CN102707045A - 一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，所述的试剂盒由带有微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，环丙沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液；检测方法是：取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。

Description

一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法
技术领域
一种快速高效检测食品中抗生素环丙沙星的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，主要用于食品中环丙沙星含量的检测。
背景技术
食品安全检测作为保障食品安全的重要手段，发挥着越来越重要的作用，食品安全检测技术的发展方向呈现两个趋势：一是实验室检测向设备日趋完善、痕量分析发展；另一个是向现场检测速测化，仪器便携化方向发展。食品安全检测中备受关注的检测物主要包括：微生物及其毒素，重金属以及农兽药残留等项目。研发高通量、快速、灵敏的农兽药检测试剂可谓当务之急。
目前农兽药残留的检测手段主要有：理化分析法、微生物法、免疫法。其中免疫学检测是农兽药残留检测的发展方向，它可以做到快速和特异性。酶联免疫吸附方法(ELISA法)已经逐步成为食品中农兽药残留检测的一种重要方法；国家兽药安全评价中心的初步调查，国内使用ELISA试剂盒作为兽药残留筛选的检测样本数量远远超过微生物方法和理化分析方法。
免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效快速检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，主要用于食品检测行业中环丙沙星含量的检测。
本发明的技术方案是：该检测环丙沙星的试剂盒是由96微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，酶标记的环丙沙星抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述的环丙沙星酶标抗原，是用EDC法以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLX合成酶标抗原(CPLX-HRP)，并利用紫外分光光度计进行鉴定。
所述的环丙沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，环丙沙星浓度分别为：0ug/L，1ug/L，2.5ug/L，10ug/L，200ug/L。
所述的抗环丙沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的环丙沙星半抗原是将环丙沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。
一种用所述的试剂盒检测环丙沙星的方法，它是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
本发明优选的检测环丙沙星的方法是：取包被有抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入100ul环丙沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标环丙沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
本发明所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括：样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用。
本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，组成成分少、使用方便、廉价、灵敏度高，其中前处理时间为0.5小时以内；检测时间为0.5小时。
酶联免疫检测试剂盒的全面评估：而本方法可以用0.5小时结束试验。其中前处理时间为0.5小时。优于质谱等方法的处理时间。
酶联免疫检测试剂盒的结果：
6.1.1标准曲线绘制：
(1)竞争法测不同浓度诺氟沙星标准品溶液(0～1000ug/L)，初步确定线性范围1～200ug/L
  浓度(ug/L)   1号   2号   平均值   LN
  0   2.144   2.231   2.188
  0.01   2.183   2.272   2.227   -4.60517
  0.05   2.157   2.245   2.201   -2.99573
  0.1   2.177   2.266   2.221   -2.30259
  0.5   2.158   2.246   2.202   -0.69315
  1   2.081   2.165   2.123   0
  10   1.536   1.5994   1.567   2.302585
  25   1.034   1.076   1.055   3.218876
  50   0.876   0.912   0.894   3.912023
  80   0.735   0.765   0.751   4.382027
  100   0.623   0.649   0.636   4.60517
  150   0.547   0.569   0.558   5.010635
  300   0.416   0.433   0.425   5.703782
  500   0.414   0.431   0.4225   6.214608
  1000   0.402   0.419   0.4105   6.907755
以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴制作而成的曲线图见图1所示。
(2)分别对0，1，2.5，10，50，200μg/L的CPLX标准品进行检测，每个浓度做3个平行，取平均值，计算其标准偏差和变异系数，结果如下：
以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴，做标准曲线，见图2所示。
附图说明
图1是本发明以标准品浓度自然对数为X轴、吸光值为Y轴制作而成的标准曲线图；
图2是本发明另一以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴制作而成的标准曲线图；
图3是本发明CPLX-BSA全抗原紫外扫描图；
图4是本发明CPLX-HRP全抗原紫外扫描图；
