CN1793928A - 患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法。该检测方法由以下步骤组成：1)以血小板膜抗原复合物免疫动物获得的多克隆抗体进行包被并进行封闭；2)洗板；3)依次加入患者样本或对照和酶标动物抗人抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。本发明可快速、同步检测血小板相关抗体(PAIg)和血小板特异性抗体(PSIg)，并同步筛选相合的献血者，特异性提高的同时缩短了诊断时间，为救治患者争取了时间。本发明提高了临床血小板输注的安全性和有效性，将在临床医学上具有较高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域中一种检测方法，具体涉及一种患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法。
背景技术
临床输血中，随着成分输血地不断推广，血液治疗越来越受到人们的关注而成为研究热点，如何快速、安全、有效地输血常常关系到患者的生命，也是今后的发展趋势。血小板输注可降低由于血小板减少所引起的严重出血，并已成为血液病及肿瘤患者放、化疗的有效支持疗法，其用量在全世界呈不断上升的趋势，但反复输血者可能产生血小板相关抗体及输血小板无效(RPT)，故血小板抗体的检测在疾病诊断和疗效判断方面非常重要。如何提高血小板输注的临床疗效或避免输注无效，成为令人关注的研究课题。虽然血小板抗体的检测技术和方法很多，但迄今为止还没有一种具有临床实用价值的血清学检测方法。
现有的血小板抗体检测技术和方法很多，但各种方法检测的结果不尽相同，且差异较大，主要分为以下几类：血小板粘附免疫荧光试验(PAIFT)；单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)；固相微板技术又称固相红细胞粘附技术(SPRCAT)；简易致敏红细胞血小板血清学技术(SEPSA)；改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验(MACE)；磁珠介导的流式细胞仪血小板分析方法(BPA)，基因检测技术用于血小板分型。后两种方法技术条件和设备要求高，分子生物学的方法可以预测血小板血型的表现型，但实际的血型抗原却无法用该技术检测，而且DNA技术不能用于抗体筛选。前几种方法从实验原理分析，这些技术仅能检测血小板表面是否粘附Ig或血清中是否含有可致敏血小板的Ig，不能确定该抗体是否是血小板特异性抗体，而且存在一些缺点，如特异性和/或灵敏度较低、操作繁琐、时间长、需血量大、成本高等；另一方面，获得全套单抗相当困难，且价格昂贵。
目前，临床普遍采用SEPSA和MACE的方法进行血小板抗体筛选，敏感性和特异性仅为30％和40％，在很多非免疫性疾病中PAIg均可见升高，免疫性血小板减少的诊断可靠性日益受到挑战。包被的血小板会出现溶解现象，而溶解后其膜抗原的构象表位会发生改变，导致自身抗体检出率降低，假阳性概率增加。即便是MAIPA，整个操作过程需要4小时，敏感性和特异性亦仅为47％和85％，而且需要单克隆抗体特异性血小板表面蛋白，在某些情况下因单克隆抗体的覆盖面窄，故抗原的检出受到限制。血清免疫球蛋白非特异性吸附于靶血小板是该类试验的共同问题。因此，仅根据以上试验结果便作出诊断或判断RPT是否由血小板特异性抗体引起是片面的。
发明内容
本发明的目的是提供一种较简便、特异性较高的患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法。
本发明所提供的用于检测患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫吸附剂测定法由以下步骤组成：由以下步骤组成：1)以血小板膜抗原复合物(OMPC)免疫动物获得的多克隆抗体进行包被并进行封闭；2)洗板；3)依次加入患者样本或对照和酶标动物抗人抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。
所述步骤3)中的患者样本可为患者血小板OMPC，此时的对照为正常血小板OMPC(阴性对照)、血小板相关抗体(PAIgG)阳性OMPC(阳性对照)和血小板特异性抗体(PSIgG)阳性OMPC(阳性对照)；所述患者血小板OMPC的浓度可为1.5-2.5mg/mL，优选为2mg/mL。
