CN113514435A - 一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器 - Google Patents

一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器 Download PDF

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Abstract

本专利利用上转换纳米材料，结合荧光传感器技术，构建了一种快速灵敏检测尿液样本中大肠埃希菌的新型荧光生物传感器。通过在荧光传感器的基础上，结合在复杂生物样本中发光性能稳定的上转换纳米粒子，以及具有大的比表面积能够负载大量检测探针并且可以通过磁性分离的氧化石墨烯@四氧化三铁复合纳米材料，能够有效地避免复杂生物样品的背景荧光信号的干扰以及纳米材料自身遮光效应的干扰，实现大肠埃希菌的快速灵敏检测。该新型荧光传感器具有较宽的检测范围(103‑107CFU/mL)和较低的检测限(467CFU/mL)(s/n＝3)，并且可以在30分钟就完成样本中靶标大肠埃希菌的检测。同时，我们提出的这种检测策略，只需要改变捕获元件，就能实现其他生物靶点的检测，包括细胞、肿瘤标记物和其他细菌株等。结果表明，该荧光传感器在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

Description

一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传 感器
技术领域
本发明涉及一种荧光生物传感器，特别涉及一种基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测大肠埃希菌的荧光生物传感器。
背景技术
细菌性尿路感染是一种临床常见的感染性疾病，其中80％的UTIs是由大肠埃希菌引起的。能否及时诊断并采取正确的治疗措施取决于实验室检查结果。目前细菌鉴定的主要方法包括平板培养法，聚合酶链反应法，质谱法。作为病原菌鉴定金标准，平板培养法需要通过富集步骤来增加细菌数量以达到最低检测水平，整个培养和鉴定过程至少需要48小时，这可能会导致治疗延误。基于聚合式酶链反应的分子生物学方法敏感度高，可以定量检测细菌量，但易受污染，产生假阳性信号，对实验室环境及操作人员的技术水平要求高，限制了它的大规模临床应用。质谱法是另一种非常有吸引力的检测方法，并且已逐渐被临床接受，然而，较高的成本和复杂的操作步骤限制了其在经济欠发达地区的应用。因此，迫切需要一种简单快速的诊断病原菌的方法以满足临床需求。
近年来，基于纳米材料构建生物传感器用于病原菌的快速检测越来越受到重视。其中，荧光生物传感器由于具有制造成本低，操作简单，检测设备普遍易获取等优点，在生物靶标检测中应用广泛。然而，传统的有机荧光染料荧光寿命短，光学性能不稳定，背景信号严重，使得它们在复杂生物样品中的检测应用受到限制。上转换纳米粒子是一种新型的发光纳米材料，它通过多光子吸收机制将近红外光转换为短波辐射，并且可以通过掺杂不同元素的稀土离子比例来调节其发射波长。与传统的有机荧光染料相比，上转换纳米粒子光学性质稳定，不易发生光漂白，并且由于激发光处于近红外区，其发射光不受复杂生物样品中背景吸收和自发荧光的干扰。氧化石墨烯是一种二维层状材料，它不仅可以通过π键之间的相互作用吸附单链核酸分子，而且由于其大的比表面积，能够大量负载生物分子或是纳米材料。同时，由于其具有良好的荧光淬灭能力，它在荧光传感器中也有广泛的应用。然而，基于氧化石墨烯构建生物传感器时，其检测性能容易受到其较差的水溶性以及遮光效果的影响。相比于氧化石墨烯，四氧化三铁有更好的水溶性，当它与氧化石墨烯结合形成纳米复合物后，不仅保留了氧化石墨烯优异的荧光淬灭性能及大的比表面积，能够淬灭荧光并负载大量生物分子。同时，由于包含四氧化三铁而易于被磁体分离，能将纳米材料从反应体系中分离开来，避免材料自身遮光效应对检测结果的干扰。
基于以上研究背景，结合本课题组的前期工作基础，本发明合成了荧光性能稳定的上转换纳米粒子，以及能够淬灭上转换荧光并负载大量生物分子，同时又能够通过磁性分离优化检测体系的氧化石墨烯@四氧化三铁纳米复合物，以快速灵敏检测尿液样本中的大肠埃希菌。通过充分利用上转换纳米粒子和氧化石墨烯@四氧化三铁纳米复合物的优点，开发出一种更加简单、快速、高灵敏检测尿液样本中大肠埃希菌的荧光传感器。
发明内容
本发明的目的是开发出一种更加简单、快速、高灵敏即时检测大肠埃希菌的荧光传感器。具体技术方案如下：
