MXPA03012075A - Metodos y oligonucleotidos para la deteccion de salmonela sp., e. coli o157:h7 y listeria monocitogenes. - Google Patents

Metodos y oligonucleotidos para la deteccion de salmonela sp., e. coli o157:h7 y listeria monocitogenes.

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Abstract

Se describe un metodo para detectar una especie de Salmonela, E. coli 0157:H7 o Listeria monocytogenes. El metodo implica amplificar una secuencia de nucleotidos genomica de una especie correspondiente y detectar el producto de amplificacion. Varios cebadores y sondas que pueden ser usados en el metodo se describen tambien. En una modalidad, la etapa de amplificacion del metodo se realiza por PCR de tiempo real y el producto de amplificacion se detecta por transferencia de energia de resonancia y fluorescencia usando un par de polinucleotidos etiquetados.

Description

METODOS Y OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA DETECCION DE SALMONELA SP.,E. COLI 0157 ;H7 Y LISTERIA MONOCITOGENES ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los estándares de salud y seguridad estatales y federales mandan que las compañías de servicios alimentarios industriales e instalaciones de fabricación realicen pruebas de rutina para bacterias comunes, tales como las especies de Salmonela, ?. coli 0157 :H7 y Listeria monocytogenes, que provocan enfermedades transportadas en alimentos . Como una precaución de seguridad, se requiere a las compañías realizar pruebas en cada lote o lote de alimentos antes a que el alimento alcance el público. Varios métodos son actualmente disponibles para pruebas industriales de bacterias en la industria de servicio alimentario. Sin embargo, hay actualmente varias limitaciones en las pruebas disponibles para la industria. Los métodos presentes utilizados como estándares industriales requieren 2-5 días para realizarse. Por ejemplo, los métodos usados más ampliamente para detección de Salmonela emplean un preenriquecimiento (día 1) , un enriquecimiento selectivo (día 2) , y un enriquecimiento final seguido por un inmunoensayo el cual requiere 105 organismos (día 3) , los métodos usados más ampliamente de detección de E.coli 0157 :H7 emplean un enriquecimiento selectivo (8-28 horas) y un inmunoensayo que REF:152985 requiere 105 organismos; los métodos usados más ampliamente de detección de Listeria monocytogenes emplean un preenriquecimiento (26-30 horas) , un enriquecimiento (22-26 horas), y un inmunoensayo el cual requiere 105 organismos. Para la detección de E. coli 0157 :H7 y Listeria monocytogenes, todas las muestras que se sospecha son positivas por el inmunoensayo deben ser confirmadas por métodos de cultivo (1-3 días para E. coli 0157 :H7 y 4-5 días para Listeria monocytogenes) . De esta forma, en muchos casos, los proveedores de alimentos deben esperar días para los resultados de las pruebas antes de transportar sus productos ya fabricados. Como un resultado, la compañía puede perder ganancias a partir de la vida media reducida y la espera también incrementa el potencial para la descomposición del alimento. Además, al usar métodos ahora disponibles en la técnica, el organismo necesita ser cultivado en una concentración de por lo menos 105/ml para ser detectado. Debido a que el margen de error de detectabilidad de la bacteria es alto, pueden resultar pruebas de negativos falsos y puede ocurrir el inicio de envenenamiento del alimento. La compañía es entonces forzada a retirar el producto que ya ha alcanzado al consumidor. Esto coloca al público en un gran riesgo de salud. El fabricante o productor está también forzado a súportar los costos del retiro, y está en un riesgo de ser demandado o que el gobierno le mande detener las instalaciones de producción. De esta forma hay una necesidad para una tecnología de prueba barata que proporcione un tiempo de turno rápido, y un alto grado de exactitud y reproducibilidad, lo cual resulta en una fabricación y preparación de alimentos más seguros. Adicionalmente , hay una necesidad para un método que mantenga la paz con los nuevos procesos de fabricación. La tecnología de prueba de reacción de cadena polimerasa (WPCR") para bacterias patogénicas transportadas en alimentos facilita la prueba rápida y exacta para los fabricantes. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para detectar las especies de Salmonela, E. coli 0157 :H7, o Listeria monocytogenes . El método implica amplificar una secuencia de nucleótidos genómica de una especie correspondiente y detectar el producto de amplificación. La presente invención también comprende cebadores y sondas que pueden ser usados en el método . Los cebadores y sondas pueden ser proporcionados en un equipo de detección. En una modalidad, la etapa de amplificación del método de la presente invención se realiza por PCR de tiempo real y el producto de amplificación se detecta por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia usando un par de oligonucleótidos etiquetados.