所述步骤3)中患者样本还可为患者血清，此时的对照为正常血清(阴性对照)、血小板相关抗体(PAIgG)阳性血清(阳性对照)和血小板特异性抗体(PSIgG)阳性血清(阳性对照)；所述患者血清的量可为8-12ul，使用时再用样本稀释液按比例(如1∶9)进行适当稀释。
所述包被步骤为将小分子物质与载体蛋白的偶联物固定于固相载体表面；所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清白蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白，所述小分子物质与载体蛋白的偶联物可通过将小分子物质和载体蛋白用戊二醛法或重氮化法进行偶联得到；所述固定方法可采用物理吸附或共价交联的方法；所述固相载体可为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或纤维素等多种材料制成的微量反应板，优选为聚苯乙烯材料的微量反应板。
具体来讲，本发明的小分子物质是将血小板膜抗原复合物免疫动物，如兔、鼠、羊或马等常用的免疫动物获得的多克隆抗体；所述用于包被的多克隆抗体的浓度可为1-20μg/mL，优选为6μg/mL。
为提高检测的灵敏度，包被后还可用甘油和5％BSA等进行封闭。
所述用于标记动物抗人抗体的酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在二抗上；所述动物抗人抗体可为羊抗人、鼠抗人等抗体。
所述洗板所用的洗涤剂可为含有0.04-0.06％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)；所述显色用的底物缓冲液由等体积的底物溶液A液和底物溶液B液组成，所述底物溶液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述底物溶液B液为四甲基联苯胺(TMB)贮液；所述终止反应用的终止液为1-2mol/L的硫酸硫酸或盐酸溶液。
每个步骤的反应时间控制在30-40min为宜，延长反应时间则本底升高，非特异性吸附增多。
终止反应后，测定450nm的OD值，根据公式：cutoff值＝0.13×P+N进行抗体阳性判断，标本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N)，若P/N大于或等于2.0判定为阳性。
本发明所提供的酶联免疫吸附检测方法采用血小板膜抗原复合物免疫动物获得多克隆抗血清，以此多抗包被酶联反应板，并进行封闭，阻断大多数非特异性吸附，提高了检测的敏感性，可快速、同步检测血小板相关抗体(PAIg)和血小板特异性抗体(PSIg)，并同步筛选相合的献血者，特异性提高的同时缩短了诊断时间，为救治患者争取了时间。本发明提高了临床血小板输注的安全性和有效性，将在临床医学上具有较高的实际应用价值。
附图说明
图1为四种方法提取的血小板OMPC的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果
图2为不同抗体浓度与OD450值关系曲线
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、血小板膜抗原复合物(OMPC)免疫家兔获得多克隆抗血清及多克隆抗体的纯化
一、血小板悬液的制备、外膜蛋白复合物的提取与鉴定
1、血小板悬液的制备
取人富含血小板血浆(PRP)50mL于离心管中，22℃ 3000rpm离心20min，将沉淀用TEGS(Tris 20mmol/L，EDTA 0.6mmol/L，Glu 5mmol/L，NaCl 148mmol/L，pH7.4)充分洗涤3-5次，尽量去除红细胞和白细胞成分，最后用生理盐水调整血小板浓度为5×109个/mL，分装后-20℃保存备用。
2、血小板外膜蛋白复合物(OMPC)的提取
用下述四种方法进行血小板外膜蛋白复合物(OMPC)的提取：
1)SDS破碎法：将分离出的血小板悬液用TEGS调整浓度至1×109个/mL，加入5倍体积的SDS悬浮缓冲液(北京中山试剂公司)，100℃水浴5min，置冰浴冷却，10000rpm离心10min，吸取上清，得到血小板裂解液，-20℃保存备用。
