CN111004325B

CN111004325B - 一种iii型前胶原n端肽纳米抗体、其编码序列及其用途

Info

Publication number: CN111004325B
Application number: CN202010002105.6A
Authority: CN
Inventors: 王永中
Original assignee: Anhui Hechuang Health Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Hechuang Health Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2040-01-02
Also published as: CN111004325A

Abstract

本发明公开了一种人III型前胶原N端肽(PIIINP)纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR1‑4的氨基酸序列和互补决定区CDR1‑3的氨基酸序列；本发明公开了一种PIIINP纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的PIIINP纳米抗体的VHH链或本发明所述的PIIINP纳米抗体；本发明还公开了一种宿主细胞，它可以表达针对PIIINP的纳米抗体，具有非常高的亲和力；还公开了该纳米抗体检测PIIINP的用途，可以应用于临床上血清中PIIINP的检测。

Description

一种III型前胶原N端肽纳米抗体、其编码序列及其用途

技术领域

本发明涉及一种III型前胶原N端肽(PIIINP)纳米抗体、其编码序列及其用途，属于生物医学或生物制药技术领域。

背景技术

肝纤维化是目前全世界发病率与死亡率居高不下的主要原因之一。肝星形细胞的激活和异常增殖导致细胞外基质成分的大量分泌和累积，例如III型前胶原N端肽(PIIINP)、透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、VI型胶原(CVI)、粗纤维调节素(CXIV，Undulin)、层粘素(LN)、细胞粘合素C(Tenascin)等，是最终导致进展性肝纤维化的主要原因之一。几乎所有的肝脏疾病，特别是乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性肝病、自身免疫性或遗传性肝病等常见高发肝脏疾病，都会逐渐发展为进展性肝纤维化，最终发展为肝硬化。

肝纤维化是由慢性肝损伤导致的细胞外基质的大量分泌和累积而引发的，这种累积是可逆性的，临床上一般观察不到致死性结节形成；而肝硬化则是细胞外基质大量分泌和累积到一定程度后，围绕肝实质细胞形成大量坏死性结节，其病理过程不可逆。因此，对任何肝脏疾病的预防和治疗的主要临床需要之一，便是要及早进行早期诊断和监测，防治可逆性的肝纤维化逐渐转变为不可逆的肝硬化。

肝脏组织活检仍然是目前诊断肝纤维化的主要的和可靠的手段之一，被认为是肝脏纤维化诊断的“金标准”。然而，肝活检是一种创伤性操作，患者依从性差，存在可能的并发症，难以动态观察和重复进行，并且不能有效地进行定量评价。因此，肝纤维化的无创血清学诊断是组织活检的一种有益的补充和替代检测方法。

目前，在肝纤维化血清学检测中，常见的肝纤维化生物标志物有III型前胶原N端肽(PIIINP)、透明质酸(HA)、IV型胶原(CIV)、VI型胶原(CVI)、粗纤维调节素(CXIV，Undulin)、层粘素(LN)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、转化生长因子(TGF)、细胞粘合素C(Tenascin)、基质金属蛋白酶及抑制剂复合物(MMP-2/MMP-9/TIMP-1)等。PIIINP是一个分子量为42KD的多肽三聚体，在III型胶原的合成和沉积过程中，PIIINP可以从III型胶原前体释放到血液循环中。血液中PIIINP的含量在肝纤维增生或一些结缔组织疾病中显著增加，已经用于甲氨蝶呤治疗患者、全身性硬皮病患者肝纤维化的长期监测。PIIINP被用作肝纤维化的生物标记物，以及单纯脂肪肝和非酒精性肝炎脂肪肝的可能标志物。目前最广泛使用的PIIINP测定方法是基于传统单克隆抗体的免疫分析方法，包括使用放射性标记示踪的免疫放射分析(RIA)(Knudsen CS,et al.Clin Chem Lab Med 2014；52(2):237–241)。由于上述技术方法于需要放射性标记或制备单克隆抗体，所需成本较高，而且其检测方法的特异性和鲁棒性不强，最低检测限仍然偏高。当前，PIIINP的临床血清学检测仍然需要最低检测限与最低定量限在亚ng级的定量检测方法，仍然需要特异性和鲁棒性更优的定量检测方法。

因此，发明一种III型前胶原N端肽纳米抗体、其编码序列及其用途来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PIIINP纳米抗体、其编码序列及其用途。本发明提供的PIIINP纳米抗体具有非常高的亲和力，这种高亲和力特性赋予了该纳米抗体在检测PIIINP时的高灵敏度，使其具有更小的最低检测限与最低定量限，从而可以通过建立固相酶联免疫法(ELISA)更优地应用于临床上血清中PIIINP的检测。

