CN114058721B - 一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用，涉及食品安全检测技术领域；该制备方法包括以下步骤：使用水合稀土氯化物、1‑十八碳烯、油酸、NaOH和氟化铵等制备UCNPs‑OA，再对UCNPs‑OA进行改性，得到水溶性UCNPs‑COOH；根据致病菌种类选择特异性基因，设计纳米探针ssDNA，并对其进行氨基修饰，获得氨基功能化的DNA纳米探针；将水溶性UCNPs‑COOH与氨基化的DNA纳米探针通过缩合反应连接，获得所述上转换荧光识别探针。本发明结合了UCNPs稳定的发光特性、DNA纳米探针的特异性精准识别功能以及GOQDs优异的荧光猝灭性能，提高了检测的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用。
背景技术
食源性致病菌污染导致的食品安全事件频发，严重影响公众健康和全球经济发展。污染食品的主要致病菌有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等，常用的传统培养检测法虽然可靠且精确，但存在人工操作繁琐、耗时长(平均2-4天得到初步结果，7-10天确认结果)的缺陷，无法满足食品行业致病菌污染快速检测的需求；相对于传统培养检测法，免疫检测致病菌耗时短，但抗体制备成本高，活性易受温度、pH等因素的影响，致使其与致病菌亲和力弱。因此，开发一种低成本、快速、精准、灵敏的致病菌检测方法是食品产业发展所需，对于保障食品安全和维护消费者健康具有重要意义。目前基于荧光纳米材料和DNA纳米技术的致病菌分子检测方法尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种上转换荧光识别探针的制备方法及其产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明结合了UCNPs稳定的发光特性、DNA纳米探针的物种核酸碱基序列特异性精准识别功能以及GOQDs优异的荧光猝灭性能，提高了检测的灵敏度和特异性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种上转换荧光识别探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)水溶性荧光纳米材料的制备
使用水合稀土氯化物、1-十八碳烯、油酸、NaOH和氟化铵制备UCNPs-OA，再使用配体交换法对UCNPs-OA进行改性，得到水溶性上转换荧光纳米材料UCNPs-COOH；
(2)致病菌物种特异性DNA纳米探针的制备
根据致病菌种类选择特异性基因，运用分子生物学和DNA纳米技术设计具有物种核酸碱基序列特异性精准识别功能的纳米探针ssDNA，采用化学合成法制备并对其进行氨基修饰，获得氨基功能化的DNA纳米探针；
(3)上转换荧光识别探针的合成
将步骤(1)得到的UCNPs-COOH与步骤(2)得到的氨基化的DNA纳米探针通过EDC/NHS酰胺缩合反应连接，获得所述上转换荧光识别探针。
进一步地，所述水合稀土氯化物为YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O和ErCl3·6H2O组成的混合物。
进一步地，所述配体交换法的具体操作包括：将所述UCNPs-OA溶解在CHCl3和C7H8的混合液中，再加入聚丙烯酸钠盐溶液，剧烈搅拌反应。
进一步地，在步骤(2)中，所述特异性基因选自金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因、大肠杆菌O157:H7的紧密粘附素eaeA基因、鼠伤寒沙门氏菌上的表皮侵袭蛋白invA基因和单核细胞增生李斯特氏菌的内华素inlA基因中的一种。
进一步地，在步骤(2)中，所述ssDNA的序列长度在20nt到100nt之间。
进一步地，所述的氨基功能化DNA纳米探针，氨基修饰在DNA纳米探针的任何一端。
本发明还提供一种根据上述制备方法制备得到的上转换荧光识别探针。
本发明还提供上述上转换荧光识别探针在食品中致病菌的检测中的应用。
本发明还提供一种基于荧光纳米材料和DNA纳米技术的致病菌分子检测方法，利用上述的上转换荧光识别探针对致病菌进行检测。
进一步地，上述检测方法包括以下步骤：
(1)荧光生物传感系统的构建
将氧化石墨烯量子点GOQDs与所述的上转换荧光识别探针混合，得到荧光生物传感系统；
(2)建立定量分析模型
分别将不同浓度的致病菌物种特异性基因目标链序列加入到所述荧光生物传感系统中，采集上转换荧光光谱，运用标准曲线法建立定量分析模型；
(3)食品中致病菌的检测
提取食品样品的核酸，加入致病菌物种特异性基因引物，运用核酸扩增技术得到扩增产物，再将扩增产物加入到所述荧光生物传感系统中，采集上转换荧光光谱，结合步骤(2)建立的定量分析模型，计算检测值。
进一步地，所述的核酸扩增技术采用聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、单引物等温扩增技术(SPIA)、切口延伸扩增技术(NEAR)或链置换扩增技术(SDA)。
