。几乎所有的肝脏疾病，特别是乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、自身免疫性或遗传性肝病等常见高发肝脏疾病，都会逐渐发展为进展性肝纤维化，最终发展为肝硬化。
肝纤维化是由慢性肝损伤导致的细胞外基质的大量分泌和累积而引发的，这种累积是可逆性的，临床上一般观察不到致死性结节形成；而肝硬化则是细胞外基质大量分泌和累积到一定程度后，围绕肝实质细胞形成大量坏死性结节，其病理过程不可逆。因此，对任何肝脏疾病的预防和治疗的主要临床需要之一，便是要及早进行早期诊断和监测，防治可逆性的肝纤维化逐渐转变为不可逆的肝硬化。
肝脏组织活检仍然是目前诊断肝纤维化的主要的和可靠的手段之一，被认为是肝脏纤维化诊断的“金标准”。然而，肝活检是一种创伤性操作，患者依从性差，存在可能的并发症，难以动态观察和重复进行，并且不能有效地进行定量评价。因此，肝纤维化的无创血清学诊断是组织活检的一种有益的补充和替代检测方法。
目前，在肝纤维化血清学检测中，常见的肝纤维化生物标志物有透明质酸(HA)、III型前胶原肽(PIIINP)、IV型胶原(CIV)、VI型胶原(C VI)、粗纤维调节素(CXIV，Undulin)、层粘素(LN)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、转化生长因子(TGF)、细胞粘合素C(Tenascin)、基质金属蛋白酶及抑制剂复合物(MMP-2/MMP-9/TIMP-1)等。透明质酸(HA)是一种细胞外基质型糖胺多糖，临床上检测透明质酸的方法主要有：(1)基于125I标记的透明质酸结合蛋白(HABP)，采用放射免疫分析方法(RIA)；由于125I标记的HABP有效期短(<45天)，导致成本居高不下，且该方法的建立技术要求高，成本高，不易推广；(2)基于透明质酸结合蛋白(HABP)及酶偶联的抗HABP抗体的间接酶联免疫方法(ELISA)；(3)直接基于抗透明质酸的单克隆抗体，开发的间接竞争型酶联免疫方法(ELISA)等(CN102010469B)。虽然上述技术方法的灵敏度能够达到ng级，但其由于需要放射性标记或制备单克隆抗体，所需成本较高，而且其检测方法的特异性和鲁棒性不强，最低检测限仍然偏高。目前，透明质酸的临床血清学检测仍然需要最低检测限与最低定量限在亚ng级的定量检测方法，仍然需要特异性和鲁棒性更优的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途。本发明提供的透明质酸纳米抗体具有非常高的亲和力，这种高亲和力特性赋予了该纳米抗体在检测透明质酸时的高灵敏度，使其具有更小的最低检测限与最低定量限，从而可以基于夹心法原理和竞争法原理建立固相酶联免疫法(ELISA)更优地应用于临床上血清中透明质酸的检测。
为实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种针对透明质酸的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR。所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ IDNO1所示的FR1，SEQ ID NO2所示的FR2，SEQ ID NO3所示的FR3，SEQ ID NO4所示的FR4；或SEQ ID NO5所示的FR1，SEQ ID NO6所示的FR2，SEQ ID NO7所示的FR3，SEQ ID NO8所示的FR4；
所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO9所示的CDR1，SEQID NO10所示的CDR2，SEQ ID NO11所示的CDR3；或SEQ ID NO12所示的CDR1，SEQ ID NO13所示的CDR2，SEQ ID NO14所示的CDR3；
优选地，所述透明质酸纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示的氨基酸序列。
本发明第二方面，提供了一种透明质酸纳米抗体，它是针对透明质酸表位的纳米抗体，包括两条具有SEQ ID NO15和SEQ ID NO16所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明第三方面，提供一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的透明质酸纳米抗体1的VHH链或透明质酸纳米抗体2的VHH链。优选地，所述DNA分子具有选自下组的DNA序列：SEQ ID 17或SEQ ID 18。
本发明第四方面，提供了一种表达载体，它含有SEQ ID 17或SEQ ID 18所示的核苷酸序列。
本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体，能表达针对透明质酸的纳米抗体1或2。
本发明第六方面，提供了本发明所述的透明质酸纳米抗体的用途，可以作为检测试剂应用于透明质酸的检测。
本发明提供的透明质酸纳米抗体1和2具有非常高的亲和力。经竞争法ELISA分析，亲和力(Kd)分别为5.6*10-10和7.9*10-10mol/L，是普通单克隆抗体的10倍左右。这种高亲和力特性赋予了该纳米抗体在检测透明质酸时的高灵敏度，使其具有更小的最低检测限与最低定量限，从而可以采用竞争法ELISA和夹心法ELISA的原理更优地应用于临床上血清中透明质酸的检测。
附图说明
图1是纳米抗体文库的PCR鉴定结果。随机选取9个菌落，经PCR鉴定，9个菌落全部含有VHH片段，VHH片段插入率近100％。
图2是纳米抗体原核表达及纯化结果。将含纳米抗体基因的pComb3X-Hya转入E.coli TOP10’，IPTG诱导原核表达后，经His-tag介导的Ni-Agorose亲和层析，获得2个高表达的透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2。
图3是采用间接竞争ELISA法测定的透明质酸标准曲线。对透明质酸纳米抗体1(A)和透明质酸纳米抗体2(B)而言，其线性范围均为1-1000ng/ml。
图4是采用夹心ELISA法测定的透明质酸标准曲线。对透明质酸纳米抗体1作为包被抗体/透明质酸纳米抗体2作为一抗(A)和透明质酸纳米抗体2作为包被抗体/透明质酸纳米抗体1作为一抗(B)而言，其线性范围均为1-1000ng/ml。
具体实施方式
