CN117186221A - 大内皮素-1特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大内皮素‑1特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明的大内皮素‑1单克隆抗体为通过单B细胞抗体技术开发的，具有高亲和力，而且生产方便、成本低廉，更好地满足了诊断试剂对抗体稳定性和重复性的要求。

Description

大内皮素-1特异性抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种抗大内皮素-1的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

内皮素(endothelin，ET)不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。它是由21个氨基酸组成的多肽，衍生自约200个氨基酸的前原-ET-1分子。内肽酶切割该前原-ET-1分子产生38个氨基酸的形式，称为大内皮素、大-ET-1、原-ET-1；内皮素转化酶(ECE-1)进一步切割大内皮素产生内皮素-1。内皮素-1是影响整个器官系统血管张力的最强大的内源性化学物质，血管内皮分泌endothelin-1发出血管收缩信号并影响局部细胞生长和存活。ET-1与动脉粥样硬化和高血压等多种心血管疾病的发生和发展有关。

鉴于内皮素-1的可检测的和推测中的大量和重大的生理学作用，自从鉴定出内皮素-1开始，就已经开发出了多种不同的测定法以用于其免疫诊断测定，并将这些测定法用于测量内皮素-1。但是，发现内皮素-1具有极短的在循环中的停留时间，在1-2分钟之后其就已经从循环中被清除。在某些组织和体液中，存在比在血浆中明显更高的内皮素-1浓度。鉴于前述情况，认为测定血浆中的ET-1是不准确的。对于内皮素-1的生理作用来说，血浆样品中的浓度是不重要的，而所有在生物体中存在的游离的和结合的浓度的总和才具有更重要的意义。

相对于测定内皮素-1来说，由于大内皮素在循环中的停留时间比内皮素-1的停留时间明显更长，测定大内皮素具有显著的优点。因此，研究者开始转向研究测定大内皮素。大内皮素单克隆抗体的研究在大内皮素测定中具有重要的意义。

发明内容

本发明通过利用单B细胞抗体技术开发出了高亲和力的临床诊断可用的抗大内皮素-1单克隆抗体，而且生产方便、成本低廉，更好地满足了诊断试剂对抗体稳定性和重复性的要求。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一种抗大内皮素-1的兔源单克隆抗体，具体为单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1或单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2；

其中，单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1重链CDR区的氨基酸序列如下：

CDR-H1：GFSLSSYW(SEQ ID NO:1)；

CDR-H2：ISSRGRT(SEQ ID NO:2)；

CDR-H3：ARETADVRRGPL(SEQ ID NO:3)；

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1轻链CDR区的氨基酸序列如下：

CDR-L1：QASESISSYLN(SEQ ID NO:4)；

CDR-L2：WASTLAS(SEQ ID NO:5)；

CDR-L3：QSTYYISSSNYGNA(SEQ ID NO:6)；

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2重链CDR区的氨基酸序列如下：

CDR-H1：GFSLSNYD(SEQ ID NO:7)；

CDR-H2：IYVSGST(SEQ ID NO:8)；

CDR-H3：ARWDI(SEQ ID NO:9)；

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2轻链CDR区的氨基酸序列如下：

CDR-L1：QSSQSVYDNNNLA(SEQ ID NO:10)；

CDR-L2：YASTLAS(SEQ ID NO:11)；

CDR-L3：QGSYNGPIFA(SEQ ID NO:12)。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1的重链可变区序列如下：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCKASGFSLSSYWMTWVRQAPGEGLEWIGT ISSRGRTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSLTAADTATYFCARETADVRRGP LWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1的轻链可变区序列如下：

DIVMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASESISSYLNWYQQKPGQPPKVLIY WASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECDDAATYYCQSTYYISSSNYGNA FGGGTEVVVK(SEQ ID NO:14)。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2的重链可变区序列如下：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYDMSWVRQAPGKGLEWIGV IYVSGSTYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARWDIWGPGT LVTVSS(SEQ ID NO:15)。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2的轻链可变区序列如下：

AQVLTQTASSVSAAVGGTVTISCQSSQSVYDNNNLAWYQQKPGQPPKL LIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGSYNGPIFAFG GGTEVVVK(SEQ ID NO:16)。

本发明第二方面提供了如上述的单克隆抗体在建立非诊断目的的大内皮素-1免疫检测方法中的应用。

进一步地，所述免疫检测方法为化学发光法。在一些实施方案中，所述化学发光法为利用双抗夹心原理的化学发光法。更进一步地，在该方法中，所述Anti-ET-1rRmab-1为标记抗体，所述Anti-ET-1rRmab-2为包被抗体。

