CN113388616B - 特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法 - Google Patents

特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法。本发明所述的特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明通过该核酸适配体制备的第一生物元件、氯化血红素‑聚乙二醇(PEG 5000)‑去铁胺的双功能共聚物以及Fe3+淬灭CDs组成的生物传感器，具有10‑107CFU/mL的宽检测范围和低至1CFU/mL的检测限，总时间成本降低，可实现幽门螺旋杆菌准确、超灵敏的检测。

Description

特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感 器及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法。
背景技术
核酸适配体(Aptamer)是一类通过指数富集配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment),从大容量的核酸文库中筛选获得能与靶分子高特异性,高亲和力结合的单链或序列。然而，用于SELEX常规程序中的Sanger测序由于其低通量性而使得大部分序列未被检测，因此筛选得到的适配体不具有真实代表性。相反，现代高通量测序技术(High-Throu-ghput Sequencing,HTS)能够以千兆字节为单位给出大量的数据，从而保证足够的序列覆盖率，从而能够在任何一轮SELEX中准确识别PCR产物中最丰富的序列，为适配体的筛选开辟了一条新的途径。但基于全细菌SELEX(Whole-bacteria SELEX,WB-SELEX)的微生物特异性适配体的研究中，几乎没有任何应用HTS的报道。
碳量子点(Carbon dots,CDs)是一种荧光纳米材料，它具有生物相容性高，低毒性，水溶性高，激发光谱宽，量子产率适中，耐光漂白，易于大规模合成，成本低等优点。碳量子点是一类新的高性能荧光剂，并且能够赋予适体传感器更高的灵敏度。由于CDs既可以作为电子供体，也可以作为电子受体，因此在相互作用时，它们的荧光可以通过电子转移被金属离子猝灭。因此，基于这一机制开发了许多用于检测金属离子的新型传感器。与“关闭”传感器相比，“开启”模式在以下方面具有优势:易于测量相对于“黑暗”背景的低浓度对比度，减少假阳性信号和增加灵敏度能解决荧光标记的生物传感器背景信号太强的问题。
幽门螺旋杆菌是一种螺旋形的革兰氏阴性人类病原菌，感染胃粘液层下。这种细菌的感染在病因学上与慢性胃炎、消化性溃疡、原发性胃B细胞淋巴瘤和胃癌有关。幽门螺旋杆菌对人类的威胁要求对这种病原体的感染进行准确有效的诊断，并随后从受感染的患者中彻底根除这种细菌。尽管如此，无症状分析和上消化道内镜检查对感染幽门螺旋杆菌的患者并不实用。在临床上，幽门螺旋杆菌的诊断主要依赖于13C尿素呼气试验。然而，该试验只能在药物治疗完成后至少4–8周进行，并且儿童和孕妇因其辐射而禁用。此外，由于敏感性和可接受性低，血清抗体测试和侵入性内窥镜检查也不适合儿童。从粪便样本中诊断幽门螺旋杆菌可能为这些问题提供有希望的解决方案。然而，目前的粪便抗原检测仍然存在一些假阴性结果，出现在细菌丰度低的情况下，以及最近在患者中使用PPI或抗生素的情况下。由于粪便样品是复杂的基质，所以仍在努力开发潜在的快速、精确和成本有效的幽门螺旋杆菌检测系统。值得注意的是，2019年开发了从人类粪便样本中进行幽门螺旋杆菌全细胞检测的技术，该技术充分利用了幽门螺旋杆菌单克隆抗体结合磁珠特异性捕获细菌细胞和幽门螺旋杆菌多克隆抗体结合荧光量子点探针以“三明治”模式进行转导的优势。然而，仍然需要一种更具成本效益和更高分辨率的生物传感器来代替在幽门螺旋杆菌检测中使用昂贵和耗时的抗体。
发明内容
发明目的：本发明提供了一种特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体。本发明还提供了核酸适配体的筛选方法以及基于该核酸适配体制备的第一生物元件。本发明进一步提供了用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器，并且提供了特异性结合幽门螺旋杆菌的共聚物以及用于提供检测信号的基于铁载体-铁离子的第三生物元件。本发明提供的生物传感器能够实现幽门螺旋杆菌检测。
技术方案：本发明第一方面提供了一种特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体，序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明第二方面提供了上述的核酸适配体在制备检测幽门螺旋杆菌的试剂、试剂盒或者生物传感器中的应用。
本发明第三方面提供了上述的核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
(1)构建随机文库，所述随机文库由顺序连接的5’端固定区域、随机区域、3’端固定区域组成；所述5’端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述3’端固定区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物对制备次级文库；以大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌为反筛选菌株，以幽门螺旋杆菌为正筛选菌株，交替进行正筛选、反筛选共计10次，筛选获得的ssDNA文库经测序后，选择丰度较高的核酸适配体，以大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌为目标，排除特异性较低的适配体，筛选获得特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体。
本发明提供的筛选方法能够快速准确的筛选出高特异性的适配体。作为本发明的一种具体实施方式，上述步骤(1)中，所述的随机文库的随机区域由40个核苷酸组成。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的随机区域中各碱基独立的选自A、T、C或G。