氧化石墨烯量子点GOQDs的紫外-可见吸收光谱与UCNPs的上转换荧光光谱存在重叠。此外，GOQDs(充当能量受体)与上转换荧光识别探针(充当能量供体)上的ssDNA之间通过π-π堆积和氢键相互作用，致使GOQDs附着在UCNPs表面，两者距离＜10nm，满足荧光共振能量转移条件，上转换荧光被猝灭。将上转换荧光纳米材料与DNA纳米探针连接制备荧光识别探针，行使捕获致病菌物种特异性序列功能；利用荧光识别探针的ssDNA与GOQDs之间的π-π堆积和氢键相互作用，致使GOQDs附着在UCNPs表面，两者距离＜10nm，满足荧光共振能量转移条件，上转换荧光被猝灭；目标链物种特异性基因存在时，DNA纳米探针与目标链序列完全匹配，GOQDs从UCNPs表面脱离，荧光恢复；采集上转换荧光光谱，运用标准曲线法构建致病菌的定量检测模型，以实现食品中致病菌的快速高灵敏精准检测。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明公开一种基于荧光纳米材料和DNA纳米技术的致病菌分子检测方法，通过合成荧光识别探针和GOQDs构建荧光生物传感系统，结合核酸扩增技术，实现食品中致病菌种类的快速定性判别。
2.运用构建的荧光生物传感系统建立荧光响应值与致病菌物种特异性基因目标序列浓度之间的定量检测模型，达到对致病菌低成本、快速、高灵敏、精准检测的目的。
3.本发明的方法具有良好的特异性，能区分致病菌物种特异性基因目标序列单碱基错配。
4.本发明集结UCNPs稳定的发光特性、DNA纳米探针的物种核碱基序列特异性精准识别功能以及GOQDs优异的荧光猝灭性能，提高了检测的灵敏度和特异性。本发明建立的一种基于荧光纳米材料和DNA纳米技术的致病菌分子检测方法对金黄色葡萄球菌能够精准识别并进行定量。该方法材料易于制备且成本低，检测范围广(10-17～10-11mol/L)，灵敏度高(检测限约在10-17mol/L)，检测速度快(1h内即可完成整个检测)，通用性好(通过改变特异性DNA纳米探针可以检测其他种类的致病菌)，优于现有的实时荧光PCR检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为UCNPs和GOQDs的表征图，其中A为UCNPs的透射电镜图，B为GOQDs的透射电镜图，C为UCNPs的X-射线衍射光谱图，D为GOQDs的傅里叶中红外光谱图；
图2为上转换荧光识别探针的荧光光谱和GOQDs的紫外-可见吸收光谱重叠图；
图3为不同浓度金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因序列的上转换荧光光谱图；
图4为不同浓度金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因序列的标准曲线图；
图5为构建荧光生物传感系统检测的特异性分析，A为该传感系统对nuc序列、完全不互补序列、单碱基错配序列和空白组的荧光响应光谱，B为nuc序列、完全不互补序列、单碱基错配序列和空白组在545nm处荧光强度响应对比。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
为了进一步验证本发明所构建方法对食品中致病菌检测的作用，本发明实施例仅以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特氏菌为例，但是本发明针对的致病菌不仅限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特氏菌。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特氏菌由北京北纳创联生物技术研究院提供。
实施例1
步骤一，制备氧化石墨烯量子点(GOQDs)：采用有机合成法获得尺寸约15nm的分散液；
步骤二，水溶性荧光纳米材料的制备：①油溶性上转换荧光纳米材料的制备(UCNPs-OA)：通过高温热分解法获得UCNPs-OA，具体如下：将ErCl3·6H2O(0.03mmol)，YbCl3·6H2O(0.17mmol)和YCl3·6H2O(0.8mmol)超声溶解在5mL甲醇中，加入7mL 1-十八碳烯和3mL油酸后移入烧瓶混合均匀。通入氮气并升温排尽空气与水分，待溶液搅拌至透明停止加热。逐滴加入甲醇溶解的2.5mmol NaOH与4mmol氟化铵混合液并持续磁力搅拌，随后升温排除装置中的甲醇和空气，接着持续升温至300℃，反应1h后停止加热，离心收集清洗获得纯净的UCNPs-OA。②水溶性上转换荧光纳米材料的制备：使用配体交换法改性。具体为将合成的30mg UCNPs-OA溶解在2mL CHCl3和3mL C7H8混合液中，接着加入聚丙烯酸钠盐溶液，剧烈搅拌过夜离心清洗得到水溶性上转换荧光纳米材料(UCNPs-COOH)；
步骤三，金黄色葡萄球菌特异性DNA纳米探针的制备：选取金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶nuc基因作为检测对象，运用分子生物学和DNA纳米技术设计纳米探针ssDNA，采用亚磷酰胺三酯合成法(包括脱保护、偶联、盖帽和氧化四步循环，参考文献“江湘儿.DNA合成技术与仪器研发进展概述”)制备并通过用5’端的氨基修饰基团取代5’端的羟基来进行5’NH2(CH2)6修饰，后经HPLC纯化、定量等合成后处理即获得氨基功能化的DNA纳米探针，即5’-NH2-(CH2)6-ACAGGCGTATTCGGTTTCAC-3’；
步骤四，上转换荧光识别探针的合成：将5mg UCNPs-COOH超声溶解在MES缓冲液中，加入15mg EDC和15mgNHS于4℃剧烈混合2h完成羧基的活化，接着加入263μL氨基化DNA纳米探针(100μM)通过EDC/NHS酰胺缩合反应连接，离心清洗后即得UCNPs-ssDNA；
步骤五，荧光生物传感系统的构建：将步骤一制备的600μL GOQDs(1mg·mL-1)与步骤四合成的200μLUCNPs-ssDNA(0.5mg·mL-1)混合，即为构建的特异性传感检测系统；