一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)上转换纳米粒子的制备首先，将482.30mg的氯化钇(III)六水合物，155.00mg的氯化镱(III)六水合物和2.75mg的氯化铥(III)六水合物添加到装有18mL油酸和30mL 1-十八烯的烧瓶中，在氩气环境下加热至160℃并反应90分钟。待溶液冷却至室温后，将10mL含296.30mg氟化铵和200.00mg氢氧化钠的甲醇溶液加入烧瓶中，并在50℃下搅拌30分钟。随后将混合溶液加热至100℃并保持30分钟，以除去残留的甲醇。接下来，将溶液加热至300℃，120分钟后关闭反应。待溶液冷却至室温后，用乙醇洗涤三次，并分散在环己烷中。将溶解在环己烷中的上转换纳米粒子与乙醇混合，超声处理15分钟后，在10625×g下离心10分钟，去除上清液。然后，将沉淀物与盐酸溶液的混合并通过超声60分钟。接下来，将经盐酸处理的上转换纳米粒子用乙醇洗涤三次，以除去过量的酸。最后，将无配体的上转换纳米粒子分散在去离子水中。随后采用聚丙烯酸钠盐对上转换纳米粒子进行表面修饰。将无配体的上转换纳米粒子水溶液滴加到聚丙烯酸钠盐溶液中，在37℃下振荡过夜，转速为180rpm，用去离子水离心洗涤3次，去除未反应的聚丙烯酸钠盐。最后，将改性的上转换纳米粒子分散在去离子水中并保存在4℃冰箱里备用。
(2)适配体功能化上转换纳米探针的制备将改性后的上转换纳米粒子离心后，重悬在HEPES分散液中，向其中加入特异性大肠埃希菌适配体，在37℃的金属浴中振荡240分钟后，离心(10625×g)去除未反应的适配体。接下来，将适配体修饰后的上转换纳米粒子重悬在HEPES分散液中，并向其中加入mPEG-NH2(甲氧基聚乙二醇氨)，在37℃的金属浴中振荡120分钟后，以10625×g离心力离心洗涤2次，并重悬于HEPES分散液中。将分散液储存在4℃条件下保存。
(3)荧光传感器的制备取步骤(2)中得到的适配体功能化上转换纳米探针与GO@Fe3O4纳米复合物在37℃金属浴中反应30分钟，随后在外部磁铁的辅助下，弃去上清液。最后，加入HEPES分散液重悬，并储存在4℃条件下，以备将来使用。
所述步骤(1)中上转换纳米粒子合成必须在氩气氛围中进行。
所述步骤(1)中上转换纳米粒子合成过程中不能含有水。
所述步骤(1)中甲醇必须完全去除。
所述步骤(1)中盐酸的浓度为2.00mol/L。
所述步骤(1)中聚丙烯酸钠盐的浓度为10.00mg/mL。
所述步骤(2)中大肠埃希菌特异性适配体的浓度为10.00μmol/L。
所述步骤(2)中mPEG-NH2的浓度为200.00mg/mL。
所述步骤(2)和步骤(3)中HEPES的浓度为0.01mol/L,pH 7.5-8.0。
所述步骤(3)中GO@Fe3O4的最适浓度为0.60mg/mL，最佳孵育时间为30分钟。
本发明利用纳米材料结合荧光传感器建立了基于上转换纳米粒子和纳米材料GO@Fe3O4快速检测大肠埃希菌的荧光传感器。其检测原理为将特异性识别大肠埃希菌的适配体修饰到上转换纳米粒子表面，利用适配体与GO@Fe3O4之间的π键作用力将适配体功能化上转换纳米探针吸附在GO@Fe3O4表面上，GO@Fe3O4具有大的比表面积，能够吸附大量上转换纳米探针，同时由于荧光淬灭特性，能够吸收上转换荧光，又因为含有Fe3O4，能够通过外部磁铁分离，随后加入反应的目标物大肠埃希菌标准菌株，并在37℃孵育30分钟，在目标菌株存在的条件下，由于目标菌株与适配体之间的亲和力大于适配体与GO@Fe3O4之间的π键作用力，识别了目标菌株的信号探针会远离GO@Fe3O4表面，被GO@Fe3O4淬灭的上转换荧光信号恢复，信号恢复的强弱与目标菌株的量成正相关的关系。
本发明所涉及的纳米探针对此传感器的制备起着至关重要的作用，因此分别采用透射电镜、EDS和Zeta电位对其进行了表征。如附图2所示，采用场发射扫描电镜对上转换纳米粒子的表面形貌进行了研究，上转换纳米粒子为六边形，微粒分布均匀，大小约为200nm。用EDS分析了钇、镱、铥、氟、钠元素的存在，如附图3所示，清晰地观察到钇、镱、铥、氟、钠元素，表明上转换纳米粒子成功合成。Zeta电位用于表征核酸功能化上转换纳米探针的制备。聚丙烯酸功能化上转换纳米粒子的电位值为-16.18mV，在负电荷大肠埃希菌特异性适配体连接后，在同一溶液中测得的电位值降至-19.73mV，在加入mPEG-NH2后，在同一溶液中测得的电位值升至-11.63(附图4)。结果表明，适配体成功地连接在上转换纳米粒子表面，mPEG-NH2也成功在封闭了上转换纳米粒子上的非特异性结合位点。
同时，本专利就传感策略的可行性进行了证明。研究了GO@Fe3O4吸附特异性适配体的能力。在附图5中，未加入GO@Fe3O4的溶液上清液荧光强度约为120，再与GO@Fe3O4反应后，上清液荧光强度大幅度降低，表明标记有荧光染料的适配体吸附在GO@Fe3O4表面上，经过外部磁铁分离后，上清液中几乎没有残留的标记有荧光染料的适配体。以上结果表明适配体可以吸附在GO@Fe3O4上。
GO@Fe3O4的浓度对GO@Fe3O4与上转换纳米探针的结合效率有着较大影响，本发明研究了GO@Fe3O4浓度对上转换纳米探针荧光淬灭效率的影响，如附图6所示，为保证完全反应，GO@Fe3O4的最适浓度为0.60mg/mL。
上转换纳米探针与GO@Fe3O4的孵育时间也是影响上转换荧光的淬灭效率的关键因素。如附图7所示，最佳孵育时间为30分钟。
本发明对该传感策略的重复性进行了试验。方法如下：取五个浓度水平的大肠埃希菌溶液(103CFU/L，104CFU/L，105CFU/L，106CFU/L，107CFU/L)，每个浓度测3次，并计算相对标准偏差。测试结果如附图8所示，以上五个浓度水平的大肠埃希菌待检样品相对标准偏差分别为0.10％、1.27％、4.43％、7.90％、7.27％。结果表明该传感策略具有比较满意的重复性。
