CN102735679B - 醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种醛固酮ALD化学发光免疫定量检测试剂盒，本发明试剂盒包含ALD抗体包被板、ALD酶结合物、ALD校准品、ALD质控品、发光液A液和B液、20倍浓缩洗液。制备本发明试剂盒包含以下步骤：1）ALD抗体包被板的制备；2）ALD酶结合物的制备；3）配制不同浓度的ALD校准品；4）ALD质控品的制备；5）配制发光液A液和B液；6)配制20倍浓缩洗液；7）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；7）对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简单，灵敏度高，特异性好。

Description

醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的涉及醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

高血压(Hypertension)是一种世界性的常见疾病，世界各地的患病率高达10％～20％，并可导致脑血管、心脏、肾脏的病变，是危害人类健康的主要疾病。据卫生部最新数据，我国现有高血压患者2亿多人，随着经济发展，人民生活水平的提高，高血压已日益成为一个重要的公共卫生问题。

醛固酮(aldosterone，ALD)是肾上腺皮质激素的一种，具有代表性的强电解质代谢作用的盐皮质类固醇。其作用是保钠排钾(增加Na⁺和Cl^-的回放，排出K⁺和H⁺)、维持电解质平衡与体液容量恒定。ALD是由肾上腺皮质球状带生成，并受肾脏分泌的血管紧张肽原酶，即血管紧张素的调节。

醛固酮是人体内调节血容量的激素，通过调节肾脏对钠的重吸收，维持水平衡。醛固酮是调节细胞外液容量和电解质的激素，醛固酮的分泌，是通过肾素-血管紧张素系统实现的。当细胞外液容量下降时，刺激肾小球旁细胞分泌肾素，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，醛固酮分泌增加，使肾脏重吸收钠增加，进而引起水重吸收增加，细胞外液容量增多；相反，细胞外液容量增多时，通过上述相反的机制，使醛固酮分泌减少，肾重吸收钠水减少，细胞外液容量下降。血钠降低，血钾升高同样刺激肾上腺皮质，使醛固酮分泌增加。

血浆中ALD水平的检测，对于原发性醛固酮增多症的诊断和疗效观察、Addisons病(阿狄森氏病又称原发性慢性肾上腺皮质机能减退症)的诊断及肾上腺皮质增生、继发性醛固酮增多症等的鉴别诊断有临床价值。

目前临床上常用的测定醛固酮(ALD)的方法是放射免疫分析技术(RIA)和酶联免疫分析法(ELISA)，但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，例如时间分辨免疫分析法、免疫荧光法、化学发光法等。其中，化学发光免疫分析(CLIA)是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，起步于80年代初，在90年代得到了快速发展和应用，是当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高(检测极限10^-17～10^-19)、可测定物质浓度范围宽、试剂有效期长、操作简单快速、稳定性好、安全无环境污染等优点，目前已广泛应用到基础和临床医学的各个领域，成为取代RIA和ELISA的首选技术。但目前使用的化学发光免疫分析(CLIA)测定醛固酮(ALD)的灵敏度普遍低，而且测定范围较窄。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，解决了灵敏度低，检测范围窄的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，包含：

ALD抗体包被板；

ALD酶结合物；

ALD校准品；

ALD质控品；

发光液A和发光液B；

20倍浓缩洗液。

其中，所述的ALD抗体包被板的固相载体为96孔或48孔的白色微孔板；所述的ALD酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶。所述的ALD质控品包括低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其中低值质控品的浓度范围是124.93～187.39pg/mL，高值质控品的浓度范围是1640.33～2460.50pg/mL。所述的发光液A包含0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚；发光液B包含0.675g/L过氧化脲；所述的20倍浓缩洗液包含75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/L Proclin300。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包含以下步骤：

1)ALD抗体包被板制备；

包被板制备包括以下步骤：

a将ALD抗体用0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到固相载体中，2～8℃包被20～24小时；

b弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；

c弃去孔内液体，甩干后于30～37℃烘干16～30小时；

d装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。

2)用辣根过氧化物酶标记ALD，得ALD酶结合物；

ALD酶结合物的制备包括以下步骤：

a将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5m mol/L和2m mol/L，在沸水浴中反应90min；

b浓缩后，加入40mL水，用乙醚抽提，抽提物用Na2SO4干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；

c将EDC溶解在pH8.0的PBS缓冲液中，得I液；

d将HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；

e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01MPBS使之充分透析。

3)配制不同浓度的ALD校准品：将ALD用校准品稀释液稀释成不同浓度的校准品，浓度分别为0，40，120，360，1000，3000pg/mL；

4)质控品的配制：在正常人血清中加入适量的ALD纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为156.16pg/mL和2050.41pg/mL。

5)配制发光液A，发光液B；

6)配制20倍浓缩洗液；

7)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

辣根过氧化物酶(HRP)纯度要求RZ≥3.0，活性≥250U/mL。

根据本发明的方法，ALD抗体包被板是包被含有ALD抗体的96孔或48孔的白色微孔板；所述的ALD酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶；所述的发光液A包含鲁米诺和对碘酚，发光液B包含过氧化脲。