步骤六，致病菌分子检测方法的建立：分别将200μL不同浓度的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc目标序列(5’-GTGAAACCGAATACGCCTGT-3’)加入到特异性传感检测系统中，采集上转换荧光光谱(图3)，建立545nm处的荧光强度与nuc目标序列浓度之间的定量分析模型，结果显示在浓度为1×10-17到1×10-11mol·L-1的范围内，上转换荧光纳米材料在545nm的荧光强度F与Log(nuc目标序列浓度)呈线性关系，如图4所示，线性回归方程为F＝414.3Log Cnuc+10530，R2＝0.9919，最低检出限为0.98×10-17mol·L-1。
步骤七，乳制品中金黄色葡萄球菌的检测：以低脂巴氏杀菌牛奶为例，首先，将牛奶通过无菌膜过滤以去除污染菌群。接着，取上述牛奶10mL接种金黄色葡萄球菌ATCC29213，经培养后12000rpm离心3min浓缩菌体，提取其基因组DNA。运用核酸扩增技术(上游引物：5’-CGCCTGTACAACCATTTGGC-3’，下游引物：5’-TCTAGCAAGTCCCTTTTCCACT-3’)得到金黄色葡萄球菌特异性基因nuc序列，测其浓度并稀释，用作测试的背景浓度。在特异性传感检测系统中，分别加入浓度为0.20×10-13mol·L-1、0.40×10-13mol·L-1、0.60×10-13mol·L-1和0.80×10-13mol·L-1的靶标nuc标准品进行加标回收实验。结合线性回归方程和上转换荧光响应值，分别计算实际测出的浓度。测定结果如表1所示，本发明所构建方法对牛奶中金黄色葡萄球菌nuc基因的检测回收率在95.67％-101.69％之间，相对标准偏差为1.75％-3.18％。特异性分析如图5所示，本发明公开的方法具有良好的特异性，能够区分金黄色葡萄球菌nuc基因目标序列单碱基错配。
表1本发明所构建方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌nuc基因加标回收率的测定
实施例2
步骤一、二同实施例1；
步骤三，大肠杆菌O157:H7特异性DNA纳米探针的制备：选取大肠杆菌O157:H7紧密粘附素eaeA基因作为检测对象，设计纳米探针ssDNA，合成5’-NH2-(CH2)6-ATGCTAACGGTAAGGCAACCGTAACGTTGA-3’；
步骤四，上转换荧光识别探针的合成：采用EDC/NHS酰胺缩合反应将氨基化DNA纳米探针连接到UCNPs-COOH上获得UCNPs-ssDNA；
步骤五，荧光生物传感系统的构建：将步骤一制备的600μL GOQDs(1mg·mL-1)与步骤四合成的200μLUCNPs-ssDNA(0.5mg·mL-1)混合，即为构建的特异性传感检测系统；
步骤六，大肠杆菌O157:H7分子检测方法的建立：分别将200μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7的eaeA目标序列(5’-TCAACGTTACGGTTGCCTTACCGTTAGCAT-3’)加入到特异性传感检测系统中，采集上转换荧光光谱，建立特征峰处荧光强度与eaeA目标序列浓度之间的定量分析模型。
步骤七，鲜切水果中大肠杆菌O157:H7的检测：以鲜切西瓜为例，首先对西瓜进行清洗和消毒，接着切成小块并称取5g。然后接种大肠杆菌O157:H7，与0.1％缓冲蛋白胨水混合均质，低速离心取上清液进行富集分离后，双蒸水重悬。提取该菌基因组DNA。运用核酸扩增技术(上游引物：5’-AGGAACTGCAACTCTTGGGG-3’,下游引物：5’-CTGAAGTCATCTCCGCGGTT-3’)获得大肠杆菌O157:H7的eaeA基因序列，测其浓度并稀释，用作测试的背景浓度。在特异性传感检测系统中，分别加入浓度为0.20×10-13mol·L-1、0.40×10-13mol·L-1、0.60×10-13mol·L-1和0.80×10-13mol·L-1的靶标eaeA标准品进行加标回收实验。结合线性回归方程和上转换荧光响应值，分别计算实际测出的浓度。测定结果如表2所示，本发明所构建方法对鲜切西瓜中大肠杆菌O157:H7的eaeA基因的检测回收率在97.18％-103.12％之间，相对标准偏差为2.48％-4.36％。
表2本发明所构建方法检测鲜切西瓜中大肠杆菌O157:H7的eaeA基因加标回收率的测定
实施例3
步骤一、二同实施例1；
步骤三，单核细胞增生李斯特氏菌特异性DNA纳米探针的制备：选取单核细胞增生李斯特氏菌特有的内华素inlA基因作为检测对象，设计纳米探针ssDNA，合成5’-NH2-(CH2)6-GGAACACACCGCCTACAACA-3’；
步骤四、五同实施例2；
步骤六，单核细胞增生李斯特氏菌分子检测方法的建立：分别将200μL不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌inlA目标序列(5’-AGTGACAGGTTGGCTAAAGGTATAGCTTACTTCAT-3’)加入到特异性传感检测系统中，采集上转换荧光光谱，建立特征峰处的荧光强度与inlA目标序列浓度之间的定量分析模型。
步骤七，水产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测：以海鱼为例，称取5g海鱼样品，用无菌生理盐水清洗数次，将其置于生物安全柜中，使用紫外灯辐照灭菌以消除样品本身可能潜在的致病菌干扰。然后，加入PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)匀浆，再加入单核细胞增生李斯特氏菌ATCC 19115混匀。低速离心取上清液进行富集分离后，双蒸水重悬。接着，提取该菌基因组DNA。运用核酸扩增技术(上游引物：5’-TGCGTCACGGTTCCACTAAA-3’,下游引物：5’-AGCGATGGCGGTAGTTACAC-3’)得到单核细胞增生李斯特氏菌特异性基因inlA目标序列，测其浓度并稀释，用作测试的背景浓度。在特异性传感检测系统中，分别加入浓度为0.20×10-13mol·L-1、0.40×10-13mol·L-1、0.60×10-13mol·L-1和0.80×10-13mol·L-1的靶标inlA标准品进行加标回收实验。结合线性回归方程和上转换荧光响应值，分别计算实际测出的浓度。测定结果如表3所示，本发明所构建方法对海鱼中单核细胞增生李斯特氏菌的inlA基因的检测回收率在96.15％-102.19％之间，相对标准偏差为2.34％-3.17％。