作为本发明的一种具体实施方式，步骤(2)中，所述筛选，第1～2轮为正筛选、第3轮为反筛选；第4～5轮为正筛选、第6轮为反筛选；第7～8轮为正筛选；第9轮为反筛选；第10轮为正筛选(即第1，2轮为正筛选、第3轮为反筛选；第4，5轮为正筛选；第6轮为反筛选；第7，8轮为正筛选；第9轮为反筛选；第10轮为正筛选)。
作为本发明的一种具体实施方式，将经过第10轮筛选的SSDNA文库进行测序，所述测序采用高通量测序技术，对筛选得到的文库进行全面分析，得到更可靠，更具代表性的适配体。
具体地，使用Illumina Hiseq 3000平台进行测序，产生1Gb的数据量。
所述筛选获得的核酸适配体(ssDNA文库)为第10轮筛选获得的ssDNA文库。
本发明第四方面提供了生物元件，具体包括第一生物元件、第二生物元件以及第三生物元件。
本发明所述的特异性捕获幽门螺旋杆菌的第一生物元件，所述第一生物元件包括核酸适配体修饰的超顺磁性纳米粒子；所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的一种具体实施方式，所述超顺磁性纳米粒子掺杂有钙离子。
本发明所述的特异性结合幽门螺旋杆菌的第二生物元件，所述第二生物元件为血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物，所述血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物通过异双官能化聚乙二醇的两端分别连接氯化血红素和去铁胺得到。
作为本发明的一种具体实施方式，所述异双官能化聚乙二醇为NH2-PEG-COOH，分子量为5000(MW＝5000)。
本发明所述的第三生物元件为负载有Fe3+的碳量子点(CDs)。
本发明第五方面提供了一种生物元件的制备方法。本发明所述的特异性捕获幽门螺旋杆菌的第一生物元件的制备方法包括以下步骤：以EDC和NHS活化超顺磁性纳米颗粒表面羧基后，与5’端修饰氨基的SEQ ID NO.5所示的核酸适配体混合孵育制得。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的第一生物元件中的超顺磁性纳米颗粒掺杂有Ca2+。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的第一生物元件通过以下方法制备：将超顺磁性纳米颗粒置于含有CaCl2的PBS缓冲液中，封闭超顺磁性纳米颗粒，经过封闭的超顺磁性纳米颗粒加入含有MES溶液中，随后加入NHS以及EDC活化超顺磁性纳米颗粒，将修饰氨基的核酸适配体连接至超顺磁性纳米颗粒，得到第一生物元件。
作为本发明的一种具体实施方式，第一生物元件的制备方法为：
(1a)使用水热法合成超顺磁性纳米颗粒(SPMNPs)；
(1b)将制备好的SPMNPs在含有质量百分浓度为1-10％CaCl2的PBS缓冲液中孵育；
(1c)磁分离收集经过步骤(1b)处理过的SPMNPs，用PBS缓冲液洗涤，得到经过Ca2+封闭后的SPMNPs；
(1d)将经过Ca2+封闭后的SPMNPs溶解在MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)溶液中；
(1e)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-(3-二甲基氨基丙基)-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到步骤(1d)得到的SPMNPs溶液中，活化SPMNPs；
(1f)将修饰氨基的核酸适配体的加入到活化的SPMNPs溶液中，将核酸适配体连接至SPMNPs表面，随后进行磁分离产物并用PBS缓冲液洗涤产物，得到幽门螺旋杆菌特异性适配体修饰的SPMNPs(SPMNPs@Hp1)。
作为本发明的一种具体实施方式：步骤(1b)中，孵育的时间为40-60分钟。步骤(1b)中，CaCl2在PBS缓冲液中的质量浓度为5％。步骤(1d)中然后，MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液的浓度为0.05-0.1M，具体可选择0.1M MES缓冲溶液(pH6.0)。步骤(1e)中，将质量比为0.8-1.2:0.8-1.2的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和的N-(3-二甲基氨基丙基)-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到SPMNPs溶液中，活化20-30min；进一步地，步骤(1e)中，NHS或EDC在SPMNPs溶液中的浓度为4-5mg/mL。步骤(1f)中，修饰氨基的核酸适配体在活化的SPMNPs溶液的终浓度为2.0-3.0mg/mL。步骤(1f)中，修饰氨基的核酸适配体在4℃振荡24-36h后，连接至SPMNPs表面。
所述的核酸适配体为特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体。
具体地，本发明所述的核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明所述的特异性结合幽门螺旋杆菌的第二生物元件的制备方法包括以下步骤：通过异双官能化聚乙二醇的两端分别连接氯化血红素和去铁胺，合成血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物。
作为本发明的一种优选地实施方式，所述的第二生物元件的制备方法包括以下步骤：在EDC和NHS的催化下，异双官能化聚乙二醇的两端分别连接氯化血红素和去铁胺，合成血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物。
作为本发明的一种优选地实施方式，所述的第二生物元件的制备方法包括以下步骤：将摩尔比为1-1.5:1的去铁胺和双官能化聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)溶解在MES缓冲液中，加入NHS和EDC，反应12-24h后，得到NH2-PEG-DFO。将摩尔比为0.8-1.2：0.8-1.2的NH2-PEG-DFO与氯化血红素在MES缓冲液中反应(在NHS和EDC存在的条件下)，得到目的产物氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺(Hemin-PEG-DFO)。