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的检测环丙沙星的试剂盒，它是由96微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，酶标记的环丙沙星抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
所述的环丙沙星酶标抗原，是用EDC法以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLX合成酶标抗原(CPLX-HRP)，并利用紫外分光光度计进行鉴定。
所述的环丙沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，环丙沙星浓度分别为：0ug/L，1ug/L，2.5ug/L，10ug/L，200ug/L。
所述的抗环丙沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的环丙沙星半抗原是将环丙沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。
一种用所述的试剂盒检测环丙沙星的方法，它是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
本发明优选的检测环丙沙星的方法是：取包被有抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入100ul环丙沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标环丙沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
本发明所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括：样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用。
实施例：
本发明所述的环丙沙星包被抗体：首先合成环丙沙星半抗原，环丙沙星半抗原与载体蛋白通过碳化二亚胺法得到的偶联物即全抗原，以此全抗原免疫新西兰兔，得到对环丙沙星特异性的抗体。
环丙沙星标准品，从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，环丙沙星浓度分别为：0ug/L，1ug/L，2.5ug/L，10ug/L，200ug/L。
环丙沙星酶标抗原：以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLC用EDC法合成酶标抗原CPLX-HRP。利用紫外分光光度计进行鉴定。
本发明主要采用高效快速的前处理方法并结合酶联免疫法(EIISA)来检测环丙沙星。采用的技术主要有几个方面：第一、特异性多克隆抗体的制备，第二，环丙沙星的酶标抗原的制备，第三，高效的样本前处理方法确认，第四，环丙沙星的直接法EIISA试剂盒的制备。
测定方法为：测定的基础是标记免疫反应。本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被CPLX-KLH的抗体。检测时，样本中的残留物环丙沙星与加入的酶标抗原CPLX-HRP竞争环丙沙星抗体，通过洗涤除去游离的抗体、酶标抗原及抗原抗体复合物，用TMB底物显色，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。样本吸光度值与其所含环丙沙星的含量成负相关，根据标准曲线，可计算出残留物环丙沙星的含量。
具体操作程序：
(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟。
(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液。
(3)取出需要数量的微孔板，每个标准品和样本做2个平行，并记录标准孔和样本孔的位置。
(4)每孔加入250μL洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤1次。
(5)每孔依次加入标准品和样品各50μL，每孔再加入配制好的酶标抗原工作液各50μL，充分混匀1min，37℃反应30min。
(6)取出反应板，每孔加入250μL洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤3次。
(7)每孔加入显色液A液和B液各50uL，避光37℃显色15min。
(8)每孔加入终止液各50uL，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值。
样品前处理方法的确定：
样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用。
实施例1、制备试剂盒所需的包被抗体和酶标抗原
1.免疫抗原和酶标抗原的合成
分别合成CPLX-KLH及CPLX-HRP全抗原，且CPLX-KLH作为免疫原免疫新西兰兔，并得到特异性抗体。
1.1环丙沙星分子结构分析和抗原合成
环丙沙星分子式C18H20FN3O4，结构式为：
Figure BDA00001604979500061
由于环丙沙星带有羧基，所以可以用EDC法合成全抗原，现举例环丙沙星(CPLX)反应步骤如下：
(1)将1.5mg环丙沙星、2.6mgEDC和4.3mgNHS分别溶于1ml、0.5ml和0.5ml DMF，然后将EDC溶液和NHS溶液逐滴加入CPLX溶液并混匀，室温避光下轻微震荡24小时，得到A液；
(2)10mgBSA(或HRP)溶解于5ml PBS得到B液；
(3)将A液缓慢滴加于B液，避光震荡反应6小时；
(4)待反应完成后，将反应液装入透析袋，用磷酸缓冲液(10mM pH7.4)透析5次，得到环丙沙星全抗原；
(5)采用紫外扫描测定环丙沙星与载体蛋白BSA(或HRP)的偶联比，最后将全抗原进行冷冻干燥，置于-20℃保存。
1.2对合成的全抗原性质进行分析
通过光谱扫描法对合成的CPLX-BSA和CPLX-HRP全抗原进行性质鉴定(图3、图4)。
如图3，曲线1为CPLX的扫描图，峰值在285.5nm；曲线2为CPLX-BSA扫描图，峰值在275.5nm；曲线3为BSA扫描图，峰值在278nm。
如图4，曲线1为CPLX-HRP的扫描图，峰值在277nm；曲线2为CPLX扫描图，峰值在285.5nm；曲线3为HRP扫描图，峰值在280nm。合成全抗原的峰位相对载体蛋白，峰值变小了，表明CPLX与载体蛋白已经偶联成功。CPLX与载体蛋白的分子偶联比可通过朗伯-比尔定律计算得出。从光谱扫描图中可见，载体蛋白和全抗原扫描峰发生变化，初步证实此CPLX-KLH全抗原偶联成功。FeCl3显色反应试验也表明，偶联合成成功。