表3本发明所构建方法检测海鱼中单核细胞增生李斯特氏菌的inlA基因加标回收率的测定
本发明通过将制备的致病菌物种特异性DNA纳米探针连接到水溶性荧光纳米材料上得到上转换荧光识别探针，然后与GOQDs混合构建荧光生物传感系统。将不同浓度的致病菌物种特异性基因目标序列加入到该传感系统中，收集其荧光光谱，以荧光强度为纵坐标，特异性基因目标序列浓度为横坐标构建该致病菌的检测标准曲线。最后对实际待测样品进行预处理，对所添加的致病菌提取全基因组并运用核酸扩增技术获得该致病菌特异性基因序列，加入构建的荧光生物传感系统中进行荧光测定。结合线性回归方程和上转换荧光响应值，计算实际测出浓度。本方法不仅能对实际待测食物样品中致病菌种类进行定性判别，还能通过获取的荧光强度值对其定量分析，实现致病菌低成本、快速、高灵敏、精准检测的目的，可应用于食品安全检测技术领域。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种基于荧光纳米材料和DNA纳米技术的致病菌分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)荧光生物传感系统的构建
将氧化石墨烯量子点与上转换荧光识别探针混合，得到荧光生物传感系统；
(2)建立定量分析模型
分别将不同浓度的致病菌物种特异性基因目标链序列加入到所述荧光生物传感系统中，采集上转换荧光光谱，运用标准曲线法建立定量分析模型；
(3)食品中致病菌的检测
提取食品样品的核酸，加入致病菌物种特异性基因引物，运用核酸扩增技术得到扩增产物，再将扩增产物加入到所述荧光生物传感系统中，采集上转换荧光光谱，结合步骤(2)建立的定量分析模型，计算检测值；
所述上转换荧光识别探针的制备方法，包括以下步骤：
水溶性荧光纳米材料的制备：使用水合稀土氯化物、1-十八碳烯、油酸、NaOH和氟化铵制备UCNPs-OA，再使用配体交换法对UCNPs-OA进行改性，得到水溶性上转换荧光纳米材料UCNPs-COOH；
致病菌物种特异性DNA纳米探针的制备：根据致病菌种类选择特异性基因，运用分子生物学和DNA纳米技术设计具有物种核酸碱基序列特异性精准识别功能的纳米探针ssDNA，采用化学合成法制备并对其进行氨基修饰，获得氨基功能化的DNA纳米探针；
上转换荧光识别探针的合成：将所述UCNPs-COOH与所述氨基功能化的DNA纳米探针通过EDC/NHS酰胺缩合反应连接，获得所述上转换荧光识别探针；
所述水合稀土氯化物为YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O和ErCl3·6H2O组成的混合物。
2.根据权利要求1所述的致病菌分子检测方法，其特征在于，所述配体交换法的具体操作包括：将所述UCNPs-OA溶解在CHCl3和C7H8的混合液中，再加入聚丙烯酸钠盐溶液，剧烈搅拌反应。
3.根据权利要求1所述的致病菌分子检测方法，其特征在于，所述特异性基因选自金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因、大肠杆菌O157:H7的紧密粘附素eaeA基因、鼠伤寒沙门氏菌上的表皮侵袭蛋白invA基因和单核细胞增生李斯特氏菌的内华素inlA基因中的一种。
4.根据权利要求1所述的致病菌分子检测方法，其特征在于，所述ssDNA的序列长度在20nt到100nt之间。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116908154B (zh) * | 2023-06-26 | 2024-02-20 | 江苏大学 | 一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102279172A (zh) * | 2011-03-20 | 2011-12-14 | 亓立峰 | 一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法 |
| CN103698308A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 天津师范大学 | 上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用 |
| CN104231335A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-24 | 南京大学 | 环糊精衍生物改性的上转换复合材料及其制法和用途 |
| CN104818325A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-05 | 上海大学 | 用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针及其制备方法 |
| CN108680545A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-10-19 | 绍兴文理学院 | 一种食源性致病菌现场快速检测方法 |