作为本发明的一种具体实施方式，所述的第二生物元件的制备方法包括以下步骤：
将摩尔比为1-1.5∶1的去铁胺和平均分子量为5000的双官能化聚乙二醇溶解在在0.1M MES缓冲液中，加入摩尔比为0.8-1.2:0.8-1.2的NHS和EDC，反应12-24h后，去除过量的DFO，冷冻干燥得到NH2-PEG-DFO。在摩尔比为0.8-1.2:0.8-1.2的NHS和EDC存在的条件下，将摩尔比为0.8-1.2：0.8-1.2的NH2-PEG-DFO与氯化血红素在0.1M的MES缓冲液中反应。产物经强碱阴离子交换树脂纯化得到氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺(Hemin-PEG-DFO)共聚物。
本发明所述的第三生物元件的制备方法包括以下步骤：将Fe3+以及碳量子点溶液混合得到。
作为本发明的一种优选的实施方式，所述的第三生物元件通过以下方式制备：将0-3.0nM的Fe3+与20.0-30.0ng/mL碳量子点溶液混合得到。
作为本发明的一种具体实施方法，所述的第三生物元件为含有2.4nM Fe3+和20ng/mLCDs的混合溶液。
本发明第六方面提供了用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒，所述生物传感器或者试剂盒包括第一生物元件、第二生物元件以及第三生物元件；所述第一生物元件为：如SEQ ID NO.5所示的核酸适配体修饰的超顺磁性纳米粒子；所述第二生物元件为血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物；所述第三生物元件为负载有Fe3+的碳量子点。
本发明所述的用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒中，所述的第一生物元件的浓度为1.0mg/mL，所述的第二生物元件的浓度为4.0mg/mL，第三生物元件中：Fe3+的浓度为2.4nM，CDs溶液的浓度为20ng/mL。
本发明的第一生物元件为幽门螺旋杆菌特异性适配体修饰的Ca2+掺杂超顺磁性纳米粒子，用于选择性地从样品中捕获幽门螺旋杆菌细胞。第二生物元件为氯化血红素-聚乙二醇(PEG5000)-去铁胺的双功能共聚物，该共聚物可以与幽门螺旋杆菌亲和结合，并螯合来自第三生物元件的Fe3+淬灭CDs溶液中的Fe3+。当形成第一生物元件-幽门螺旋杆菌-第二生物元件复合物与第三生物元件反应时，通过磁分离从第三生物元件中清除Fe3+，从而导致从猝灭的碳量子点溶液中恢复荧光作为转导机制，该传感器能响应Fe3+的微小变化，荧光差异明显。
本发明第七方面提供了一种用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
第一生物元件的制备：以EDC和NHS活化超顺磁性纳米颗粒表面羧基后，与5’端修饰氨基的本发明提供的核酸适配体混合孵育制得第一生物元件；
第二生物元件的制备：通过异双官能化聚乙二醇，在EDC和NHS的催化下，分别连接氯化血红素和去铁胺，合成共聚物血红素-聚乙二醇-去铁胺；
第三生物元件的制备：通过Fe3+与碳量子点(CDs)溶液混合得到；
将制备的三个生物元件共同组成检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒。
本发明进一步提供了用于粪便样品幽门螺旋杆菌检测的试剂盒，该试剂盒包括了上述的生物传感器或者试剂盒。
本发明第八方面提供了一种幽门螺旋杆菌的检测方法。具体地：
所述幽门螺旋杆菌的检测方法为：将待测样品与所述的生物传感器或试剂盒或所述的制备方法制得的生物传感器或试剂盒混合，35℃～40℃孵育0.5h～1h，365nm的激发波长下，400～600nm的发射波长范围内记录荧光光谱，根据相对荧光强度判断是否存在幽门螺旋杆菌；
所述相对荧光强度＝(F465nm-F0465nm)/F0465nm；
其中，F465nm表示待测样品的荧光信号输出值，F0465nm表示碳量子点溶液猝灭后的荧光信号输出值；
所述判断为所述相对荧光强度大于等于零，则样品中含有幽门螺旋杆菌。
除非另有说明，本发明中的“％”为质量百分浓度。
有益效果：本发明提供了特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体，并提供了核酸适配体的筛选方法，该核酸适配体具有良好的特异性和灵敏度。以该适配体制备的生物传感器能够实现对幽门螺旋杆菌的准确检测，检测范围从101CFU/mL到107CFU/mL，检测限低至1CFU/mL，具有优良的检测能力。
附图说明
图1为本发明生物传感器3个模块的结构示意图，其中，图1中的(a)图为本发明的三个模块得结构示意图，图1中的(b)图为本发明设计的幽门螺旋杆菌生物传感器的检测原理；
图2为本发明的富集程度最高的五条幽门螺旋杆菌特异性结合适配体序列的K d值，图2中的a-e图)和候选适配体Hp-1、Hp-2、Hp-4的特异性(亲和性较高，即KD值较低)(图2中的f图)；
图3为本发明超顺磁性纳米粒子(SPMNPs)的表征，其中，a图为SPMNPs粉末和SPMNPs水溶液的照片，b图为SPMNPs的粒径，c图为SPMNPs的傅里叶红外光谱，d-g图为SPMNPs的X射线光电子能谱，h图为SPMNPs的磁滞回曲线；
图4为本发明适配体修饰超顺磁性纳米颗粒以及ssDNA浓度优化结果，，其中，a图为各浓度适配体的荧光强度为纵坐标作图得标准曲线，b图为修饰氨基的候选适配体的浓度优化c体为反应时间优化结果；
图5为本发明的第一生物元件的性能表征，其中，a图为超顺磁性纳米粒子(SPMNPs)的透射电镜图像，b图为经0-7.0％氯化钙封闭SPMNPs捕获后，人工细菌群落的剩余细胞密度(OD600nm)的结果图，证明氯化钙溶液能够消除超顺磁性纳米颗粒对于细菌的非特异性抓取，c图为凝胶电泳滞缓实验证实了适体Hp1对磁性粒子的修饰，c图中，泳道M:DNA marker；泳道1:适体Hp1；泳道2:适体Hp1修饰的SPMNPs(SPMNPS@Hp1)，d图为SPMNPS@Hp1从人工细菌群落中捕获的细菌的16S rDNA标签分析结果，证实了本发明第一生物元件(模块1)SPMNPS@Hp1对于幽门螺旋杆菌的特异性抓取；