为了评估该传感策略对大肠埃希菌检测的分析性能，我们用一系列不同浓度的大肠埃希菌溶液对本策略进行了研究。根据103-107CFU/mL不同浓度细菌所检测到的荧光信号，如附图9所示，从图中可以看出，随着细菌浓度的增加，信号也跟着增加，当细菌浓度在103-107CFU/mL范围时，信号的增加与细菌浓度的对数有比较好的线性关系(附图10)，其回归方程为ΔIntensity＝25.38725Log C–66.29447，线性相关系数为0.94。检测限估计为467CFU/mL(C代表细菌浓度)。
为了评估所提出的荧光传感器的特异性，在相同的实验条件下检测了相同浓度(107CFU/mL)的不同菌株，包括鲍曼杆菌(b)、金黄色葡萄球菌(c)、铜绿假单胞菌(d)和混合组(e)。如附图11所示，这些非靶向菌株的检测信号与空白对照(a)基本相同。然而，当目标菌株大肠埃希菌存在时(e、f)可以检测到有显著的电流信号。这表明该生物传感器对大肠埃希菌具有较高的特异性。
本专利利用上转换纳米材料，结合荧光传感器技术，构建了一种快速灵敏检测体液样本中大肠埃希菌的新型荧光生物传感器。通过在荧光传感器的基础上，结合在复杂生物样本中发光性能稳定的上转换纳米粒子，以及具有大的比表面积能够负载大量检测探针并且可以通过磁性分离的氧化石墨烯@四氧化三铁复合纳米材料，能够有效地避免复杂生物样品的背景荧光信号的干扰以及纳米材料自身遮光效应的干扰，实现大肠埃希菌的快速灵敏检测。该新型荧光传感器具有较宽的检测范围(103-107CFU/mL)和较低的检出限(467CFU/mL)(s/n＝3)，并且可以在30分钟就完成样本中靶标大肠埃希菌的检测。同时，我们提出的这种检测策略，只需要改变捕获元件，就能实现其他生物靶点的检测，包括细胞、肿瘤标记物和其他细菌株等。结果表明，该荧光传感器在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是说明书摘要附图
图2是上转换纳米粒子的透射电镜图
图3是EDS元素分析结果
图4是Zeta电位分析结果
图5是GO@Fe3O4吸附适配体能力的验证
图6是GO@Fe3O4浓度对上转换纳米探针淬灭效率的优化
图7是上转换纳米探针与GO@Fe3O4孵育时间的优化
图8是在不同细菌浓度水平下的重复性结果图
图9不同浓度细菌的荧光恢复信号
图10是细菌浓度与荧光信号线性关系图
图11是传感策略的特异性试验
具体实施方式
一种基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)上转换纳米粒子的制备首先，将482.30mg的氯化钇(III)六水合物，155.00mg的氯化镱(III)六水合物和2.75mg的氯化铥(III)六水合物添加到装有18mL油酸和30mL 1-十八烯的烧瓶中，在氩气环境下加热至160℃并反应90分钟。待溶液冷却至室温后，将10mL含296.30mg氟化铵和200.00mg氢氧化钠的甲醇溶液加入烧瓶中，并在50℃下搅拌30分钟。随后将混合溶液加热至100℃并保持30分钟，以除去残留的甲醇。接下来，将溶液加热至300℃，120分钟后关闭反应。待溶液冷却至室温后，用乙醇洗涤三次，并分散在环己烷中。将溶解在环己烷中的上转换纳米粒子与乙醇混合，超声处理15分钟后，在10625×g下离心10分钟，去除上清液。然后，将沉淀物与盐酸溶液的混合并通过超声60分钟。接下来，将经盐酸处理的上转换纳米粒子用乙醇洗涤三次，以除去过量的酸。最后，将无配体的上转换纳米粒子分散在去离子水中。随后采用聚丙烯酸钠盐对上转换纳米粒子进行表面修饰。将无配体的上转换纳米粒子水溶液滴加到聚丙烯酸钠盐溶液中，在37℃下振荡过夜，转速为180rpm，用去离子水离心洗涤3次，去除未反应的聚丙烯酸钠盐。最后，将改性的上转换纳米粒子分散在去离子水中并保存在4℃冰箱里备用。
(2)适配体功能化上转换纳米探针的制备将改性后的上转换纳米粒子离心后，重悬在HEPES分散液中，向其中加入特异性大肠埃希菌适配体，在37℃的金属浴中振荡240分钟后，离心(10625×g)去除未反应的适配体。接下来，将适配体修饰后的上转换纳米粒子重悬在HEPES分散液中，并向其中加入mPEG-NH2，在37℃的金属浴中振荡120分钟后，以10625×g离心力离心洗涤2次，并重悬于HEPES分散液中。将分散液储存在4℃条件下保存。
(3)荧光传感器的制备取步骤(2)中得到的适配体功能化上转换纳米探针与GO@Fe3O4纳米复合物在37℃金属浴中反应30分钟，随后在外部磁铁的辅助下，弃去上清液。最后，加入HEPES分散液重悬，并储存在4℃条件下，以备将来使用。

Claims (10)

1.一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法包括以下步骤：