本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：

本发明的第一方面，提供了一种针对PIIINP的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR。

所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO1所示的FR1，SEQ ID NO2所示的FR2，SEQ ID NO3所示的FR3，SEQ ID NO4所示的FR4；

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO5所示的CDR1，SEQID NO6所示的CDR2，SEQ ID NO7所示的CDR3；

优选地，所述PIIINP纳米抗体的VHH链，它具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，提供了一种PIIINP纳米抗体，它是针对PIIINP表位的纳米抗体，包括具有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的PIIINP纳米抗体的VHH链。优选地，所述DNA分子具有选自下组的DNA序列：SEQ ID 9。

本发明第四方面，提供了一种表达载体，它含有SEQ ID 9所示的核苷酸序列。

本发明第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体，能表达针对PIIINP的纳米抗体。

本发明第六方面，提供了本发明所述的PIIINP纳米抗体的用途，可以作为检测试剂应用于PIIINP的检测。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的PIIINP纳米抗体具有非常高的亲和力，其亲和力(Kd)在10-10mol/L数量级，是普通单克隆抗体的10倍左右。这种高亲和力特性赋予了该纳米抗体在检测PIIINP时的高灵敏度，使其具有更小的最低检测限与最低定量限，从而可以更优地应用于临床上血清中PIIINP的检测。

附图说明

图1是纳米抗体文库的PCR鉴定结果示意图，其中随机选取10个菌落，经PCR鉴定，10个菌落全部含有VHH片段，VHH片段插入率近100％；

图2是纳米抗体原核表达及纯化结果示意图，其中将含纳米抗体基因的pET22b-PIIINP-Nb转入E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导原核表达后，经Strep tag II介导的Streptactin Beads 4FF亲和层析，获得高表达的PIIINP纳米抗体；

图3是采用ELISA法测定的PIIINP的示意图，其中PIIINP为待测样品，BSA和空白均为对照。VHH是纳米抗体，HA是纳米抗体上的标签，HRP为辣根过氧化酶，TMB为HRP的显色底物；

图4是采用ELISA法测定的PIIINP的模式图，其中待测抗原PIIINP以及对照抗原BSA包被在96孔板，每组样品至少重复3个包被。加入相应的纳米抗体进行识别相应抗原后，进一步加入HRP标记的抗HA单抗，最终TMB显色；

图5是采用间接竞争ELISA法测定的PIIINP标准曲线图，其中对PIIINP纳米抗体而言，其线性范围为1-1000ng/ml。

具体实施方式

本发明通过构建基于单峰骆驼外周血的天然纳米抗体文库，并采用该纳米抗体文库对PIIINP进行3轮筛选，获得了PIIINP纳米抗体的编码基因。将此基因克隆至原核表达载体并转化到大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的PIIINP纳米抗体。由于所制备的PIIINP纳米抗体具有非常高的亲和力，进一步采用ELISA的原理建立了PIIINP的检测方法。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此处应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落在本申请所附权利要求书所限定的范围；下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：纳米抗体噬菌体展示文库的制备

采集单峰骆驼外周血，2000rp离心5min，收集外周血细胞(PMBC)，加入Trizol提取总RNA，以总RNA为模板，oligo(dT)20和随机引物(N9)为引物，RT-PCR制备cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，以下列引物进行二轮PCR进行扩增；

第一轮PCR扩增引物：

上游引物：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’

下游引物：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’

第二轮PCR扩增引物：

VHHFR1：5’-ACTGGCCCAGGCGGCCGATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3’

VHHFR4：5’-ACTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTC-3’

二轮PCR扩增得到400-500bp的骆驼VHH片段，将扩增获得的VHH片段与pComb3X噬菌体展示载体连接，电转化E.coliXL-2Blue感受态，制备纳米抗体文库；测定纳米抗体库容，大小约为6.8*108，随机选取10个菌落，经PCR鉴定，10个菌落全部含有VHH片段，VHH片段插入率近100％如图1所示；进一步采用辅助噬菌体VCSM13感染E.coliXL-2Blue纳米抗体文库，制备得噬菌体展示文库。