2)Triton X-100裂解法：将分离出的血小板悬液用TEGS调整浓度至1×109个/mL，加入Tris-HCl 100mmol/L、150mM NaCl、5mM EDTA、1mmol/L PMSF(Sigma)和终浓度为1％的TritonX-100，4℃放置12-24小时后，10000rmp离心15min，取上层液体即为血小板裂解液，-20℃保存备用。
3)DTT裂解法：将分离出的血小板悬液用TEGS调整浓度至1×109个/mL，加入Tris-HCl 100mmol/L、150mM NaCl、5mM EDTA、1mmol/L PMSF和终浓度为1％的二硫苏糖醇溶液(DTT)混匀，4℃放置12-24小时后，10000rmp离心15min，取上层液体即为血小板裂解液，-20℃保存备用。
4)NP-40裂解法：将分离出的血小板悬液用TEGS调整浓度至1×109个/mL，加入Tris-HCl 100mmol/L、150mM NaCl、5mM EDTA、1mmol/L的PMSF、0.5％的吐温-20和终浓度为0.5％的NP-40(Sigma)混匀，4℃放置12-24小时后，10000rmp离心15min，取上层液体即为血小板裂解液，-20℃保存备用。
3、OMPC的鉴定
1)SDS-PAGE检测
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对步骤2用四种方法提取的血小板外膜蛋白OMPC进行鉴定，由于血小板主要的外膜糖蛋白分子量在80kDa-160kDa之间，属于大分子蛋白，因此选择6％的分离胶和5％的积层胶作为电泳胶的浓度。将用上述四种方法得到的血小板裂解液和大分子蛋白Marker各取10uL与上样缓冲液10uL混匀，离心除去气泡，每孔上样15uL，先80v 10min再150V直到电泳完全。取下胶条，用考马斯亮蓝染色15min，脱色。结果如图1所示(泳道1为蛋白Marker，泳道2为DTT裂解法获得的血小板外膜蛋白OMPC，泳道3为SDS裂解法获得的血小板外膜蛋白OMPC，泳道4为NP-40裂解法获得的血小板外膜蛋白OMPC，泳道5为TritonX-100裂解法获得的血小板外膜蛋白OMPC)，表明用上述四种方法均可得到血小板外膜蛋白OMPC，但效果有不同，可根据实际情况进行选择。
2)Western blotting鉴定
仪器：bio-rad垂直电泳槽，半干式碳板转移电泳槽(六一厂)，摇床，NC膜(华美，0.45micron)。
试剂：30％丙烯酰胺，10％过硫酸铵，底物显色液配方为：5mL 0.1MTris-HCl(pH7.6)，4mg DAB(华美生物工程公司)，15ul 30％H2O2，2mg NiCL2，加入CoCL2或NiCL2具有增敏作用，可使条带显色更明显)。
用Western blotting的方法对上述四种方法获得的血小板外膜蛋白OMPC做进一步鉴定，所用的一抗为上述获得的兔抗人血小板多抗，酶标二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(北京中山试剂公司)，结果表明用上述四种方法均可得到纯度较高的血小板外膜蛋白OMPC，但抗体滴度有不同，可根据实际情况进行选择。
二、兔抗血小板及其外膜蛋白复合物(OMPC)多克隆抗体的制备与检测
一、兔抗血小板及其外膜蛋白复合物多克隆抗体的制备
1、免疫日本大耳白兔
1)基础免疫
取PRP用洗涤缓冲液TEGS在4℃Heraeus Biofuge离心机(德国Heraeus公司)上3500rpm 15min充分洗涤5次，尽量去除血浆成分、纤维蛋白和红细胞，取出其中一部分用pH 7.4的PBS调整血小板浓度为1×109个/mL和1×108个/mL各1.5mL，另取两管用TritonX-100裂解法制备OMPC，用pH 7.4的PBS调整裂解上清的蛋白浓度为2mg/mL和4mg/mL各1.5mL。将上述血小板悬液与OMPC蛋白液分别与福氏完全佐剂混匀，充分乳化，成“油包水”样，直到滴入冷水中不散开即可。取4只日本大耳白兔(2-2.5kg/只)，分两组(每组两只)，每组分别注射血小板悬液与含OMPC的蛋白溶液，每只兔子采用背部4点、3点/后肢，共计10点行皮内注射，每点0.2mL。
2)加强免疫
两周后，取步骤1)的血小板悬液和OMPC蛋白液分别与等体积的福氏不完全佐剂充分混合，成乳油状，按步骤1)的剂量和部位进行注射免疫。再两周后，进行第二次加强免疫，方法同前。
2、试血
二次加强免疫后两周，取兔耳静脉血2mL，分离血清，用间接ELISA方法(用纯化的多抗包板，酶标抗抗体为HRP标记的羊抗人IgG(北京中山试剂公司)检测血清抗血小板多抗效价，经检测效价大于20000，达到要求，用下述方法采血并用ELISA法检测血小板抗体及其效价测定。