(1)上转换纳米粒子的制备 首先，将482.30mg的氯化钇(III)六水合物，155.00mg的氯化镱(III)六水合物和2.75mg的氯化铥(III)六水合物添加到装有18mL油酸和30mL 1-十八烯的烧瓶中，在氩气环境下加热至160℃并反应90分钟。待溶液冷却至室温后，将10mL含296.30mg氟化铵和200.00mg氢氧化钠的甲醇溶液加入烧瓶中，并在50℃下搅拌30分钟。随后将混合溶液加热至100℃并保持30分钟，以除去残留的甲醇。接下来，将溶液加热至300℃，120分钟后关闭反应。待溶液冷却至室温后，用乙醇洗涤三次，并分散在环己烷中。将溶解在环己烷中的上转换纳米粒子与乙醇混合，超声处理15分钟后，在10625×g下离心10分钟，去除上清液。然后，将沉淀物与盐酸溶液的混合并通过超声60分钟。接下来，将经盐酸处理的上转换纳米粒子用乙醇洗涤三次，以除去过量的酸。最后，将无配体的上转换纳米粒子分散在去离子水中。随后采用聚丙烯酸钠盐对上转换纳米粒子进行表面修饰。将无配体的上转换纳米粒子水溶液滴加到聚丙烯酸钠盐溶液中，在37℃下振荡过夜，转速为180rpm，用去离子水离心洗涤3次，去除未反应的聚丙烯酸钠盐。最后，将改性的上转换纳米粒子分散在去离子水中并保存在4℃冰箱里备用。
(2)适配体功能化上转换纳米探针的制备 将改性后的上转换纳米粒子离心后，重悬在HEPES分散液中，向其中加入特异性大肠埃希菌适配体，在37℃的金属浴中振荡240分钟后，离心(10625×g)去除未反应的适配体。接下来，将适配体修饰后的上转换纳米粒子重悬在HEPES分散液中，并向其中加入mPEG-NH2(甲氧基聚乙二醇氨)，在37℃的金属浴中振荡120分钟后，以10625×g离心力离心洗涤2次，并重悬于HEPES分散液中。将分散液储存在4℃条件下保存。
(3)荧光传感器的制备 取步骤(2)中得到的适配体功能化上转换纳米探针与GO@Fe3O4纳米复合物在37℃金属浴中反应30分钟，随后在外部磁铁的辅助下，弃去上清液。最后，加入HEPES分散液重悬，并储存在4℃条件下，以备将来使用。
2.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(1)中上转换纳米粒子合成必须在氩气氛围中进行。
3.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(1)中上转换纳米粒子合成过程中不能含有水。
4.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(1)中甲醇必须完全去除。
5.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(1)中盐酸的浓度为2.00mol/L。
6.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(1)中聚丙烯酸钠盐的浓度为10.00mg/mL。
7.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(2)中大肠埃希菌特异性适配体的浓度为10.00μmol/L。
8.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(2)中mPEG-NH2的浓度为200.00mg/mL。
9.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(2)和步骤(3)中HEPES的浓度为0.01mol/L,pH 7.5-8.0。
10.如权利要求1所述的基于UCNPs和GO@Fe3O4快速检测尿液样本中的大肠埃希菌的荧光生物传感器，其制备方法步骤(3)中GO@Fe3O4的最适浓度为0.60mg/mL，最佳孵育时间为30分钟。
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Bhaisare et al. Fluorimetric detection of pathogenic bacteria using magnetic carbon dots
Li et al. A long lifetime ratiometrically luminescent tetracycline nanoprobe based on Ir (III) complex-doped and Eu3+-functionalized silicon nanoparticles
Theron et al. Current molecular and emerging nanobiotechnology approaches for the detection of microbial pathogens
Amini et al. Fluorescence bio-barcode DNA assay based on gold and magnetic nanoparticles for detection of Exotoxin A gene sequence
Zhang et al. Aptamer-modified sensitive nanobiosensors for the specific detection of antibiotics
Zhang et al. Dual-color upconversion nanoparticles (UCNPs)-based fluorescent immunoassay probes for sensitive sensing foodborne pathogens