| CN111175266A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-19 | 厦门大学 | 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法 |
| CN111378722A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-07-07 | 江苏大学 | 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法 |
| CN112362875A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-02-12 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒 |
| CN112375561A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-19 | 中南民族大学 | 上转换荧光纳米探针及其应用 |
| CN113466201A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-01 | 江苏大学 | 一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法 |
| CN113484515A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-10-08 | 江苏大学 | 一种食源性致病菌的快速检测方法及系统 |
| CN113514435A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-10-19 | 重庆医科大学 | 一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器 |
-
2021
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Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102279172A (zh) * | 2011-03-20 | 2011-12-14 | 亓立峰 | 一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法 |
| CN103698308A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-02 | 天津师范大学 | 上转换纳米粒子与氧化石墨烯复合材料的制备方法与应用 |
| CN104231335A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-24 | 南京大学 | 环糊精衍生物改性的上转换复合材料及其制法和用途 |
| CN104818325A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-05 | 上海大学 | 用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针及其制备方法 |
| CN108680545A (zh) * | 2018-04-28 | 2018-10-19 | 绍兴文理学院 | 一种食源性致病菌现场快速检测方法 |
| CN111378722A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-07-07 | 江苏大学 | 一种基于CRISPR-Cas12g的特异性核酸片段纳米荧光痕量快速检测方法 |
| CN111175266A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-19 | 厦门大学 | 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法 |
| CN112375561A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-19 | 中南民族大学 | 上转换荧光纳米探针及其应用 |
| CN112362875A (zh) * | 2020-11-10 | 2021-02-12 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒 |
| CN113514435A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-10-19 | 重庆医科大学 | 一种基于UCNPs和GO@Fe3O4即时检测大肠埃希菌的荧光生物传感器 |
| CN113484515A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-10-08 | 江苏大学 | 一种食源性致病菌的快速检测方法及系统 |
| CN113466201A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-01 | 江苏大学 | 一种基于高灵敏荧光比色传感的致病菌快速检测方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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