实施例二：PIIINP纳米抗体的筛选与原核表达

将100μg/mL PIIINP包被96孔板后，PBS洗涤，加入纳米抗体噬菌体展示文库(1011噬菌体颗粒)，通过噬菌体ELISA分析监测富集指数，经3轮淘洗后，将洗涤收集的噬菌体颗粒感染E.coli XL-2 Blue，IPTG诱导表达后，取发酵上清，经HRP偶联的抗HA-单克隆抗体ELISA分析，获得1株高亲和力纳米抗体菌株；进一步将该质粒转入E.coli TOP10’，IPTG诱导原核表达，经Strep tag II介导的Streptactin Beads 4FF亲和层析，获得1个高表达的PIIINP纳米抗体如图2所示。

实施例三：纳米抗体的表达及特异性鉴定

1、分别从大肠杆菌中提取纳米抗体基因的质粒pComb3X-PIIINP-Nb，采用引物TTTACACTTTATGCTTCCGGCT对上述质粒进行测序，获得了1个纳米抗体氨基酸残基序列(SEQID 8)及其对应的编码纳米抗体的DNA序列(SEQ ID 9)；

2、以质粒pComb3X-PIIINP-Nb为模板，分别将PIIINP纳米抗体(SEQ ID 8)的DNA序列(SEQ ID 9)亚克隆至pET22b，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，重组表达含HA标签的纳米抗体；IPTG诱导原核表达后，经Strep tag II介导的Streptactin Beads 4FF亲和层析，获得1个高表达的含HA标签的PIIINP纳米抗体；

3、以牛血清白蛋白BSA为对照，评价PIIINP纳米抗体的特异性，采用HRP偶联的抗HA单抗为检测抗体，显色后ELISA法检测，测定450nm处吸光度如图4所示；结果显示：BSA作为对照抗原均为阴性，而PIIINP纳米抗体对PIIINP具有高度的特异性，同时BSA纳米抗体对BSA抗原的显色呈现阳性，而对PIIINP则呈现阴性。具体结果见下表：

实施例四：间接竞争法ELISA测定PIIINP的浓度

通过优化待测抗原PIIINP及对照抗原BSA包被浓度，并以空白对照未包被孔作为对照，选择合适的封闭液，确定含HA标签的PIIINP纳米抗体的工作浓度，以HRP偶联的抗HA单抗为检测抗体，建立定量测定PIIINP浓度的间接竞争ELISA分析法，按照间接竞争ELISA的操作流程，制作PIIINP的间接竞争ELISA标准曲线如图5所示，并用于PIIINP的测定。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 安徽合创健康生物技术有限公司

<120> 一种III型前胶原N端肽纳米抗体、其编码序列及其用途

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 1

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ser

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 3

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Val Asn Lys Leu Lys Phe Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

35

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 4

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 5

Arg Pro Phe Ser Thr Tyr Val

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 6

Trp Ser Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 7

Ala Thr Lys Tyr Val Thr Ser Met Lys Ser Glu Asn Tyr Asp

1 5 10

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 8

Met Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Thr

20 25 30

Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe

35 40 45

Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Val Asn Lys Leu Lys Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Thr Lys Tyr Val Thr Ser Met Lys Ser Glu Asn Tyr Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 372

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

atggcggtgc agctggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 60

ctctcctgtg cagcctccgg acgccccttc agtacctatg tcatgggctg gttccgccag 120

gctccaggga aggagcgtga gtttgtagca gctattagct ggagtggtgg taggacatac 180

tatgtagact ccgtgaaggg ccgattctcc atctccagag acaacgccaa gaacacggtg 240

tatctgcaag tgaacaaact gaaatttgag gacacggccg tttattactg tgcagccacg 300

aagtatgtaa cgagtatgaa atccgaaaac tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360

accgtctcct ca 372

Claims

1.一种针对PIIINP的纳米抗体的VHH链，其特征在于，包括4个框架区FR和3个互补决定区CDR，四个所述框架区FR包括以下氨基酸序列：

SEQ ID NO1所示的FR1，SEQ ID NO2所示的FR2，SEQ ID NO3所示的FR3，SEQ ID NO4所示的FR4；

三个所述互补决定区CDR包括以下氨基酸序列：

SEQ ID NO5所示的CDR1，SEQ ID NO6所示的CDR2，SEQ ID NO7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的一种针对PIIINP的纳米抗体的VHH链，其特征在于：它具有SEQID NO8所示的氨基酸序列。

3.一种PIIINP纳米抗体，其特征在于，它是针对PIIINP表位的纳米抗体，包括具有SEQID 8所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的PIIINP纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的PIIINP纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的一种DNA分子，其特征在于，它含有选自下组的DNA序列：SEQID 9。

6.一种表达载体，其特征在于，它含有SEQ ID 9所示的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的表达载体，可以表达针对PIIINP的纳米抗体。