Es una característica de la presente invención que la región genómica a partir de la cual se amplifica la secuencia de nucleótidos esté implicada en virulencia bacteriana . Es una ventaja de la presente invención que el método de detección de bacterias sea sensible. Es otra ventaja de la presente invención que el método de detección de bacterias es rápido. Otros objetos, ventajas y características de la presente invención llegarán a ser aparentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a la detección de patógenos bacterianos en alimentos u otros materiales con mucho mayor sensibilidad y velocidad que lo hecho hasta ahora posible. Los cebadores han sido identificados los cuales permiten un tipo rápido y sensible de reacción de cadena polimerasa (PCR) para amplificar el ADN objetivo si, y solamente si, uno de los patógenos objetivo está presente en una muestra. Las sondas son también identificadas las cuales se enlazarán a los productos de ADN amplificados producidos otra vez si, y solo si, está presente el organismo. El método ha sido implementado para Salmonela, E. coli 0157 :H7, y isteria monocytogenes . Como se usa en la presente, un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico el cual puede o no puede ser idéntico a aquel de un ácido nucleico que se presenta en forma natural pero el cual se aisla a partir de un organismo huésped vivo. Cuando se usa "ácido nucleico aislado" para describir un cebador o una sonda, el ácido nucleico no es idéntico a la estructura de un ácido nucleico que se encuentra en forma natural que se expande por lo menos la longitud de un gen. En un aspecto, la presente invención se relaciona a los ácidos nucleicos que pueden ser usados como cebadores para amplificar un fragmento genómico aislado a partir de las especies de Salmonela, E. coli 0157 :H7 o Listeria monocytogenes para detectar las especies correspondientes. Tal ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos la cual contiene por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 (cebador 5' para la especie de Salmonela), SEQ ID NO: 2 (cebador 3" para la especie de Salmonela), SEQ ID NO: 5 (cebador 5" para E. coli 0157:H7), SEQ ID NO: 6 (cebador 3" para E. coli 0157:H7), SEQ ID NO : 9 (cebador 5" para Listeria monocytogenes) o SEQ ID NO: 10 (cebador 3' para Listeria monocytogenes) . Preferentemente, el ácido nucleico tiene una secuencia que contiene por lo menos 15 ó 18 nucleótidos consecutivos, y más preferentemente la longitud completa, de las secuencias identificadas anteriormente. En otro aspecto, la presente invención se relaciona a los ácidos nucleicos etiquetados que pueden actuar como sondas para facilitar la detección de un producto de amplificación de una especie Salmonela, E. coli 0157 :H7 o histeria monocytogenes, obtenidos usando los cebadores descritos anteriormente. Las sondas de ácido nucleico etiquetadas trabajan en pares. Una sonda en cada par está etiquetada en el extremo 3' y la otra sonda está etiquetada en el extremo 5". Cada par de sondas hibridiza a la misma cadena del producto de amplificación. Cuando se hibridiza al producto de amplificación, el nucleótido de extremo 3' de la sonda de ácido nucleico etiquetada en el extremo 3" y el nucleótido del extremo 5" de la sonda del ácido nucleico etiquetado en el extremo 5" es menor que seis nucleótidos aparte de tal forma que la transferencia de energía ocurre entre las dos etiquetas resultando en un cambio de intensidad de emisión de por lo menos una de las etiquetas . El cambio de intensidad de emisión indica la presencia del producto de amplificación. Las sondas de ácidos nucleicos etiquetados en cada par tienen secuencias de nucleótidos que contienen por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO : 13 (para la especie Salmonela) , el complemento de la SEQ ID NO: 13 (para la especie Salmonela), la SEQ ID NO: 14 (para E. coli 0157 :H7), el