图6为本发明氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物的结构表征，证实了第二生物元件(模块2)氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺(Hemin-PEG-DFO)的成功合成，其中，a图为通过树脂纯化获得的氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺深绿色粉末的照片，b图为双官能氨基(NH2)-聚乙二醇-羧基(COOH)(黑色曲线)、氨基(NH2)-聚乙二醇-去铁胺聚合物(红色曲线)共聚物的中间产物和深绿色粉末氯化血红素-聚乙二醇-DFO(蓝色曲线)的红外光谱，c-f图为氯化血红素-聚乙二醇-DFO的X射线电子能谱；
图7为本发明在共聚焦激光显微镜下观察到的血红素-聚乙二醇-DFO共聚物对幽门螺旋杆菌和大肠杆菌的靶向能力的荧光图像(共聚焦观察时激发光波长:488nm，发射光波长:519nm)，其中，a图为幽门螺旋杆菌与FL488(荧光基团)-血红素-聚乙二醇-去铁胺孵育的可见光图像，b图为相应的荧光图像；c图为大肠杆菌与FL488-血红素-聚乙二醇-去铁胺孵育后的可见光图像，d图为相应的荧光图像；e图为幽门螺旋杆菌与FL488-聚乙二醇孵育的可见光图像，f图为相应的荧光图像；g图为大肠杆菌与FL488-聚乙二醇孵育后的可见光图像，h图为相应的荧光图像；
图8为本发明第三生物元件(模块3)的性能测试结果，其中，a图为不同浓度Fe3+(0-3.0nM)对碳量子点溶液(30.0ng/mL)(Em:365纳米，Ex:400纳米至600纳米)的猝灭作用，b图为磁分离第三生物元件(模块3)中的Fe3+使得模块3中淬灭的荧光恢复；
图9为本发明的生物传感器的条件优化，其中，a图为模块1Ca/SPMNPS@Hp1的浓度优化，b图为模块2Hemin-PEG-DFO的浓度优化，c图为模块3中CDs的浓度优化，d图为优化模块1和幽门螺旋杆菌的反应时间，e图为模块1和模块2的反应时间，f图为模块2和Fe3+之间的反应时间；
图10为本发明的荧光回复率与幽门螺旋杆菌浓度之间的关系，其中，a图为荧光强度与幽门螺旋杆菌浓度之间的关系，b图为荧光恢复率与幽门螺旋杆菌浓度的线性关系。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体的筛选方法，以及基于铁载体-铁离子/碳量子点的荧光生物传感器。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
实施例1：适配体筛选
1、设计随机文库序列：5’-TGGACCTTGCGATTGACAGC(SEQ ID NO.1)-40nt-GCAGACATGAGTCTCAGGAC(SEQ ID NO.2)-3’
40nt为中间随机区域的40个核苷酸，两端分别为20个核苷酸的固定区域，序列总长为80个核苷酸。
筛选所用的引物序列分别为：
上游引物：5’-TGGACCTTGCGATTGACAGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)
下游引物1：5’-GTCCTGAGACTCATGTCTGC-3’(如SEQ ID NO.4所示)
下游引物2：5’-生物素-GTCCTGAGACTCATGTCTGC-3’
上述的核酸序列均由上海生工生物有限公司完成。
2、采用WB-SELEX技术筛选幽门螺旋杆菌适配体
(1)筛选所用菌株及其培养与收集：
使用幽门螺旋杆菌ATCC 26695(H.pylori)进行适配体筛选。使用大肠杆菌
Figure BDA0003181355000000091
11775TM(E.coli)，戈登氏链球菌
Figure BDA0003181355000000092
35557TM(S.gordonii)，约氏乳杆菌
Figure BDA0003181355000000093
11506TM(L.johnsonii)，皮氏罗尔斯通菌
Figure BDA0003181355000000094
27511TM(R.pickettii)，痢疾志贺菌
Figure BDA0003181355000000095
13313TM(S.dysenteriae)，干酪乳杆菌
Figure BDA0003181355000000096
393TM(L.casei)，粪肠球菌
Figure BDA0003181355000000097
19433TM(E.faecalis)和双歧杆菌
Figure BDA0003181355000000098
29521TM(B.bifidum)进行反选择。上述反选择细菌用于评估适配体的特异性。所有需氧菌株在LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，pH 7.2-7.4)中于37℃生长16小时。将厌氧菌在MRS培养基(青岛Aikb)和厌氧瓶(BUGBOX，Ruskinn，Bridgend，UK)中于37℃培养48h。离心收集细胞，使用前用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl2，pH7.5)洗涤两次。
(2)第一轮筛选过程为负筛选，具体步骤如下：
①将人工合成的文库1.3nmol溶解于130μL2x结合缓冲液中，95℃加热5min，冰浴10min。
②取幽门螺旋杆菌的菌液进行离心洗涤，然后用2x结合缓冲液进行重悬，使菌的浓度为1×107CFU/mL。
③将准备好的文库和菌液混合于300μL2x结合缓冲液中，于37℃摇床孵育30min，使文库与细菌充分结合。
④当文库与目标菌株结合以后，离心去除未结合的ssDNA，用1x结合缓冲液洗涤菌体数次，加入100μL ddH2O重悬菌体，95℃加热10min，12000rpm/min离心10min，取上清液作为模板进行PCR扩增并制备次级文库。
⑤扩增体系：上游引物(10μM)和下游引物2(10μM)各2.5μL，高保真Q5酶0.5μL，模板2μL，5x Buffer 10μL，dNTP(10mM)1μL，灭菌去离子水(ddH2O)31.5μL。
扩增程序：总循环数为30，预变性温度为98℃，时间持续30s，变性温度为98℃，持续时间为10s，退火温度为66℃，持续时间为30s，延伸温度为72℃，持续时间为20s。循环结束后，最后的延伸温度为72℃，持续时间为2min。
(3)次级文库制备：
①PCR扩增产物利用聚丙烯酞胺凝胶进行电泳，然后使用索莱宝公司的PAGE胶DNA回收试剂盒回收正确条带，溶解于100μL磁珠buffer(50mM Tris-HCl，1mM EDTA·2Na，100mM NaCl，pH 7.5)。