本发明第三方面提供了如上述的单克隆抗体在制备用于检测大内皮素-1的试剂或试剂盒中的应用。

本发明第四方面提供了如上述的单克隆抗体的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：

1)使用内皮素-1为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；

2)使用大内皮素-1作为筛选原，筛选特异性B淋巴细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；

3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；

4)收集培养上清并纯化，即得单克隆抗体。

进一步地，步骤1)所述内皮素-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

进一步地，步骤2)所述大内皮素-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

进一步地，步骤2)所述PCR所用的引物序列如SEQ ID NO.19-22所示。

抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：

caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO.19)。

抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：

tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg(SEQ ID NO.20)。

抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：

caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO.21)。

抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：

tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg(SEQ ID NO.22)。

进一步地，步骤4)所述纯化具体为：上清过proteinA亲和层析柱，将含有所述抗体的洗脱液超滤浓缩后置于PBS中透析。

本发明第五方面提供了如上述的单克隆抗体的重组表达制备方法，具体包括以下步骤：

1)重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得抗体轻链、重链质粒；

2)质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞。培养后，离心收集细胞上清，经纯化后获得单克隆抗体。

有益效果

本发明开发了能够用于免疫检测试剂中的抗大内皮素-1单克隆抗体对，其制备成的化学发光法免疫检测试剂能实现高灵敏度、高特异性检测临床样本中大内皮素-1。本发明利用单B细胞技术的重组抗体，不仅生产放大方便，批间差可控，而且成本更低廉。

附图说明

图1为抗原特异性单B细胞流式细胞仪分选图；

图2为本发明的配对抗体在化学发光平台上应用于临床样本检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

实施例1抗大内皮素-1单克隆抗体对的制备

1.抗原制备

为减少蛋白结构对免疫原影响，及特异性抗体的有效产生，本实施例选择应用内皮素-1作为免疫原，同时表达大内皮素-1作为分选原。

内皮素-1，本实施例选择哺乳动物表达系统，带His标签。

大内皮素-1，本实施例选择哺乳动物表达系统，带His标签，同步合成多肽。因大内皮素-1N端由二硫键形成的空间构象，分选原选择哺乳动物系统表达的蛋白。

免疫原内皮素-1，序列为：

MDYLLMIFSLLFVACQGAPETAVLGAELSAVGENGGEKPTPSPPWRLRRSKRCSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRSKRALENLLPTKATDRENRCQCASQKDKKCWNFCQAGKELRAEDIMEKDWNNHKKGKDCSKLGKKCIYQQLVRGRKIRRSSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTHNRAHW(SEQ IDNO:17)

分选原大内皮素-1，序列为：

CSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRS(SEQ ID NO:18)

为获得大内皮素-1兔单克隆抗体，以自主研发的内皮素-1为免疫原，免疫新西兰大白兔，每只免疫500ug。首次免疫，免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，间隔3周取250ug免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集PBMC样本，大内皮素-1分选原包板，ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，250ug免疫原于皮下多点注射加强免疫一次后取兔子脾脏。

2.单B细胞悬液制备

兔脾脏样本淋巴细胞的分离与制备，是通过物理研磨兔脾脏，经多孔滤网过滤制备单细胞悬液。单细胞悬液用于细胞染色和流式分选工作。

3.抗原特异性单B细胞分选

抗原特异性单B细胞分选，是基于流式抗体特异性识别淋巴B细胞表面特征性标志物，应用流式细胞分选术完成淋巴细胞悬液中特异性单个B细胞的获取。

本实施例中，分选原偶联FITC染料。

抗兔IgG二抗，是自研类抗体。偶联PE染料。

细胞标记时，加入DAPI染料，以区分死/活细胞(Dead/Live细胞)。

细胞标记方案，淋巴B细胞分选方案：Dead/Live-/IgG+/Antigen+。

细胞标记操作：兔淋巴细胞悬液，300g离心5min，加入5ml buffer液，上下颠倒混匀，300g离心5min。弃上清，重复1次，取30ul细胞悬液进行细胞计数，取40ul细胞悬液，用于空白对照管和待标记的单染管。剩余细胞液作为样本管，300g离心5min，加少量PBS液重悬。空白管不做处理。单染管，补充PBS液至100ul，分别加入2ul PE、2ul FITC、2ul DAPI染料。样本管按照PE染料1.5ul/10⁶细胞，FITC染料2ug/10⁶细胞，计算实际加入量，避光加入相应的抗体，4℃放置30min。抗体孵育结束后，加入2ml buffer液，轻混匀，300g离心5min，重复洗3次。1ml buffer液重悬，细胞过滤后，等待上机分选。