本发明通过构建基于单峰骆驼外周血的天然纳米抗体文库，并采用该纳米抗体文库对透明质酸进行3轮筛选，获得了透明质酸纳米抗体的编码基因。将此基因克隆至原核表达载体并转化到大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2。由于所制备的透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2具有非常高的亲和力，进一步采用了竞争法ELISA和夹心法ELISA的原理建立了透明质酸的检测方法，具有高灵敏度，更小的最低检测限与最低定量限。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此处应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落在本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：纳米抗体噬菌体展示文库的制备
采集单峰骆驼外周血，2000rp离心5min，收集外周血细胞(PMBC)，加入Trizol提取总RNA。以总RNA为模板，oligo(dT)20和随机引物(N9)为引物，RT-PCR制备cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，以下列引物进行二轮PCR进行扩增。
第一轮PCR扩增引物：
上游引物：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’
下游引物：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’
第二轮PCR扩增引物：
VHH FR1：5’-ACTGGCCCAGGCGGCCGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3’
VHH FR4：5’-ACTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTC-3’
二轮PCR扩增得到400-500bp的骆驼VHH片段。将扩增获得的VHH片段与pComb3X噬菌体展示载体连接，电转化E.coli XL-1Blue感受态，制备纳米抗体文库。测定纳米抗体库容，大小约为6.8*108。随机选取9个菌落，经PCR鉴定，9个菌落全部含有VHH片段，VHH片段插入率近100％(图1)。进一步采用辅助噬菌体VCSM13感染E.coli XL-1Blue纳米抗体文库，制备得噬菌体展示文库。
实施例2：透明质酸纳米抗体的筛选与原核表达
将100μg/mL透明质酸包被96孔板后，PBS洗涤，加入纳米抗体噬菌体展示文库(1011噬菌体颗粒)，通过噬菌体ELISA分析监测富集指数，经3轮淘洗后，将洗涤收集的噬菌体颗粒感染E.coli XL-1Blue，IPTG诱导表达后，取发酵上清，经HRP偶联的抗HA-单克隆抗体ELISA分析，获得8株高亲和力纳米抗体菌株。进一步将8个质粒转入E.coli TOP10’，IPTG诱导原核表达，经His-tag介导的Ni-Agorose亲和层析，获得2个高表达的透明质酸纳米抗体(图2)。
实施例3：纳米抗体序列、无HA标签纳米抗体的表达及特异性鉴定
1、分别从大肠杆菌中提取2个含纳米抗体基因的质粒pComb3X-Hya-1和pComb3X-Hya-2，采用引物TTTACACTTTATGCTTCCGGCT对上述质粒进行测序，获得了2个纳米抗体氨基酸残基序列(SEQ ID 15与SEQ ID 16)及其对应的编码纳米抗体的DNA序列(SEQ ID 17与SEQ ID 18)。
2、以质粒pComb3X-Hya-1和pComb3X-Hya-2为模板，分别将透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2(SEQ ID 15与SEQ ID 168)的DNA序列(SEQ ID 17与SEQ ID 18)亚克隆至pET22b，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，重组表达不含HA标签的纳米抗体。IPTG诱导原核表达后，经His-tag介导的Ni-Agorose亲和层析，同样获得2个高表达的不含HA标签的透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2。
3、以层黏蛋白、III型前胶原氨基酸末端肽、IV型胶原、硫酸软骨素等为对照，评价透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2的特异性，采用HRP偶联的抗HA单抗为检测抗体，显色后ELISA法检测，测定450nm处吸光度。结果显示：层黏蛋白、III型前胶原氨基酸末端肽、IV型胶原和硫酸软骨素等对照抗原均为阴性，而2个高表达的透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2对透明质酸具有高度的特异性。
实施例4：间接竞争法ELISA测定纳米抗体的亲和力及透明质酸的浓度
通过优化透明质酸包被浓度，选择合适的封闭液，确定透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2的工作浓度，以HRP偶联的抗HA单抗为检测抗体，建立定量测定透明质酸浓度的间接竞争ELISA分析法(图3)。按照间接竞争ELISA的操作流程，制作透明质酸的间接竞争ELISA标准曲线，得到其线性范围是1-1000ng/ml,最低检测限为0.1ng/ml。同时根据间接竞争ELISA法测定透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2的亲和力(Kd)分别为5.6*10-10和7.9*10-10mol/L，是普通单克隆抗体的10倍左右。
实施例5：夹心法ELISA测定透明质酸的浓度
通过优化透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2的包被浓度，选择合适的封闭液，确定透明质酸纳米抗体1和透明质酸纳米抗体2的工作浓度。按照夹心法ELISA的一般原则，制作测定透明质酸的ELISA标准曲线，可以选择(1)无HA标签的透明质酸纳米抗体1作为包被抗体，有HA标签的透明质酸纳米抗体2作为一抗，或者(2)无HA标签的透明质酸纳米抗体2作为包被抗体，有HA标签的透明质酸纳米抗体1作为一抗，并以HRP偶联的抗HA单抗为检测抗体，建立定量测定透明质酸浓度的夹心法ELISA(图4)，得到其线性范围是1-1000ng/ml左右，最低检测限在0.05ng/ml。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽合创健康生物技术有限公司