complemento de la SEQ ID NO: 14 (para E. coli 0157 :H7), SEQ ID NO: 15 (para Listeria monocytogenes), o el complemento de SEQ ID NO: 15 (para Listeria monocytogenes) . Preferentemente, los ácidos nucleicos etiquetados en cada par de sonda tienen secuencias de nucleótidos que contienen por lo menos 15 ó 18 nucleótidos de las secuencias identificadas anteriormente. Más preferentemente, los ácidos nucleicos etiquetados en cada par tienen el siguiente par de secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO : 4 (para la especie Salmonela) , el complemento de la SEQ ID NO : 3 y el complemento de la SEQ ID NO: 4 (para la especie Salmonela), SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 (para E. coli 0157:H7), el complemento de la SEQ ID NO : 7 y el complemento de la SEQ ID NO: 8 (para E. coli 0157:H7), SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 (para Listeria monocytogenes) , y el complemento de la SEQ ID NO: 11 y el complemento de la SEQ ID NO: 12 (para Listeria monocytogenes) . Cualquier par de moléculas de etiqueta que puedan sufrir transferencia de energía cuando se ubican cerca una de la otra (menos de 6 nucleótidos aparte en una secuencia de nucleótidos) para provocar un cambio en la intensidad de emisión en por lo menos una de las moléculas de etiquetado pueden ser usadas para hacer los ácidos nucleicos etiquetados descritos anteriormente. Un ejemplo de una molécula de etiquetado para un ácido nucleico en un par incluye, pero no se limita a, fluoresceína . Ejemplos de moléculas de etiquetado para el otro ácido nucleico en el par incluye pero no se limitan a LC RED 640 (Roche Lightcycler) , LC RED 705 (Roche Lightcycler) . En otro aspecto, la presente invención se relaciona a un equipo para detectar por lo menos una de las especies de Salmonela, E. coli 0157 :H7 y histeria monocytogenes. El equipo contiene un par de cebadores de ácido nucleico y un par de ácidos nucleicos etiquetados, como se describe anteriormente, para una, dos o las tres especies anteriores.
Otros reactivos para la amplificación de un ADN objetivo y la detección del producto de amplificación pueden también ser incluidos en el equipo . El equipo puede incluir también controles positivos y negativos para las especies anteriores.
El control positivo puede ser cualquier muestra que contiene un ADN objetivo a ser amplificado, incluyendo las mismas bacterias, en una cantidad sobre el límite de detección. El control negativo es una muestra que no contiene el ADN objetivo a ser amplificado. En otro aspecto, la presente invención se relaciona a un ácido nucleico aislado la amplificación del cual permite la detección de una especie de Salmonela, E. coli 0157 :H7 o Listeria. monocytogenes. Ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen aquellos que contienen la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15. En todavía otro aspecto, la presente invención se relaciona a un método para detectar una especie de Salmonela, E. coli 0157 :H7 o Listeria monocytogenes. El método implica amplificar un fragmento del ADN genómico especifico para las especies anteriores y detectar el producto de amplificación. Las secuencias únicas que pueden ser usadas para identificar una especie de Salmonela, E. coli 0157 :H7 o Listeria monocytogenes son el nucleótido 2314 al nucleótido 2047 (nucleótido 9 al nucleótido 243 de la SEQ ID NO: 13) de la región sipB-sipC del genoma de Salmonela (no. de acceso de GenBank U25631) , nucleótido 1185 al nucleótido 1532 (nucleótido 7 al nucleótido 354 de la SEQ ID NO: 14) del gen eae de E. coli 0157:H7 (no. de acceso de GenBank AF081182) , y nucleótido 2995 al nucleótido 3196 (nucleótido 9 al nucleótido 210 de la SEQ ID NO: 15) del operón internalin de Listeria monocytogenes (No. de acceso de GenBank AJ012346) . Cualesquiera fragmentos genómicos que contengan las secuencias anteriores pueden ser amplificados para detectar