本发明方法制备的试剂盒采用如下具体形式，其包含ALD抗体包被的96孔或48孔的白色微孔板、辣根过氧化物酶标记的ALD、不同浓度的ALD校准品、发光液A液为鲁米诺和对碘酚、发光液B液为过氧化脲、20倍浓缩洗液为配方为75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/LProclin300。

ProClin 300以其广谱活性、优越的兼容性和稳定性及其在使用浓度下的低毒性，ProClin 300成为用于诊断试剂的理想高效防腐剂。Proclin 300防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间。其水溶性确保其可轻易溶入所需试剂中。特别是，ProClin 300防腐对大多数的酶或抗体交联反应的功能无影响，所以不会干扰检验指示剂。

本发明的醛固酮(ALD)定量检测试剂盒，采用目前最为敏感的免疫测定方法——化学发光免疫分析技术，醛固酮(ALD)定量检测试剂盒(化学发光法)采用竞争法检测人血清、血浆中的醛固酮含量。样本加到固相含有ALD抗体的白色不透明的板条微孔中，再加入ALD-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，此酶结合物与样本中的ALD竞争结合固相ALD抗体。洗掉游离成分。加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5-15分钟测定各加样本孔的发光值RLU。样本的RLU与其中的ALD浓度呈负相关。样本中的ALD浓度依据由校准品ALD浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的ALD含量。

本发明具有以下优点：(1)本试剂盒利用化学发光免疫技术测定血浆样本。操作简便，适用于临床常规检测；(2)灵敏度高，分析灵敏度不高于15pg/mL；(3)本产品的特异性良好，本产品对血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅱ、血管紧张素1～7的交叉特异性均小于1％；(4)精密度良好，批内精密度不高于15％，批间精密度不高于20％；(5)稳定性良好，经37℃加速稳定性及2～8℃真实稳定性试验证实，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年；(6)特异性强，反应快速，可在65分钟内判断检测结果，操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、试剂有效期长、稳定性好等优点。性能优于RIA、Elisa产品，达到了国际先进水平，成本较低。

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定ALD与美国贝克曼库尔特有限公司的放免试剂盒测定ALD的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的ALD值，横坐标为放免试剂盒测定ALD值，两种方法相关系数(r)＝0.9719，直线方程y＝0.9761x+6.0824。

具体实施方式

实施例1：制备醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒

醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒，包含：

1)ALD抗体包被的96孔白色微孔板；

2)ALD-辣根过氧化物酶(HRP)结合物；

3)ALD校准品；

4)ALD质控品；

5)发光液A液和发光液B液，发光液A液包含鲁米诺和对碘酚，发光液B液包含过氧化脲；

6)20倍浓缩洗液的配方为75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/L Tween-20，1g/LProclin300，Proclin300选自美国sigma公司。

通过下述方法制备醛固酮(ALD)化学发光免疫定量检测试剂盒

1)包被：将ALD抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到96孔白色微孔板中，2～8℃包被20～24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；弃去孔内液体，甩干后于30～37℃烘干16～30小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。

2)ALD酶结合物的制备步骤如下：

a将O-(羧甲基)羟胺和ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2mmol/L，在沸水浴中反应90min；

b浓缩后，加入40mL水，用乙醚抽提，抽提物用Na₂SO₄干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；

c将EDC溶解在pH8.0的PBS缓冲液中，得I液；

d将HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；

e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01MPBS使之充分透析。

3)配制不同浓度的ALD校准品：将ALD用校准品稀释液稀释成不同浓度的校准品，浓度分别为0，40，120，360，1000，3000pg/mL；

4)质控品的配制：在正常人血清中加入适量的ALD纯品，配制低值质控品(QcL)和高值质控品(QcH)，其浓度的平均值分别为156.16pg/mL和2050.41pg/mL。

5)配制发光液A液和B液：

发光液A液包含0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚，缓冲液为5mmol/LTris·HCl(pH8.6)；B液包含0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制

6)配制20倍浓缩洗液：

按照下述配方配制浓缩洗液，75.5g/L Tris，120g/L NaCl，5mL/LTween-20，1g/L Proclin300。

7)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；其中包含发光液A、发光液B、20倍浓缩洗液、ALD酶结合物各1瓶，ALD抗体包被板1块，ALD校准品6瓶、ALD质控品2瓶。

8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，并对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

说明：

(1)物理检查：在外观上液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

(2)准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验，|t|<2.447)；以企业标准品为对照品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90～1.10范围内。

企业校准品的配制方法如下：将高纯度的醛固酮(ALD)用稀释液(含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)稀释为系列梯度，其浓度分别为40、120、360、1000、3000pg/mL，并以不含ALD的稀释液作为零值对照。