<120> 一种透明质酸纳米抗体、其编码序列及其用途
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<400> 3
Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Phe
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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Gln Pro Glu Asp Thr
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
35
<210> 4
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<212> PRT
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Thr
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<212> PRT
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 16
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<212> PRT
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Val Glu Asn Thr Ile Ser Leu
65 70 75 80
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<212> DNA
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<400> 17
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tcctgtgcac gctctggata caccgtcagt gcctactgca tgggctggtt ccgccaggct 120
acagggaaga agcgcgagtg ggtcgcagct attggtactg gcggtagcgc aagctacaca 180
gattccgtga agggccgatt caccatctcc aaagacaact tcaagaacac tctgtatctg 240
caaatggata acctgcaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcggc acacgactgc 300
tggtttaact atggactcac tagaagtcat tatgactact ggggccaggg gacccaagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 18
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gaggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcatgtgcac gctctggata cacctacagc cgcgactgta tgggctggtt ccgtcagtct 120
ctagggaagg agcgagaggc agtcggtgtt attgatggtg atggtaaaaa aatgtacata 180
gactccgtaa agggccgatt tactatctcc agcgacaacg tcgagaacac tatatctctt 240
caaatgaaca acatgagacc cgaggacact gccatgtatt actgtgcggc gatgctggtc 300
gacgaacgtt tctggtgcag ctttatccct cccctcaagg agtataagtc ctggggccag 360
gggaccctgg tcaccgtctc ctca 384

Claims (8)

1.一种针对透明质酸的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于：
所述框架区FR选自SEQ ID NO:1所示的FR1、SEQ ID NO:2所示的FR2、SEQ ID NO:3所示的FR3和SEQ ID NO:4所示的FR4，所述互补决定区CDR选自SEQ ID NO:9所示的CDR1、SEQ IDNO:10所示的CDR2和SEQ ID NO:11所示的CDR3；
或者，所述框架区FR选自SEQ ID NO:5所示的FR1、SEQ ID NO:6所示的FR2、SEQ ID NO:7所示的FR3和SEQ ID NO:8所示的FR4，所述互补决定区CDR选自SEQ ID NO:12所示的CDR1、SEQ ID NO:13所示的CDR2和SEQ ID NO:14所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的针对透明质酸的纳米抗体的VHH链，其特征在于：为SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
3.一种透明质酸纳米抗体，其特征在于，它是针对透明质酸中表位的纳米抗体，包括SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VHH链。
4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的透明质酸纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的透明质酸纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，为选自下组的DNA序列：SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
6.一种表达载体，其特征在于，含有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体，可以表达针对透明质酸的纳米抗体。
8.权利要求3所述的透明质酸纳米抗体的用途，其特征在于：所述透明质酸纳米抗体用于制备应用于透明质酸检测的检测试剂。
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