las especies anteriores. Dado lo que se describe en la presente, un técnico experto conoce cómo amplificar un fragmento que contiene una de las secuencias específicas anteriores y después detectar la presencia de un producto de amplificación que contiene la secuencia. Ejemplos de los cebadores que pueden ser usados en el método de la presente invención se describen anteriormente . Las secuencias genómicas amplificadas y detectadas con el método de la presente invención son a partir de regiones genómicas que están implicadas en la virulencia bacteriana. Las proteínas sip de la especie Salmonela y las proteínas internalin de Listeria monocytogenes son requeridas para la invasión celular; las proteínas EAE de E. colí 0157 :H7 son requeridas para separación y unión celular. De esta forma, el método de la presente invención detecta bacterias que alojan rasgos virulentos. Las cepas no patogénicas de estas especies no son un medio a ser detectado usando esta técnica. Se entiende que las secuencias específicas a especies actualmente amplificadas para realizar el método de la presente invención pueden variar algo a partir de las secuencias descritas anteriormente . Las variaciones pueden ser provocadas por errores de secuencias, variaciones específicas a cepas u algunas otras razones. El método de la presente invención intenta comprender estas variaciones . En una modalidad específica, se amplifica un fragmento del 7ADN genómico específico a una especie por PCR de tiempo real y se detecta el producto de amplificación por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia (FRET) usando ácidos nucleicos etiquetados descritos anteriormente como sondas de hibridación internas. En esta modalidad, las sondas de hibridación internas son incluidas en la mezcla de reacción de PCR de tal forma que ocurre la detección del producto en cuanto se forma el producto, además reduce el tiempo de procesamiento post-PCR. Pueden ser usados el instrumento Roche Lightcycler PCR (Patente de los Estados Unidos No. 5,174,670) u otros instrumentos de PCR de tiempo real en esta modalidad de la invención. La amplificación por PCR del ADN permite el incremento en la sensibilidad a menos de 101 organismos en comparación con 105 organismos en métodos de inmunodetección estándar actualmente usados . La amplificación y detección de PCR de tiempo real puede reducir el tiempo de ensayo total de tal forma que los resultados de pruebas pueden ser obtenidos dentro de 12 horas . La invención será más totalmente entendida ante consideración de los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLO 1 Detección de la especie de Salmonela Se pesa una muestra del producto alimenticio y se mezcla con agua de peptona amortiguada. La proporción del producto alimenticio a agua de peptona amortiguada es 25 a 225 (gramos a mi) . Se homogeniza mecánicamente entonces la mezcla y se incuba en 35 +/- 2°C. Después de seis horas de incubación, se remueven 15 mi de la mezcla y se centrífuga a 2,500 x g por 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y se vuelve a suspender el gránulo en 200 mi de TE. Se extrae entonces el ADN a partir de las bacterias usando ya sea el mini equipo Quiagen QIAamp (Qiagen Inc., Valencia, CA) o el equipo de extracción Biotecon foodproof® (Potsdam, Alemania) . Después, se realizan la amplificación y detección del PCR del producto de amplificación. Se diseñan los siguientes oligonucleótidos para proporcionar la amplificación por PCR de un producto de 250 pb que se expande de la base 2305 a la basé 2355 de la región sipB-sipB del genoma del genoma de Salmonela (no. de acceso de GenBank #U25631) : hacia delante 5 " -ACAGCAAAATGCGGATGCTT-3 ' (SEQ ID NO:l) e inversa 5 " -GCGCGCTCAGTGTAGGACTC-3 ' (SEQ ID NO : 2) . Además, se diseñan las sondas de hibridación internas para permitir la detección del producto de PCR por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia dentro del Roche Lightcycler. La secuencia y modificaciones de las sondas: corriente arriba 5^-GCAATCCGTTAGCGCTAAAGATATTCTGAATAGT-Fluorescein-3 ' (SEQ ID NO: 3) y corriente abajo 5'-LC RED64TTGGTATTAGCAGCAGTAAAGTCAGTGACCTGG-Phos-3 SEQ. ID NO: 4) . Estas sondas se diseñan para templar a la cadena superior de las posiciones 2464-2497 (corriente arriba) y 2499-2531 (corriente abajo) . Se realiza la optimización de la PCR entonces para permitir la amplificación y detección de tiempo real rápidos en el instrumento Roche Lightcycler PCR (Patente de los Estados Unidos No. 6,174,670). La amplificación por PCR del ADN llega a un incremento en la sensibilidad a menos de 101 organismos en comparación con 10s organismos en los métodos de inmunodetección de la técnica anterior estándar. Estas sondas de hibridación proporcionan un alto grado de especificidad y detección exacta de aislados de Salmonela. No se observan negativos falsos. Esta metodología de prueba detecta Salmonela en un intervalo de concentración de preenriquecimiento bajo de 10° organismos-101 organismos/ml por amplificación de ADN usando oligonucleótidos . Utilizando el Roche Lightcycler, el cual completa los ciclos en aproximadamente 30 minutos, en lugar de horas o durante la noche/ como en termociclos viejos, permite que se obtengan resultados de pruebas dentro de 12 horas . EJEMPLO 2 Detección de E. coli 0157 :H7 Se pesa una muestra del producto alimenticio y se mezcla con caldo de soya Trxpticasa modificado. La proporción del producto alimenticio a caldo de soya Tripticasa modificado es 25 a 225 (gramos a mi) . Se homogeniza mecánicamente entonces la mezcla y se incuba en 35 +/- 2°C. Después de seis horas de incubación, se remueven 15 mi de la mezcla y se centrífuga a 2,500 x g por 10 minutos. Se desecha el sobrenadante y se vuelve a suspender el gránulo en 200 mi de TE. Se extrae entonces el ADN a partir de las bacterias usando ya sea el mini equipo Quiagen QIAamp (Qiagen Inc., Valencia, CA) o el equipo de extracción Biotecon foodproof® (Potsdam, Alemania) . Después, se realizan la amplificación y detección del PCR del producto de amplificación. Se diseñan los siguientes oligonucleótidos para proporcionar la amplificación por PCR del genoma de un producto de 361 pb que se expande desde la base 1179 a la base 1539 del gen eae de E. coli 0157:H7 (no. de acceso de GenBank #AF081182) : hacia delante 5 " -TGGTACGGGTAATGAAAA-3 " (SEQ ID NO: 5) e inversa S" -aatagcctggtagtcttgt-3 " (SEQ ID NO: 6) . Además, se diseñan las sondas de hibridación internas para la detección del producto de PCR por transf rencia de energía de resonancia y fluorescencia dentro del Roche Lightcycler. La secuencia y modificaciones de las sondas: corriente arriba 5 '-CGCAGTCAGGGCGGTCAGA-Pluorescein-3' (SEQ ID NO: 7) y corriente abajo 5"-LR RED640 CAGCATAGCGGAAGCCAAA--Phos-3 ' (SEQ ID NO: 8) . Estas sondas se diseñan para templar a la cadena superior de las posiciones 1477-1495 (corriente arriba) y 1497-1516 (corriente abajo) . Se realice entonces la optimización de la PCR entonces para permitir la amplificación y detección de tiempo real rápidos en el instrumento Roche Lightcycler PCR (Patente de los Estados Unidos No. 6,174,670). La amplificación del PCR del ADN llega a un incremento en la sensibilidad a menos de 101 organismos en comparación con 105 organismos en los métodos de inmunodetección de la técnica anterior estándar. Estas sondas de hibridación proporcionan un alto grado de especificidad y detección exacta de aislados de E. coli 0157 :H7. No se observan negativos falsos. Utilizando el Roche Lightcycler, el cual completa los ciclos en aproximadamente 30 minutos, en lugar de horas o durante la noche, como en termo ciclos viejos, permite que se obtengan resultados de pruebas dentro de 12 horas . EJEMPLO 3 Detección de histeria, monocytogenes Se agregan doscientos veinticinco mi de caldo Fraser