3、采血
将兔子仰卧，固定于兔台上，用30mL玻璃注射器进行心脏穿刺抽血，将血液置室温下凝固约1h，然后置4℃放置12-24h，使血块收缩，再在4℃下3500rpm离心30min，分离血清，分装后-80℃贮存。
4、ELISA法检测血小板抗体及其效价测定
1)包被：每孔中加入0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)90uL，加血小板悬液样品10uL，空白对照孔加血小板悬浮缓冲液TEGS 10uL，4℃12-24h，然后用平板离心机2000r/min离心20min后，倒去孔内液体，加入0.25％戊二醛液50μL/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗涤液洗3次(每次3min)，加5％小牛血清白蛋白液(Sigma)，200mL/孔，经37℃30min或4℃12-24h封闭后弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗板3次，每次5min。
2)加样：取990uL抗体稀释液(在PBST的基础上加等体积甘油，0.5％的叠氮钠，1％BSA)和10ul硫酸铵从步骤3所采集的免疫血清中纯化的抗体，至蛋白浓度为1ug/mL，混匀；若测定效价则需将血清标本倍比稀释(1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶102400、1∶204800、1∶409600)，取上述经稀释的抗体100uL(每孔)加入已包被的反应孔中，置37℃温育1h，充分洗涤。
3)加酶标抗抗体：2ul HRP-羊抗兔抗体(北京中山试剂公司)加到998ul抗体稀释液中(即1∶2000倍稀释)，每孔加入100ul，温育0.5-1h，充分洗涤。
4)加底物显色液：每孔加入100ul TMB，室温静置10-20min，观察颜色变化。
5)终止反应：各反应孔中加入2M H2SO4 0.05mL，终止显色反应。
6)测定：用显色剂TMB显色，在450nm测OD值。
结果OD450nm值为409600，表明产生的抗体效价很高，符合要求。
三、血小板膜抗原复合物(OMPC)免疫家兔获得的多克隆抗体的纯化
依次用33％饱和硫酸铵和蛋白G柱对多抗进行纯化，具体过程如下：
1、用33％饱和硫酸铵粗提纯
透析袋的处理：将透析袋放入含2％(w/v)碳酸氢钠的1mmol/L EDTA(pH 8.0)液中煮沸10min，冷却后用蒸馏水洗至pH 7.0，再放入1mmol/L EDTA(pH 8.0)液中煮沸10min，用蒸馏水和去离子水彻底洗净，检查无渗漏后备用。
将步骤二获得的兔抗血小板膜抗原复合物血清4℃、3000rpm离心30min，将上清移至一洁净小烧杯中，在小烧杯外面套一大烧杯进行冰浴，同时加以磁力搅拌缓慢滴加1/2体积的33％饱和硫酸铵，4℃放置12-24h，再4℃、3000rpm离心30min，将上清移至另一洁净小烧杯中，外面套一大烧杯进行冰浴，同时加以磁力搅拌缓慢滴加等体积的33％饱和硫酸铵，4℃放置12-24h后，4℃、000rpm离心30min后，弃上清，用0.3-0.5倍原体积的PBS液溶解沉淀，将溶解的沉淀物装入已处理好的透析袋中(分子量1万的PEG袋)，在4℃下用0.01M pH7.4的PBS透析除盐24小时，中间更换透析液2-3次，最后收集经透析处理的溶液，分装于EP管中，-20℃保存。
2、蛋白G柱纯化
0.02M Pb液(pH 7.0)：57.7mL 1mol/L Na2HPO4和42.3mL 1mol/L NaH2PO4混合后稀释5倍获得。
0.1M甘氨酸-HCL(pH 2.7)：将7.507g甘氨酸溶解于800mL H2O中，用浓盐酸调pH值至2.7，混合后加水定容至11。
1M Tris-HCl(pH 8.0)：将121g Tris碱溶解于800mL H2O中，用浓盐酸调pH 8.0值至8.0，混合后加水定容至1L。
对步骤1经透析进行粗纯化的多抗，用蛋白G柱做进一步纯化，具体过程包括如下步骤：
1)把蛋白G柱安装到AKTA蛋白纯化仪上，连接好管路，用280nm波长紫外光检测蛋白纯化过程。
2)用10倍以上柱体积的超纯水清洗管路及蛋白G柱。
3)用20mM pH7.0的PB上样缓冲液平衡蛋白G柱，观察紫外监测线的数量，连续平衡至紫外监测线走平至少3倍柱体积。