完成荧光补偿调节后，基于活细胞群，圈定PE和FITC双阳性信号细胞群，抗原特异性B细胞分选入96孔板中，每孔仅有1个细胞，分选后孔板需立即低温保存，本实施例实验中备有干冰盒，可短暂放置。孔中装有细胞裂解液，分选的96孔PCR板直接进行单细胞抗体基因的扩增。

4.兔单B细胞cDNA制备

单B细胞cDNA文库制备，是基于SMART 5’RACE技术，所用试剂皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)N711试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考N711试剂盒说明书。

单B细胞RNA逆转录：完成分选的96孔板，解冻后置于PCR仪中运行程序，程序结束后冰上静置2min。

单B细胞cDNA单链合成：逆转录反应程序结束后，可加入单链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置2min。

单B细胞DNA双链合成：cDNA单链产物的合成反应结束后，可加入双链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，离心后置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。

5.兔单B细胞PCR技术扩增抗体编码基因

单个B细胞cDNA文库，可调取天然配对的抗体重链和轻链编码基因。

编码基因扩增所用试剂，皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)P515试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考P515试剂盒说明书。

上游引物包含与启动子CMV基因序列3’端互搭的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。

抗体重链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互搭的同源臂。

轻链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互补的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。

抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：

caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc。

抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：

tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg。

抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：

caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc。

抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：

tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg。

抗体轻链、重链编码基因调取：按照说明书加入PCR扩增体系，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。

本实施例中，抗体轻链、重链编码基因在同一96孔板的扩增产物配对阳性率在80％以上，借助琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，说明单B细胞流式分选和编码基因扩增实验均是有效的。扩增产物，用于重组表达质粒的构建。

6.抗体重链和轻链重组表达质粒的构建与表达

重组表达载体，选择pcDNA3.1(Invitrogen)，在ThermoFisher SCIENTIFIC官网购买。重组构建前，选择HindⅢ限制酶单酶切实现表达载体线性化，限制酶在New EnglandBiolabs官网购买。

载体与编码基因的高效重组，选择无缝克隆试剂盒，在Vazyme官网购买C115#试剂盒。

重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB固定培养基平板，平板倒置37℃过夜培养。

重组阳性克隆挑选：初筛抗体的重链和轻链，分别挑取8个单菌落，PCR菌检后确定菌落阳性率。

重组质粒的菌检PCR，位于载体的上游引物序列为：caagctggctagcgtttaaactt。

抗体重链菌检PCR下游引物序列为：ctcatttacccggagagcg。

抗体轻链菌检PCR下游引物序列为：acctcaacagtcacccctattg。

重组阳性克隆送测：抗体重链、轻链，分别挑取5个菌检PCR阳性克隆送上海生工生物公司测序。

兔抗体基因序列分析：应用IMGT数据库完成抗体序列V区基因确定，并对抗体重链及轻链CDR1/CDR2/CDR3区等完成抗体序列的分析，导出并确定菌检PCR阳性克隆的正确序列编号。

重组表达质粒的小量表达：正确序列的克隆，菌液中量小提获得抗体轻链、重链质粒。质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞。细胞转染10天后，离心收集细胞上清。上清进行抗原特异性评测，等ELISA初筛结果后安排细胞上清纯化。

本实施例中每轮转染100个质粒，即每轮转染可获得100株单克隆抗体。共进行5轮转染实验。

7.重组表达上清抗原特异性评测

抗原包被板制备，筛选原选择大内皮素-1#(DNPS-1#)多肽、大内皮素-2#(DNPS-2#)多肽、大内皮素-3#(DNPS-3#)多肽、内皮素-1、大内皮素-1。其中DNPS-1#、DNPS-2#、DNPS-3#因多肽序列较短，偶联OVA载体蛋白，完成抗原板包被。

大内皮素-1单克隆抗体的筛选方案，与内皮素-1、大内皮素-1和DNPS-1#同时反应，且不与DNPS-2#、DNPS-3#多肽反应的抗体，即初步定为大内皮素-1特异性单克隆抗体。