a una muestra de 25 gramos del producto alimenticio. Se digiere entonces la mezcla y se incube en 30°C. Después de ocho horas de incubación, se remueven 15 mi de la mezcla y se centrifugan a 2,500 x g por 20 minutos. Se desecha el sobrenadante y se vuelve a suspender el gránulo en 200 mi de TE. Se extrae entonces el ADN a partir de las bacterias resuspendidas usando ya sea el mini equipo Quiagen QIAamp (Qiagen Inc. , Valencia, CA) o el equipo de extracción Biotecon foodproof® (Potsdam, Alemania) . Después, se realizan la amplificación y detección del PCR del producto de amplificación. Se diseñan los siguientes oligonucleótidos para proporcionar la amplificación por PCR de un producto de 217 pb que se extiende desde la base 2987 a la base 3203 del operon internalin del genoma de Listeria monocytogenes-. hacia delante 5 " -ATTTAGTGGAACCGTGACGC-3 " (SEQ ID NO: 9) e inversa 5'-GATGTCATTTGTCGGCATT-3 " (SEQ ID NO : 10). Adem s, se diseñan las sondas de hibridación internas para permitir la detección del producto de PCR por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia dentro del Roche Lightcycler. La secuencia y modificaciones de las sondas son corriente arriba 5 "-AGCTAAGCCCGTAAAAGAAGGT-Fluorescein-3 " (SEQ ID NO: 11) y corriente abajo 5'-LC RED6 0-ACACATTTGTTGGTTGGTTTGATGCC-Phos-3 ' (SEQ ID NO: 12) . Estas sondas se diseñan para templar a la cadena superior de las posiciones 3098-3119 (corriente arriba) y 3121-3146 corriente abajo) . Se realiza la optimización de la PCR entonces para permitir la amplificación y detección de tiempo real rápidos en el instrumento Roche Lightcycler PCR (Patente de los Estados Unidos No. 6,174,670). Estas sondas de hibridación proporcionan un alto grado de especificidad y detección exacta de aislados de Listeria monocytogenes. No se observan negativos falsos. Utilizando el Roche Lightcycler, la cual completa los ciclos en aproximadamente 30 minutos, en lugar de horas o durante la noche, como en termociclos viejos, permite que se obtengan resultados de pruebas dentro de 12 horas . La presente invención no se propone para ser limitada a los ejemplos mencionados anteriormente, sino para comprender todas las modificaciones y variaciones que están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende por lo menos 12 nucleotidos consecutivos de una secuencia de nucleótido seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10.
  2. 2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende por lo menos 15 nucleotidos consecutivos de la secuencia de nucleotidos.
  3. 3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende por lo menos 18 nucleotidos consecutivos de la secuencia .de nucleotidos.
  4. 4. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10.
  5. 5. Un par de ácidos nucleicos etiquetados caracterizados porque: el primer ácido nucleico etiquetado comprende por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID NO: 13, el complemento de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, el complemento de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, y el complemento de la SEQ ID NO: 15 en la región del extremo 3', y la molécula de etiquetado en el extremo 3 " , y el segundo ácido nucleico etiquetado comprende por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de la misma secuencia de nucleótidos en la región del extremo 5', y la molécula de etiquetado dos en el extremo 5 " ; en donde cuando los dos ácidos nucleicos etiquetados hibridan al complemento de la secuencia de nucleótidos, el nucleótido en el extremo 3' del primer ácido nucleico etiquetado y el nucleótido en el extremo 5' del segundo ácido nucleico etiquetado se separan por menos de seis nucleótidos y por lo menos una de la molécula de etiquetado y molécula de etiquetado dos cambia la intensidad de emisión en una longitud de onda debido a la transferencia de energía entre las dos moléculas de etiquetado.