(3)剂量-反应曲线的线性：用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，剂量-反应曲线在0～3000pg/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

(4)分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于15pg/mL。

(5)精密度：批内不精密度(CV％)应不高于15.0％；批间不精密度(CV％)应不高于20.0％。

(6)质控品测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为124.92～187.39pg/mL和1640.33～2460.50pg/mL。

(7)特异性：交叉反应应符合下表要求。

(8)稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述要求。

实施例2：制备醛固酮化学发光免疫定量检测试剂盒

除固相载体为48孔的微孔板外，以与实施例1一样的方法制备本发明试剂盒。

实施例3：本发明试剂盒的使用方法

1)将本试剂盒从4℃冰箱中取出，在室温(18～25℃)下平衡30分钟。

2)配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释(1mL洗液加19mL蒸馏水)，若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

3)根据实验需要取出适量的包被板条。设置空白对照1孔，校准品各2孔、质控品各10孔。每孔分别加入ALD校准品、质控品和样品50μL，空白对照不加校准品、质控品和样本。

4)每孔加入ALD酶结合物50μL，空白对照孔除外。

5)手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应60分钟。

6)揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。

7)每孔加入发光液100μL(发光液A和B在使用前5min按等体积混合)，包含空白对照孔。

8)室温(18～25℃)暗置5分钟，在化学发光免疫分析仪上测定发光值。

实施例4本试剂盒临床试验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验选取110例临床样本，先以美国贝克曼库尔特有限公司生产的醛固酮放免药盒测试后，再用本专利发明的试剂盒(化学发光法)进行测定，对其进行了配对t检验、线性相关分析及卡方检验并评价。结果证明，两者间测定值无显著性差异，并且线性相关性极佳，临床灵敏度为97.37％、特异性为98.61％、粗一致性为98.18％，在临床符合率方面有很好的一致性，本试剂盒对对ALD的测值有效，可推广临床应用。

为了确定本试剂盒的参考值，对天津市600份正常人血清、血浆样本采用本发明的试剂盒进行了测定，结果表明本试剂盒的正常参考值(参考范围)(2.5％～97.5％)为：

普食：卧位60～180pg/mL

      立位70～300pg/mL

低钠：卧位120～360pg/mL

      立位150～650pg/mL

实施例5将本发明试剂盒与国内外同类产品进行比较

表1 本产品与国内外同类产品的比较

从表1比较结果看出本试剂盒的成本低，灵敏度与ELISA和RIA相差不大，但其检测范围较ELISA宽，且可以有效地避免了RIA的放射性污染、标记物半衰期短、操作繁琐等缺点。

Claims (1)

1.一种醛固酮ALD化学发光免疫定量检测试剂盒的制备方法，所述的试剂盒包含醛固酮ALD抗体包被板；

醛固酮ALD酶结合物；

醛固酮ALD校准品；

醛固酮ALD质控品；

发光液A液和B液；

20倍浓缩洗液；

所述的醛固酮ALD抗体包被板是包被含有醛固酮ALD抗体的96孔或48孔的白色微孔板；所述的醛固酮ALD酶结合物使用的酶是辣根过氧化物酶，要求纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；醛固酮ALD质控品包括低值质控品和高值质控品，其中低值质控品的浓度是156.16pg/mL，高值质控品的浓度是2050.41pg/mL；所述的发光液A包含0.7g/L鲁米诺和0.165g/L对碘酚；发光液B包含0.675g/L过氧化脲；所述的20倍浓缩洗液包含75.5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween-20，1g/LProclin300；其特征在于包含以下步骤：1)醛固酮ALD抗体包被板制备；包被板的制备包含如下步骤：

a将醛固酮ALD抗体用0.02mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液稀释至1～10ug/mL，加入到固相载体中，2～8℃包被20～24小时；

b弃去孔内液体，用pH7.4PBS-T缓冲液洗板，然后加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2～8℃封闭20～24小时；

c弃去孔内液体，甩干后于30～37℃烘干16～30小时；

d装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃；

2)醛固酮ALD酶结合物的制备；所述的醛固酮ALD酶结合物的制备步骤如下：

a将O-(羧甲基)羟胺和醛固酮ALD溶解在乙醇中，使其浓度分别为5mmol/L和2m mol/L，在沸水浴中反应90min；

b浓缩后，加入40mL水，用乙醚抽提，抽提物用Na₂SO₄干燥，将其溶于0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，得II液；

c将EDC溶解在pH8.0的PBS中，得I液；

d将辣根过氧化物酶HRP溶于PH7.4的PBS缓冲液中，得III液；

e将II液与III液混合，然后逐滴加入I液，在4℃搅拌16小时，用0.01M磷酸缓冲盐溶液PBS使之充分透析；

3)配制不同浓度的醛固酮ALD校准品；

4)醛固酮ALD质控品的配制；

5)配制发光液A液和B液；

6)配制20倍浓缩洗液；

7)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；

8)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对其准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。