通过光谱扫描法对合成的CPLX-HRP全抗原进行性质鉴定(图4)，曲线1为CPLX-HRP的扫描图，峰位在278.5nm；曲线2为CPLX扫描图，峰位在302.5nm；曲线3为HRP扫描图，峰位在280.5nm。合成全抗原的峰位相对载体蛋白，峰位变小了，表明CPLX与HRP已经偶联成功。
2.兔源性CPLX多克隆抗体的制备
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
2.1准备两只成年兔，体重1.5-2.0公斤，免疫前取3-5ml血清作为对照。按每只兔子0.5mgCPLX-BSA的量溶于0.5ml磷酸缓冲液，然后与等体积弗氏完全佐剂混合，震荡使之充分乳化。在兔背部脊柱两侧不同部位进行皮下注射抗原溶液。
2.2按照0周～2周～4周～8周～10周的间隔进行免疫，在注射后的7天-10天进行血液收集。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
2.3收集血液：在兔颈动脉处插管进行血液收集，将血液在37℃恒温箱中放置30分钟，再在4℃放置过夜。将血液转移至塑料离心管中，4℃，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，-20℃保存。
2.4抗体的纯化
CPLX的抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化。硫酸铵沉淀法法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
实施事例环丙沙星检测试剂盒前处理方法实验
实施事例2样品前处理方法的确定
样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用。
本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，组成成分少、使用方便、廉价、灵敏度高，其中前处理时间为0.5小时以内；检测时间为0.5小时。
在确保是阴性的条件下，猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋样品的前处理方法结果。
Figure BDA00001604979500081
实施事例3环丙沙星酶联免疫检测试剂盒的设计与及全面评估
1.CPLX试剂盒测定原理
本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被CPLX-KLH的抗体。检测时，样本中的残留物环丙沙星与加入的酶标抗原CPLX-HRP竞争环丙沙星抗体，通过洗涤除去游离的抗体、酶标抗原及抗原抗体复合物，用TMB底物显色，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。样本吸光度值与其所含环丙沙星的含量成负相关，根据标准曲线，可计算出残留物环丙沙星的含量。
2.组成成分
(1)包被液：0.1M的PH9.6的碳酸氢钠。
(2)PBS缓冲液：氯化钠8.5g，12水磷酸氢二钠5.54g，2水磷酸二氢钠0.39g，PH7.2，定容到1L。
(3)洗液：0.05％PBS-TWEEN20。
(4)封闭液：1％的明胶或1％的BSA。
(5)显色液A：配PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，在5mL缓冲液10μL30％的H2O2。
(6)显色液B：先将10mgTMB溶于2mLDMSO，在加PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液5mL+3mgTMB。
(7)终止液：2M硫酸
3.具体操作
(1)实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟。
(2)配制酶标抗原工作液和洗板工作液。
(3)取出需要数量的微孔板，每个标准品和样本做2个平行，并记录标准孔和样本孔的位置。
(4)每孔加入250μL洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤1次。
(5)每孔依次加入标准品和样品各50μL，每孔再加入配制好的酶标抗原工作液各50μL，充分混匀1min，37℃反应30min。
(6)取出反应板，每孔加入250μL洗板工作液，轻轻震荡下，放置1min，倒掉洗液拍干，洗涤3次。
(7)每孔加入显色液A液和B液各50uL，避光37℃显色15min。
(8)每孔加入终止液各50uL，用酶标仪在波长450nm/630nm处读取吸光度值。
(9)15min内用酶标仪在450nm/630nm下读取OD值。
(10)根据标准曲线计算样品中CPLX浓度。
4.CPLX酶联免疫检测试剂盒的结果：
4.1标准曲线绘制：竞争法测不同浓度环丙沙星标准品溶液(0～1000ug/L)，6.酶联免疫检测试剂盒的全面评估：
6.1CPLX酶联免疫检测试剂盒的结果：
6.1.1标准曲线绘制：
(1)竞争法测不同浓度诺氟沙星标准品溶液(0～1000ug/L)，初步确定线性范围1～200ug/L
  浓度(ug/L)   1号   2号   平均值   LN
  0   2.144   2.231   2.188
  0.01   2.183   2.272   2.227   -4.60517
  0.05   2.157   2.245   2.201   -2.99573
  0.1   2.177   2.266   2.221   -2.30259
  0.5   2.158   2.246   2.202   -0.69315
  1   2.081   2.165   2.123   0
  10   1.536   1.5994   1.567   2.302585
  25   1.034   1.076   1.055   3.218876
  50   0.876   0.912   0.894   3.912023
  80   0.735   0.765   0.751   4.382027
  100   0.623   0.649   0.636   4.60517
  150   0.547   0.569   0.558   5.010635
  300   0.416   0.433   0.425   5.703782
  500   0.414   0.431   0.4225   6.214608
  1000   0.402   0.419   0.4105   6.907755
以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴，制作标准曲线，见图1所示。
(2)分别对0，1，2.5，10，50，200μg/L的CPLX标准品进行检测，每个浓度做3个平行，取平均值，计算其标准偏差和变异系数，结果如下：
Figure BDA00001604979500101
以标准品浓度自然对数为X轴，吸光值为Y轴，做标准曲线，见图2所示
6.2精密度实验：