②充分震荡重悬磁珠，取50μL到1.5mL Ep管中。磁性分离1-2min，去掉上清，从磁性分离器上取下Ep管。
③加入500μL磁珠buffer，充分震荡，磁性分离1-2min，去上清，重复一次。
④取PCR扩增后的胶回收产物，用Buffer1稀释至500μL，加入磁珠重悬，于室温摇床结合90min，磁性分离1-2min，吸弃上清。
⑤用500μL磁珠buffer洗涤磁珠2次。
⑥加入100μL新配制的0.1M NaOH溶液中，于37℃或者95℃孵育15min。
⑦磁性分离1-2min，取上清，得到100μLssDNA。
⑧加入10μL左右的0.1M HCl溶液调节pH至7.5左右。
⑨用Nanodrop 2000测定ssDNA的含量。
(3)其他轮次筛选：
①从3，6和9轮进行反筛选，与正筛的区别在于与文库结合的菌株不同，正筛过程中选用的菌株为幽门螺旋杆菌，反筛过程中采用的菌株为大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌。结合前，将以上用于反筛的菌液进行离心洗涤，然后用2x结合缓冲液进行重悬，使每一种菌的浓度为1×107CFU/ml。结合结束后，将混合液12000rpm/min离心10min，取上清作为模板进行PCR扩增并制备次级文库。结合到反筛细菌上的ssDNA经离心去除掉。
筛选总共进行10轮，各轮的筛选条件见表1。
表1各轮筛选条件
Figure BDA0003181355000000101
Figure BDA0003181355000000111
注：在第3，6和9轮反应体系中加入各反选择菌(大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌)。体积等于25μL，每个反选菌培养物的细胞密度为1×107CFU/mL。
3、候选适配体的鉴定
HTS对筛选过程中的第10轮中的ssDNA文库序列进行了全面检测。从上一轮产生的PCR产物中富集2μg的ssDNA，由Novogene Co.Ltd。(Beijing，China)使用Illumina Hiseq3000平台进行测序以产生1Gb的数据量。根据序列的同一性对序列进行聚类，从而揭示了ssDNA库中每个序列的丰度。选择前5个高丰度的ssDNA 作为适配体候选对象，分析了他们在所有序列中的分布频率。
将高通量分析得到的5条丰度最高的序列进行5’端的FAM(羧基荧光素)修饰，配制8个浓度(50、100、150、200、250、300、350、400nM)分别与1×107CFU/mL的幽门螺旋杆菌室温下孵育30min，离心洗涤后，通过荧光酶标仪检测荧光强度。根据检测的荧光强度值使用GraphPad Prism5软件拟合结合曲线并得出解离常数。如图2中的a-e所示。
为了筛选特异性最强的序列，根据K d值的实验结果挑选出亲和力较强的3条序列(Hp-1，Hp-2和Hp-4)进行后续的特异性实验。将这3条序列5’端修饰FAM，然后分别与幽门螺旋杆菌、大肠杆菌，戈登氏链球菌、皮氏罗尔斯通菌、约氏乳杆菌、痢疾志贺菌、粪肠球菌和干酪乳杆菌在室温下孵育30min，离心洗涤后使用荧光酶标仪进行荧光强度的检测。检测结果如图2中的f图所示，3条序列与幽门螺旋杆菌结合后的荧光强度均超过300，且五种干扰菌株的荧光强度均低于100。从图2中可以看出，Hp-1(Hp1)与干扰菌株的结合能力更弱，与Hp-2(Hp2)和Hp-4(Hp4)存在显著差异。因此确定Hp-1(序列如SEQ ID NO.5所示)为亲和力最高、特异性最强的适配体。
实施例2：幽门螺旋杆菌荧光生物传感器的制备
1、首先合成三模块荧光生物传感器
本发明提供了用于体外检测幽门螺旋杆菌的“三明治”模式生物传感器。如图1中的a图所示，该传感器由幽门螺旋杆菌特异性适配体修饰的Fe3O4超顺磁磁性纳米颗粒(第一生物元件)、作为双功能致动器的氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺(Heme-PEG-DFO)聚合物(第二生物元件)和Fe3+猝灭的CDs溶液(Fe3+/CDs)(第三生物元件)组成。SPMNPs@aptamer实现幽门螺旋杆菌的捕获和富集。随后，Hemin-PEG-DFO聚合物能够通过血红素与捕获的幽门螺旋杆菌结合，形成SPMNPs@aptamer-幽门螺旋杆菌-Hemin-PEG-DFO复合物。该复合物可以螯合Fe3+/CDs溶液中的铁离子。通过磁分离，可以从CDs溶液中恢复猝灭的荧光。如图1中b图所示，这是本发明中荧光生物传感器检测幽门螺旋杆菌的工作原理。
第一生物元件(模块1)的制备：
(1)使用水热法合成超顺磁磁性纳米颗粒(SPMNPs)：在20mL乙二醇中，加入0.6g三氯化铁(FeCl3·6H2O)、0.2g二氯化铁(FeCl2·4H2O)和1.2g柠檬酸钠，在反应釜中200℃反应10小时。反应结束后通过磁分离收集磁性纳米颗粒，使用去离子水洗涤两次后，冻干得到如图3中a图所示的黑色粉末。如图3中a图所示，将磁颗粒重悬于去离子水中，可以得到磁颗粒水溶液。如图3中b图和图5中a图(透射电镜观察)所示，磁颗粒粒径分布均一，约80nm。通过傅立叶变换红外吸收光谱仪(FTIR,图3中c图)和X射线光电子能谱分析(XPS，图3中d图、e图、f图、g图)，可知磁颗粒表面具有羧基。通过振动样品磁强计(图3中h图)测得磁颗粒的磁滞回曲线，证明合成的磁颗粒具有超顺磁性。
(2)由于SPMNPs表面具有丰富的羧基，会在菌群抓取过程中呈现非特异性抓取，因此采用CaCl2对其表面的羧基进行一定的封闭。将制备好的1.0mg SPMNPs与质量浓度为5％CaCl2的1×PBS缓冲液(1mL)中孵育60分钟。然后，磁分离收集处理过的SPMNPs，用1×PBS缓冲液洗涤两次。将不同浓度CaCl2封闭后的SPMNPs(1mg)与1mL人工混合菌悬液(幽门螺旋杆菌，大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌的混合溶液，每种菌的终浓度为1×107cfu/mL)孵育1h，磁分离后测定人工混合菌悬液的600nm处的吸光值，由图5中b图可得，采用质量浓度为5％CaCl2的PBS溶液封闭处理能够更好地消除SPMNPs对于菌群的非特异性吸附。