4)用注射器从加样环将已用硫酸铵沉淀好的抗体溶液加入纯化仪管路内，继续走PB，注意见上样峰后收集流出液于含200ul pH8.0的1M Tris-HCl的试管中混匀。
5)观察紫外监测线，待上样峰结束，紫外监测线平直后，继续用3倍柱体积量的上样缓冲液PB冲洗，换上100mM pH2.7的甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱，见洗脱峰即收集流出液于含200ul pH8.0的1M Tris-HCl的试管中混匀，得到纯化的多抗。
实施例2、检测患者血小板抗体和交叉配型的ELISA方法的建立及条件优化
一、最适血小板悬液浓度的确定
采用方阵法滴定确定血小板悬液最适浓度，具体方法包括如下步骤：
1)用包被液将血小板作一系列稀释(1×108-5×108个/mL血小板)，每孔加入100ul血小板悬液进行包被，用5％BSA进行封闭，再洗涤3次；
2)选择强阳性(20ug/mL)、弱阳性(2ug/mL)的实施例1经纯化的血小板膜抗原复合物免疫家兔获得的多抗以及免疫前兔血清作为阴性对照各一份，用抗体稀释液分别作1∶100稀释，加样、温育(室温2h)后，洗涤3次；
3)加入浓度为1ug/mL的羊抗兔酶标二抗(北京中山试剂公司)，再次温育、洗涤；
4)加底物TMB显色，在相同的条件下测定OD450值，并绘制标准曲线；
5)选择强阳性血清的OD450值为0.8左右，阴性对照OD450值小于0.1的抗原稀释度作为最适工作浓度。根据表1的检测结果，选择血小板悬液最佳浓度为2×108个/mL，每孔加100ul，即相当于每孔加样量为2×107个血小板。针对临床患者血小板计数可能很低，至少需采血10mL。
表1 ELISA检测血小板悬液最适工作浓度的选择
| 参考血清 | 血小板悬液浓度(个/mL) | ||||
| 1×107 | 2×107 | 3×107 | 4×107 | 5×107 | |
| 强阳性 | 0.642 | 0.825 | 1.132 | 1.351 | 1.874 |
| 弱阳性 | 0.276 | 0.339 | 0.448 | 0.516 | 0.713 |
| 阴性 | 0.090 | 0.095 | 0.064 | 0.088 | 0.093 |
| 稀释液 | 0.039 | 0.042 | 0.041 | 0.036 | 0.053 |
注：表内数字为OD450值
二、最佳抗体包被用量及包被缓冲液的确定
血小板膜抗原复合物免疫家兔获得的多抗的包被量对检测方法的准确性和灵敏度至关重要，因此进行以下实验确定最佳抗体包被用量，具体方法为：以2×107个/mL血小板每孔包板，选择1、2、4、6、8、10、12、14、16、18ug/mL抗体浓度，每孔加100ul抗体进行检测，终止反应后测450nm OD值，将测得不同稀释度的样本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N)，若P/N大于或等于2.0为阳性。选择OD值最大而抗体用量最少的浓度。根据U型板的检测结果(表2)，绘制的不同抗体浓度与OD值关系曲线图如图2所示，随着抗体浓度增大，OD值随之增大，当抗体浓度为6-14μg/mL时，OD值较高，但经统计学处理，6-14μg/mL之间的OD值差异无统计学意义(P＞0.05)，而与1-4μg/mL的OD值差异有显著意义(P＜0.05)。当抗体包被浓度大于16μg/mL时，OD值反而下降，因此确定抗体最适浓度为6μg/mL，每孔加0.1mL为包被抗体的最佳浓度。
表2 最佳抗体包被浓度的确定
| 样本号 | 空白 | 阴性 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 |
| OD450值 | 0.054 | 0.093 | 0.156 | 0.369 | 0.582 | 2.111 | 2.111 | 2.468 | 2.633 | 2.659 | 2.107 | 2098 |
三、最佳检测方法的确定
确定多抗的包被程序：
用0.05M H9.6碳酸盐包被缓冲液稀释抗体至6μg/mL，每孔中加入100ul，4℃过夜，2000r/min平板离心机离心20min后，倒去孔内液体，然后加入0.75％戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，弃去戊二醛，用洗涤液洗5次，加含50％甘油的PBS缓冲液，200ml/孔，经37℃30min或4℃12-24小时封后弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗板5次，封闭、洗涤后冷冻干燥或风干后抽真空保存。