选取IC50附近的浓度5μg/L和10μg/L分别进行20孔平行测定，进行精密度计算，结果如下：
Figure BDA00001604979500102
6.3特异性实验：
采用竞争法检测环丙沙星及其它氟喹诺酮类的IC50，计算方法为：环丙沙星的IC50除以其它氟喹诺酮类的IC50，交叉反应率(如下表)，说明环丙沙星抗体对环丙沙星检测的特异性较高，与其他氟喹诺酮类交叉反应率都比较低，可以忽略。
  项目   IC50   交叉反应率(％)
  环丙沙星   8.69   100
  氧氟沙星   1000   0.87
  恩诺沙星   2500   0.35
  洛美沙星   1500   0.58
  诺氟沙星   2000   0.43
  氯霉素   2500   0.35
6.4添加回收实验：
6.4.1猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋的添加回收实验
样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，分别进行CPLX终浓度为1μg/L，10μg/L，50μg/L，200μg/L不同浓度进行添加，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用，进行检测。
(1)猪肉的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.0735   -
  1   0.848   84.8％
  10   9.785   98.8％
  50   45.85   91.7％
  200   198.4   99.2％
(2)猪肝的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.088   -
  1   1.015   101.5％
  10   11.699   116.9％
  50   54.85   109.7％
  200   237.2   118.6％
(3)虾的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.079   -
  1   0.923   92.3％
  10   10.629   103.3％
  50   49.85   99.7％
  200   215.4   107.7％
(4)鱼的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.0728   -
  1   0.943   94.3％
  10   9.576   95.8％
  50   44.9   89.8％
  200   211.5   105.5％
(5)甲鱼的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.078   -
  1   1.007   100.7％
  10   10.291   102.9％
  50   48.25   96.5％
  200   208.6   104.3％
(6)鸡肉的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.100   -
  1   1.157   115.7％
  10   11.324   113.2％
  50   57.45   114.9％
  200   220.2   110.1％
(7)鸡蛋的添加回收实验：
  添加浓度(μg/L)   测定值(μg/L)   回收率(％)
  0   0.103   -
  1   1.187   118.7％
  10   11.679   116.8％
  50   51.65   103.3％
  200   227.4   113.7％
6.4.1结果分析
对猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这7种样本进行了CPLX不同浓度的添加，各浓度的回收率均在80～120％之间，具有较好的回收率，能广泛用于实际工作中。

Claims (7)

1.一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于：它由带有微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，环丙沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星酶标抗原，是用EDC法以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLX合成酶标抗原(CPLX-HRP)，并利用紫外分光光度计进行鉴定。
3.根据权利要求1所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，环丙沙星浓度分别为：0ug/L，1ug/L，2.5ug/L，10ug/L，200ug/L。
4.根据权利要求1所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的抗环丙沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的环丙沙星半抗原是将环丙沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。
5.一种用权利要求1所述的试剂盒检测环丙沙星的方法，其特征是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
6.根据权利要求5所述的检测环丙沙星的方法，其特征在于：它是取包被有抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤1次，加入100ul环丙沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标环丙沙星抗原，震荡混匀，37℃孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37℃孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
7.根据权利要求5或6所述的检测环丙沙星的方法，其特征在于所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括：样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50℃氮气吹干。加1ml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取1.5ml左右下层液于离心管中备用。
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