  6. 6. El par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el primer ácido nucleico etiquetado comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos y el segundo ácido nucleico etiquetado comprende por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la misma secuencia de nucleótidos .
  7. 7. El par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de etiquetado es fluoresceína, y la molécula de etiquetado dos se selecciona de LC RED 640 y LC RED 705.
  8. 8. El par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las secuencias de ácido nucleico de cada par se seleccionan de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO : 4 , el complemento de la SEQ ID NO: 3, el complemento de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, el complemento de la SEQ ID NO: 7, el complemento de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 11, y SEQ ID NO : 12 , y el complemento de la SEQ ID NO: 11 y el complemento de SEQ ID NO: 12.
  9. 9. Un equipo caracterizado porque comprende: un par de cebadores de polinucleotido y un par de sondas de polinucleotido etiquetadas seleccionadas del grupo el cual consiste de: (1) el par de cebadores son dos polinucleótidos los cuales comprenden por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO:l y SEQ ID NO: 2, respectivamente, y el par de sondas etiquetadas son el par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO : 13 ; (2) el par de cebadores son dos polinucleótidos los cuales comprenden por lo menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, y el par de sondas etiquetadas son el par de ácidos nucleicos etiquetados de la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleotidos es SEQ ID NO: 14, y (3) el par de cebadores son dos polinucleótidos los cuales comprenden por lo menos 12 nucleotidos consecutivos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, y el par de sondas etiquetadas son el par de ácidos nucleicos etiquetados de la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleotidos es la SEQ ID NO: 15.
  10. 10. El equipo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque por lo menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 9 y SEQ ID NO: 10 son por lo menos 15 nucleotidos consecutivos de estas secuencias.
  11. 11. El equipo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque por lo menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 son la longitud total de estas secuencias.
  12. 12. Un equipo caracterizado porque comprende: un ácido nucleico aislado el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1; un ácido nucleico aislado' el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2; un ácido nucleico aislado el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5; un ácido nucleico aislado el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico aislado el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 9; un ácido nucleico aislado el cual comprende por menos 12 nucleotidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10; un par de ácidos nucleicos aislados de reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleotidos es la SEQ ID NO: 13, un par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleotidos es la SEQ ID NO: 14, Y un par de ácidos nucleicos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5 en donde la secuencia de nucleotidos es la SEQ ID NO: 15.
  13. 13. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada de la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 14, y SEQ ID NO: 15.
  14. 14. Un método para detectar especies de Salmonela, E. coli 0157 :H7, o Listeria monocytogen.es caracterizado porque comprende las etapas de amplificar una secuencia de nucleótidos genómica la cual comprende el nucleótido 9 a nucleotido 243 de la SEQ ID NO: 13, el nucleótido 7 a 354 de la SEQ ID NO: 14, o nucleótido 9 a nucleótido 210 de la SEQ ID NO: 15, y detectar un producto de amplificación que contiene la secuencia de nucleótidos genómica . 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO:
  15. 15.
  16. 16. Un método para detectar una especie de Salmonela, E. coli 0157.-H7 o Listeria monocytogenes caracterizado porque comprende las etapas de amplificar una secuencia de nucleótidos de una especie correspondiente usando un par de polinucleotidos de conformidad con la reivindicación 9 como cebadores de PCR, y detectar un producto de amplificación.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos se amplifica por PCR de tiempo real y el producto de amplificación se detecta por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia usando un par de polinucleotidos etiquetados de conformidad con la reivindicación 5.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos se amplifica por PCR de tiempo real usando un par de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 11.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el producto de amplificación es detectado por transferencia de energía de resonancia y fluorescencia usando un par de polinucleótidos etiquetados de conformidad con la reivindicación 8.
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque los polinucleótidos etiquetados son incluidos y templados al producto de amplificación en la etapa de amplificación.
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la sensibilidad de detección es 50 bacterias o menos.
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