检测方式分为直接法和间接法，具体描述如下：
1)直接法：直接检测患者血小板上是否已经被自身抗体致敏
取患者血小板悬液，用TEN洗涤后配成10×109/L浓度，以终浓度为1％的TritonX-100在4℃破碎裂解，取上清液备用，每孔加入100ul，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，各孔分别加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶2000倍稀释)100ul，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，每孔加入显色剂A、B各50ul，显色15min，加入2M硫酸终止液，450nm读取吸光度OD值。
2)间接法：检测患者血清中是否有抗血小板自身抗体
一步法：取氯奎处理前后的OMPC 100ul和患者血清10ul+90ul样本稀释液分别加入U型反应板，同时设空白一孔、阴阳性对照各两孔，其中阴性对照孔加入正常的AB血清，阳性孔加入抗体阳性血清，(设PAIgG和PSIgG各一孔)，37℃温育60min，洗板机洗涤5次，各孔分别加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶2000倍稀释)100ul，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，每孔加入显色剂A、B各50ul，显色15min，加入2M硫酸终止液，450nm读取吸光度OD值。
两步法：取氯奎处理前后的OMPC各100ul分别加入U型反应板，同时设空白一孔、阴阳性对照各两孔，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，其中阴性对照孔加入正常的AB血清，阳性孔加入抗体阳性血清，(设PAIgG和PSIgG各一孔)，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，各孔分别加入HRP标记的羊抗人IgG(1∶2000倍稀释)100ul，37℃温育30min，洗板机洗涤5次，每孔加入显色剂A、B各50ul，显色15min，加入2M硫酸终止液，450nm读取吸光度OD值。
cutoff值的确立＝0.13×P+N，标本OD值(P)与阴性对照OD值(N)比(P/N)，若P/N大于或等于2.0为阳性。
实验证明，上述检测方法中，各步反应时间以30-40min为宜，延长反应时间则本底升高(阴性本底的OD值大于0.1)，非特异性吸附增多。
实施例3、ELISA间接法用于检测BPC抗体的特异性验证实验
1、为验证ELISA间接法用于检测BPC抗体的特异性，现进行特异性吸收试验。具体方法为：选用8份ITP血清500ul，加等量BPC悬液(分离出的血小板悬液用TEGS调整浓度至1×109/L)，混匀置37℃半小时，再置4℃2-24h，吸收后离心取上清液按上述实验条件和方法进行ELISA测定，结果如表3所示：
表3 特异性吸收抑制试验结果
| 8份阳性血清的OD值 | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| 未吸收吸收后抑制结果 | 1.5881.366+ | 1.2300.980+ | 1.2200.917+ | 1.5551.048+ | 1.4201.039+ | 1.3841.039+ | 1.3540.998+ | 1.2660.677+ |
从表3结果表明，阳性血清经吸收1次后，OD值均较吸收前下降，特别8号血清前后相比下降了50％，由此均显示特异吸收抑制试验阳性，证明该8份阳性血清的抗BPC抗体是特异的。
2、为了探索所建立的ELISA间接法检测抗BPC抗体的敏感度，选择8份抗BPC阳性血清，分别进行倍比稀释，按上述实验条件和方法进行ELISA检测效价，同时与流式细胞仪检测结果进行比较，
3、批内误差
将4份阳性血清标本在同一块板上按上述方法重复进行9次ELISA试验，计算各份标本检测OD值结果的变异系数(表4)。
表4 4份阳性血清重复9次ELISA检测(x)