(3)将1.0mg的5％Ca2+封闭后的SPMNPs溶解在1mL的0.1M MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)(pH6.0)溶液中。然后，将5.0mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和5.0mg的N-(3-二甲基氨基丙基)-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到SPMNPs溶液中，活化30min后，加入不同终浓度的修饰氨基的候选适配体Hp-1(由上海生工生物公司合成)(0、1、2、3、4、5、6μg/mL)。反应在4℃振荡0、4、8、12、16、20或24h后，进行磁分离并用1×PBS缓冲液洗涤，得到幽门螺旋杆菌特异性适配体修饰的SPMNPs(SPMNPs@Hp1)。为了测定SPMNPs@aptamer表面适配体的接枝量，基于SYBR GreenⅡ荧光染料与单链DNA结合产生荧光的原理，建立了一种痕量DNA荧光检测方法。用TE缓冲液将已知浓度的适配体稀释成标准浓度溶液(6，12，18，24，30，36，和42ng/mL)。于96孔荧光微量滴定板内分别加100μL不同浓度的标准溶液,每孔再加100μL用TE稀释10000倍的
Figure BDA0003181355000000131
GreenⅡ核酸染液(Sigama公司)混合，采用荧光酶标仪在激发光为497nm,发射光为520nm下测荧光强度。以相应的浓度为横坐标，以各浓度适配体的荧光强度为纵坐标作图得标准曲线(如图4中a图所示)，线性方程为y＝117.65x–125.67，相关系数为R2＝0.9909。如图4中b图和图4中c图所示，通过该方法确定制备SPMNPs@aptamer过程中，修饰氨基的候选适配体的最适浓度为3.0μg/mL，最适反应时间为16h。将采用3.0μg/mL修饰氨基的候选适配体与1mg的5％Ca2+封闭后的SPMNPs反应16h后的得到的SPMNPs@aptamer和候选适配体Hp-1在60V、20mA和0.5×TBE buffer中进行电泳，如图5中c图所示，由于SPMNPs的作用，SPMNPs@aptamer和候选适配体Hp-1相比，在电场中移动较为缓慢，因此适配体成功修饰在SPMNPs表面。
(4)将1mg SPMNPs@aptamer加入到1mL的人工混合菌悬液(幽门螺旋杆菌，大肠杆菌，戈登氏链球菌，约氏乳杆菌，皮氏罗尔斯通菌，痢疾志贺菌，干酪乳杆菌，粪肠球菌和双歧杆菌的混合溶液，每种菌的终浓度为1.0×107cfu/mL)孵育1h后，磁选分离，以捕获的细菌为模板扩增16S rDNA的PCR产物。构建16S rDNA文库。选择200个转化子经生工生物技术(上海)16S DNA测序，对菌株的种类和数量进行鉴定和计数。如图5中d图所示，SPMNPs@aptamer抓取的细菌主要为幽门螺旋杆菌，因此模块1能够特异性抓取菌群中的幽门螺旋杆菌。
第二生物元件(模块2)的制备：
(1)将84.1mg的去铁胺(DFO)和500.0mg双官能化聚乙二醇(NH2-PEG-COOH，MW＝5000)(摩尔比＝1.5∶1)溶解在10mL的0.1M MES缓冲液(pH 6.0)，加入50.0mg的NHS和50.0mg的EDC，反应12h后，过量的DFO通过透析袋(截留分子量:500-1000)在室温下透析48小时除去过量的DFO，冷冻干燥可得到NH2-PEG-DFO。之后，将669.0mg的NH2-PEG-DFO与61.6mg的氯化血红素(hemin)，加入50mg的EDC和50mg NHS在10.0mL的0.1M的MES缓冲液(pH6.0)中反应。目的产物氯化血红素-聚乙二醇-去铁胺(Hemin-PEG-DFO)经强碱阴离子交换树脂(201×7)纯化。将1.0g干燥树脂珠与10.0mg目的共聚物在50mL锥形瓶中以120rpm/min的搅拌速度孵育24h后，将树脂珠过滤并转移到另一个锥形瓶中，将10.0mL的5.0％NaCl水溶液加入到锥形瓶中，然后以120rpm/min的速度振荡24h后洗脱得到Hemin-PEG-DFO，冻干后Hemin-PEG-DFO呈灰绿色粉末，如图6中a图所示。采用FT-IR对异双官能聚乙二醇(NH2-PEG-COOH,MW≈5000)进行表征，并与NH2-PEG-DFO共聚物的中间产物进行了比较。如图6中b图所示，NH2-PEG-DFO在1540.0cm-1和1262.0cm-1处出现新的特征峰，分别对应于-CONH-和C-N键的振动峰。NH2-PEG-COOH没有出现这些峰，说明NH2-PEG-DFO共聚物中有酰胺键的形成。此外，NH2-PEG-DFO在2310.0cm-1处出现了一个峰，归因于-OH基，而NH2-PEG-COOH没有出现这个峰。由于DFO是唯一一个有-OH基团的分子，加上酰胺峰的出现，表明DFO通过酰胺键与NH2-PEG-COOH的连接。此外，NH2-PEG-COOH与hemin反应后，Hemin-PEG-DFO共聚物的FT-IR光谱显示出两个明显的谱区，分别为536.0cm-1和973.0cm-1处的Fe配位键和卟啉键，这表明hemin与NH2-PEG-COOH共聚物结合。此外,XPS分析(图6中c图、d图、e图和f图)证明了NH2-PEG-COOH的成功合成。
(2)为了验证模块2的功能，采用Alexa Fluor 488尸胺染料对模块2进行荧光标记，进而验证模块2是否能够特异性结合幽门螺旋杆菌。具体操作为，100mg的Heme-PEG-DFO溶解在1mL的0.1M MES缓冲液(pH 6.0)中，加入5.0mg的NHS和5.0mg的EDC，加入1.0mg的Alexa Fluor 488尸胺染料，反应12h后，用透析袋(截留分子量：3500)透析48小时，去除游离Alexa Fluor 488染料，并冷冻干燥得到FL488-Hemin-PEG-DFO。同样的方法制备得到NH2-PEG-FL488。将收集的幽门螺杆菌和大肠杆菌用无菌的1×PBS洗涤2-3次。然后分别加入20μL的FL488-Heme-PEG-DFO(1mg/mL)和NH2-PEG-FL488(1mg/mL)。在37℃下孵育30min，用1×PBS洗两次，立即在共聚焦激光显微镜下进行观察(激发波长:488nm。发射波长:519nm)。如图7所示，FL488-Hemin-PEG-DFO能够结合在幽门螺旋杆菌的表面，进而观察到绿色荧光，反之，FL488-Hemin-PEG-DFO不能够结合到大肠杆菌表面，因此观察不到绿色荧光。另一方面NH2-PEG-FL488和幽门螺旋杆菌孵育后，并没有观察到绿色荧光，表明NH2-PEG-FL488不能与幽门螺旋杆菌结合，因此FL488-Hemin-PEG-DFO是在Hemin的介导下结合在幽门螺旋杆菌的表面。综上所述，模块2能够特异性结合幽门螺旋杆菌。