筛选原DNPS-1#，序列为

CSCSSLMDKECVYFCHLDIIWVNTPEHVVPYGLGSPRS。

筛选原DNPS-2#，序列为

CSCSSWLDKECVYFCHLDIIWVNTPEQTAPYGLGNPP。

筛选原DNPS-3#，序列为

CTCFTYKDKECVYYCHLDIIWINTPEQTVPYGLSNYRGSFR。

间接ELISA检测细胞上清，应用自产兔二抗Anti-Rabbit IgG mAb，兔二抗检测OD>0.5，说明重组质粒的正常表达。

间接ELISA检测细胞上清，分别对5种抗原包被板进行反应性评测，得到孔板上清的初筛检测结果(仅例示性展示50株细胞上清的检测数据)。

表1：部分抗体的抗原-抗体的亲和力数据表

间接ELISA检测结果：大内皮素-1抗体初筛共转染500株单克隆抗体，与内皮素-1、大内皮素-1和DNPS-1#同时反应，且不与DNPS-2#、DNPS-3#反应的抗体，初步筛选出100株单克隆抗体。

初步筛选确定的细胞上清，经proteinA纯化后获得小量单克隆抗体，每株平均1-3mg。

实施例2单克隆抗体对在化学发光平台中的应用

重组表达100株抗体，应用DNPS-1多肽包板，间接ELISA测定反应性。反应性OD值大于2，判定初筛定株和重组表达问题，上化学发光平台筛选较优配对抗体。

化学发光平台的操作如下：

磁珠包被：取2mg磁珠，活化buffer清洗2次，后加入一定量的EDC振荡混匀，磁吸弃上清。沉淀加入1000ul偶联buffer，加入抗体40ug，振荡混匀2h，后加入100ul封闭液，振荡混匀封闭3h。最后加入1000ul TBST清洗磁珠，再加入1000ul保存液。

吖啶酯标记：取100-(100/CAb)uL偶联Buffer至0.5mL的棕色EP管中，加入(100/CAb)uLAb(Ag)至0.5mL的棕色EP管中，使抗体标记终浓度在1mg/mL，加入5mM的吖啶酯到0.5ml的棕色EP管中，漩涡振荡器混合均匀，之后室温(20-25℃)条件下垂直混匀仪反应2h，纯化去除游离的吖啶酯。设置程序并上机检测。

实验应用奥地利BIOMEDICA大内皮素-1ELISA检测试剂盒(Cat.No.BI-20082H)对32个临床样本定值，用于配对抗体筛选。基于化学发光平台完成100株抗体的配对筛选，最终筛选到1对配体抗体，命名为标记抗体Anti-ET-1rRmab-1和包被抗体Anti-ET-1rRmab-2。

实验结果显示：配体抗体rRmab-1和rRmab-2的检测限0.05pmol/M(0.214pg/ml)，检测临床高、中、低值样本时，相关性R²＝0.9665，如图2显示，因此可确定该配对抗体可用于临床样本检测。

表2：配对抗体临床样本测定结果

筛到的配体抗体，标记抗体(Anti-ET-1rRmab-1)，重链可变区序列为：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCKASGFSLSSYWMTWVRQAPGEGLEWIGTISSRGRTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSLTAADTATYFCARETADVRRGPLWGPGTLVTVSS；

轻链可变区序列为：

DIVMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASESISSYLNWYQQKPGQPPKVLIYWASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISDLECDDAATYYCQSTYYISSSNYGNAFGGGTEVVVK；

包被抗体(Anti-ET-1rRmab-2)，重链可变区序列为：

QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYDMSWVRQAPGKGLEWIGVIYVSGSTYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARWDIWGPGTLVTVSS；

轻链可变区序列为：

AQVLTQTASSVSAAVGGTVTISCQSSQSVYDNNNLAWYQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQGSYNGPIFAFGGGTEVVVK。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (12)

1.一种抗大内皮素-1的兔源单克隆抗体，具体为单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1或单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2；

其中，单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1重链CDR区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示，

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1轻链CDR区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示，

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2重链CDR区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7-9所示，

单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2轻链CDR区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10-12所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1的重链可变区序列如SEQ ID NO:13所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:14所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2的重链可变区序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:16所示。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体在非诊断目的的大内皮素-1免疫检测方法中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述检测方法为化学发光法。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-1为标记抗体，所述单克隆抗体Anti-ET-1rRmab-2为包被抗体。

7.根据权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测大内皮素-1的试剂或试剂盒中的应用。

8.根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：

1)使用内皮素-1为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；

2)使用大内皮素-1作为分选原，分选特异性淋巴B细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；

3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；

4)收集培养上清并纯化，即得单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤1)所述内皮素-1的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤2)所述大内皮素-1的氨基酸序列如SEQID NO.18所示。

11.根据权利要求8所述的制备方法，其中步骤2)所述PCR所用的引物序列如SEQ IDNO.19-22所示。

12.根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：

1)重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得抗体轻链、重链质粒；

2)质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞，培养后，离心收集细胞上清，经纯化后获得单克隆抗体。