| 阳性血清号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| xSDSV(％) | 0.5100.0285.6 | 0.3940.0328.1 | 0.4160.0307.19 | 0.2070.0146.57 |
表3数据表明，批内误差范围是5.5％-8.1％，平均为6.87％，证明按上述实验条件建立的检测血小板抗体的间接法ELISA的稳定性好，重复性佳。
4、批间误差
将5份阳性血清，按上述方法及实验条件在1周内重复进行3次ELISA，计算各份标本检测OD值结果的变异系数(表5)。结果指出三批阳性标本的变异系数在0.74％-8.12％之间，平均4.67％，由此亦显示按上述实条件建立的检测血小板抗体的间接法ELISA重复性和稳定性均良好。
表5 5份阳性血清标本进行ELISA的批间误差试验结果
| 标本号 | 分批检测阳性血清的OD值 | X | SD | SV(％) | ||
| 1 | 2 | 3 | ||||
| 12345 | 1.2661.1081.2091.0601.112 | 1.1211.0211.0281.1421.096 | 1.2071.1011.1251.1351.107 | 1.1981.1121.1211.1121.105 | 0.0730.0490.0910.0450.008 | 6.094.368.124.040.74 |
Claims (9)
1、一种患者血小板抗体和交叉配型的酶联免疫检测方法，由以下步骤组成：1)以血小板膜抗原复合物免疫动物获得的多克隆抗体进行包被并进行封闭；2)洗板；3)依次加入患者样本或对照和酶标动物抗人抗体；4)洗板；5)加底物显色和终止反应。
2、根据权利要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述步骤3)中患者样本为患者血小板OMPC，对照为正常血小板OMPC、血小板相关抗体阳性OMPC和血小板特异性抗体阳性OMPC。
3、根据权利要求2所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述患者血小板OMPC的浓度为1.5-2.5mg/mL。
4、根据权利要求1所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述步骤3)中患者样本为患者血清，对照为正常血清、血小板相关抗体阳性血清和血小板特异性抗体阳性血清。
5、根据权利要求4所述的酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于：所述步骤3)中患者血清的量为8-12ul。
6、根据权利要求1-5任一项所述的酶联免疫检测方法，其特征在于：所述步骤1)中用于包被的多克隆抗体的浓度为1-20μg/mL。
7、根据权利要求6所述的酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于：所述步骤1)中用于包被的多克隆抗体的浓度为6μg/mL。
8、根据权利要求1-5任一项所述的酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于：所述步骤1)中包被后用甘油或5％BSA进行封闭。
9、根据权利要求1-5任一项所述的酶联免疫吸附剂测定法，其特征在于：所述每个步骤的反应时间为30-40min。
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|---|---|---|---|---|
| CN108508217A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-09-07 | 北京博奥森生物技术有限公司 | 一种用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒及其应用 |
| CN116449030A (zh) * | 2023-06-12 | 2023-07-18 | 天津德祥生物技术股份有限公司 | 一种血小板交叉配型的方法 |
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- 2005-12-12 CN CN 200510130093 patent/CN1793928A/zh active Pending
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