Yao et al. Fast detection of E. coli with a novel fluorescent biosensor based on a FRET system between UCNPs and GO@ Fe 3 O 4 in urine specimens
Du et al. Quantum dot: Lightning invisible foodborne pathogens
CN113514435A (zh) 一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器
Liu et al. A novel aptamer-mediated CuInS 2 quantum dots@ graphene oxide nanocomposites-based fluorescence “turn off–on” nanosensor for highly sensitive and selective detection of kanamycin
Xiao et al. A novel label-free strategy for pathogenic DNA detection based on metal ion binding-induced fluorescence quenching of graphitic carbon nitride nanosheets
Hu et al. A ratiometric electrochemiluminescent tetracycline assay based on the combined use of carbon nanodots, Ru (bpy) 3 2+, and magnetic solid phase microextraction
CN109813701A (zh) 一种快速无标签表面增强拉曼散射检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的方法
Sui et al. Ultrasensitive detection of Hg (II) through metal-enhanced fluorescence and hybridization chain reaction
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Li et al. Gold nanocluster-europium (III) ratiometric fluorescence assay for dipicolinic acid
Feng et al. Dual-modal light scattering and fluorometric detection of lead ion by stimuli-responsive aggregation of BSA-stabilized copper nanoclusters
Wang et al. A broad-range method to detect genomic DNA of multiple pathogenic bacteria based on the aggregation strategy of gold nanorods
Naja et al. Activation of nanoparticles by biosorption for E. coli detection in milk and apple juice
Tanabe et al. Simultaneous Optical Detection of Multiple Bacterial Species Using Nanometer-Scaled Metal–Organic Hybrids
CN109283333B (zh) 一种基于金壳-上转换手性二聚体对大肠杆菌耐药性定量分析的方法
Xiao et al. Simple and rapid co-freezing construction of SERS signal probes for the sensitive detection of pathogens
Li et al. Fluorescence signal amplification assay for the detection of B. melitensis 16M, based on peptide-mediated magnetic separation technology and a AuNP-mediated bio-barcode assembled by quantum dot technology
Liu et al. One-pot synthesis of strongly fluorescent DNA-CuInS2 quantum dots for label-free and ultrasensitive detection of anthrax lethal factor DNA

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