第三生物元件(模块3)的制备：
(1)CDs(碳量子点)的制备方法为，称取2.0g的柠檬酸铵固体用研钵进行充分研磨，将研磨后的固体粉末倒入瓷坩埚中，加热干燥箱，调节温度至180℃，将装有柠檬酸铵固体粉末的坩埚放入干燥箱中恒温加热2h。待反应完成后冷却至室温，将黑色固体取出研磨，共使用20mL去离子水溶解，超声30min后10000rpm离心20min，取上清液，抛弃沉淀物，采用0.22μm滤膜去除杂质。将去除杂质后的溶液转移至透析袋(截留分子量:500-1000)中透析6h，间隔1h更换一次去离子水。将透析完成后将溶液冷冻，进行冷冻干燥收集碳量子点粉末，粉末为棕褐色，放置于4℃保存。
(2)将不同浓度Fe3+(终浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0nM)加入到30ng/mL的CDs溶液中，取200μL采用荧光酶标仪在激发光为265nm,发射光为365nm下测荧光强度。如图8所示，铁离子能够猝灭CDs的荧光，同时对于CDs的荧光猝灭效果与Fe3+浓度有关。
(3)为了验证模块3的功能，将1.0mg SPMNPs-Hp1与1.0mL的幽门螺旋杆菌(1.0×107CFU/mL)孵育60.0min。然后通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(4.0mg/mL)溶液中。再孵育30.0min后，通过磁性分离再次收集模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物，并转移至1mL的模块3溶液中(3.0nM Fe3+和30ng/mLCDs组成的混合溶液)中孵育10.0min，磁性分离后，取上清液放入96孔板中在激发光为265nm,发射光为365nm下检测荧光强度，如图8中b图所示，模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物与模块3孵育后，能够利用模块2中的DFO络合模块3溶液中的Fe3+。进而通过磁分离后，使得模块3中淬灭的荧光(蓝色曲线表示Fe3+猝灭后的CDs溶液荧光)得到恢复(红色曲线表示Fe3+去除后，荧光的恢复)。
以上三个模块可组成检测幽门螺旋杆菌的生物传感器。
之后对三个模块在检测过程中的用量及反应时间进行优化。具体操作为，为优化检测体系中SPMNPs@aptamer的浓度，将SPMNPs@aptamer的浓度设置为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mL。不同浓度的SPMNPs@aptamer与幽门螺杆菌细胞(1.0×107CFU/mL)孵育40min。磁分离后，检测上清中剩余幽门螺杆菌浓度。由图9中a图所示，当SPMNPs@aptamer的使用浓度为1.0mg/mL时，上清中剩余的幽门螺旋杆菌浓度为1.6×103CFU/mL，抓取效率高达99.9％。为优化检测体系中模块2Hemin-PEG-DFO的浓度，将1.0mg/mL的SPMNPs@aptamer与幽门螺杆菌细胞(1.0×107CFU/mL)孵育40min后，通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mg/mL)溶液中，磁分离后，测定溶液剩余的Hemin-PEG-DFO浓度，如图9中b图所示，模块2Hemin-PEG-DFO最适使用浓度为4.0mg/mL。Hemin-PEG-DFO与络合的分子比为1：1，因此根据Hemin-PEG-DFO的使用浓度可以计算得到Fe3+的最佳浓度为2.4nM，将终浓度为2.4nM的Fe3+加入到10、20、30、40和50ng/mL的CDs溶液中，采用荧光酶标仪在激发光为265nm,发射光为365nm下检测荧光强度，如图9中c图所示，2.4nM的Fe3+可以完全猝灭20ng/mL的CDs溶液，当CDs溶液为30ng/mL时，荧光没有被完全猝灭，因此模块3中，Fe3+的最佳浓度为2.4nM，CDs溶液的最佳浓度为20ng/mL。
采用优化后的浓度，即将1.0mg SPMNPs@aptamer与1.0mL的幽门螺旋杆菌(1.0×107CFU/mL)孵育0、10、20、30、40、50和60min。然后通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(4.0mg/mL)溶液中。再孵育30min后，通过磁性分离再次收集模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物，并转移至1mL的Fe3+/CDs溶液(2.4nMFe3+和20ng/mLCDs组成的混合溶液)中孵育10min，磁性分离后，取上清液放入96孔板中检测荧光强度。以此来确定模块1与幽门螺旋杆菌的孵育时间为30min(图9中d图所示)。
将1.0mg SPMNPs@aptamer与1.0mL的幽门螺旋杆菌(1.0×107CFU/mL)孵育30min。然后通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(4.0mg/mL)溶液中。再孵育0、5、10、15、20、25和30min后，通过磁性分离再次收集模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物，并转移至1mL的Fe3+/CDs溶液(2.4nM Fe3+和20ng/mLCDs组成的混合溶液)中孵育10min，磁性分离后，取上清液放入96孔板中检测荧光强度。以此来确定模块1-幽门螺旋杆菌复合物与模块2的孵育时间为10min(图9中e图所示)。
将1.0mg SPMNPs@aptamer与1.0mL的幽门螺旋杆菌(1.0×107CFU/mL)孵育30min。然后通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(4.0mg/mL)溶液中。再孵育10min后，通过磁性分离再次收集模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物，并转移至1mL的Fe3+/CDs溶液(2.4nM Fe3+和20ng/mLCDs组成的混合溶液)中孵育0、5、10、15、20、25和30min，磁性分离后，取上清液放入96孔板中检测荧光强度。以此来确定模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物与模块3的孵育时间为5min(图9中e图所示)。
2、幽门螺旋杆菌的检测
将1.0mg SPMNPs@aptamer与1.0mL的幽门螺旋杆菌(1.0×107CFU/mL)孵育30.0min。然后通过磁分离收集模块1-幽门螺旋杆菌复合物，并将其转移到1.0mL的Hemin-PEG-DFO(4.0mg/mL)溶液中。再孵育10.0min后，通过磁性分离再次收集模块1-幽门螺旋杆菌-模块2的复合物，并转移至1mL的Fe3+/CDs溶液(2.4nM Fe3+和20ng/mLCDs组成的混合溶液)中孵育5.0min，磁性分离后，取上清液放入96孔板中检测荧光强度。当(F465nm-F0465nm)/F0465nm≥0则表明存在幽门螺旋杆菌。
3、分辨率检测
为了评估铁载体Fe3+/CDs荧光生物传感器的分辨率，按照如上所述的方法进行了针对一系列不同浓度的幽门螺旋杆菌的检测，其范围从10CFU/mL至1.0×107CFU/mL。在优化条件下，测定了不同浓度幽门螺旋杆菌存在下所制备的荧光生物传感器的荧光恢复率。如图10所示，适体传感器对幽门螺旋杆菌检测的浓度范围为10～107CFU/mL，表现出良好的响应性。
荧光恢复率与幽门螺旋杆菌浓度呈线性相关，标准曲线为(F465nm-F0465nm)/F0465nm＝0.11491log[C(CFU/mL)]+0.02457，相关系数为0.99029(F465nm表示待测样品的荧光信号输出值，F0465nm表示碳量子点溶液猝灭后的荧光信号输出值)。根据该方程，得到的检测限(LOD)为1CFU/mL。
结果表明，本发明提供的方法可实现对溶液中幽门螺旋杆菌的准确检测。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体、生物元件、生物传感器及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggaccttgc gattgacagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagacatga gtctcaggac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggaccttgc gattgacagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcctgagac tcatgtctgc 20
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtatacgtat tacctgcagc gatatctcgg agatcttgca tacgtattac ctgcagcgat 60
atctcggaga tcttgc 76

Claims (10)

1.一种特异性结合幽门螺旋杆菌的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的核酸适配体在制备检测幽门螺旋杆菌的试剂中的应用。
3.如权利要求1所述的核酸适配体在制备检测幽门螺旋杆菌的试剂盒或者生物传感器中的应用。
4.一种特异性捕获幽门螺旋杆菌的第一生物元件或特异性结合幽门螺旋杆菌的第二生物元件，其特征在于，所述第一生物元件包括核酸适配体修饰的超顺磁性纳米粒子；所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.5所示；所述第二生物元件为血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物，所述血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物通过异双官能化聚乙二醇两端分别连接氯化血红素和去铁胺得到。
5.根据权利要求4所述的特异性捕获幽门螺旋杆菌的生物元件，其特征在于，所述超顺磁性纳米粒子掺杂有钙离子；所述异双官能化聚乙二醇为NH2-PEG-COOH，分子量为5000。
6.一种特异性捕获幽门螺旋杆菌的第一生物元件或特异性结合幽门螺旋杆菌的第二生物元件的制备方法，其特征在于，所述第一生物元件通过以下方法制备：以EDC和NHS活化超顺磁性纳米颗粒表面羧基后，与5’端修饰氨基的SEQ ID NO.5所示的核酸适配体混合孵育制得；所述第二生物元件通过以下方法制备：通过异双官能化聚乙二醇在EDC和NHS的催化下，将氯化血红素和去铁胺进行连接，合成血红素-聚乙二醇-去铁胺共聚物。
7.一种用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒，其特征在于，所述生物传感器或者试剂盒包括第一生物元件、第二生物元件以及第三生物元件；所述第一生物元件为：如SEQ ID NO.5所示的核酸适配体修饰的超顺磁性纳米粒子；所述第二生物元件为血红素-聚乙二醇-去铁胺；所述第三生物元件为负载有Fe3+的碳量子点。
8.根据权利要求7所述的用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒，其特征在于，所述的第一生物元件的浓度为1.0mg/mL，所述的第二生物元件的浓度为4.0 mg/mL，第三生物元件中：Fe3+的浓度为2.4nM，碳量子点溶液的浓度为20ng/mL。
9.一种如权利要求7所述的用于检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一生物元件的制备：以EDC和NHS活化超顺磁性纳米颗粒表面羧基后，与5端修饰氨基的本发明提供的核酸适配体混合孵育制得第一生物元件；
第二生物元件的制备：通过异双官能化聚乙二醇，在EDC和NHS的催化下，将氯化血红素和去铁胺进行连接，合成为共聚物血红素-聚乙二醇-去铁胺；
第三生物元件的制备：通过Fe3+与碳量子点溶液混合制得；
将制备的三个生物元件共同组成检测幽门螺旋杆菌的生物传感器或试剂盒。
10.一种用于粪便样品幽门螺旋杆菌检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8所述的生物传感器或者试剂盒和用于富集粪便样品的微流控芯片。
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