JPH0638759B2 - サルモネラ菌検査に用いるｄｎａプローブ及びそれを用いたサルモネラ菌の検出法 - Google Patents
サルモネラ菌検査に用いるｄｎａプローブ及びそれを用いたサルモネラ菌の検出法Info
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- JPH0638759B2 JPH0638759B2 JP1156054A JP15605489A JPH0638759B2 JP H0638759 B2 JPH0638759 B2 JP H0638759B2 JP 1156054 A JP1156054 A JP 1156054A JP 15605489 A JP15605489 A JP 15605489A JP H0638759 B2 JPH0638759 B2 JP H0638759B2
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- dna
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Description
【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、ヒトその他の動物または食品その他の製品に
由来する検体中のサルモネラ菌を検出するためのＤＮＡ
プローブ及びその検出法に関する。
由来する検体中のサルモネラ菌を検出するためのＤＮＡ
プローブ及びその検出法に関する。
（ロ）従来技術 サルモネラ菌の感染が原因となって起こる病気（サルモ
ネラ感染症）は腸チフス型と急性胃腸炎型とに大別され
るが、いずれの場合も血液、便、尿などの検体からサル
モネラ菌が検出されることが重要な診断項目となってい
る。また食品等の安全性を確認するうえにおいても、サ
ルモネラ菌検査は重要な検査項目である。
ネラ感染症）は腸チフス型と急性胃腸炎型とに大別され
るが、いずれの場合も血液、便、尿などの検体からサル
モネラ菌が検出されることが重要な診断項目となってい
る。また食品等の安全性を確認するうえにおいても、サ
ルモネラ菌検査は重要な検査項目である。
サルモネラ菌を検出するための最も一般的に使用される
試験方法は、まず検体をハーナーテトラチオン酸塩培地
等に接種し、18〜24時間、増菌培養を行った後、ＤＨＬ
寒天培地上で24時間、分離培養を行う。続いて、発生し
た黒色集落ついて、ＴＳＩ寒天およびＬＩＭ培地上で18
〜24時間培養して一次同定試験を行った後、血清学的検
査等を行ってサルモネラ菌の存在を確認する。
試験方法は、まず検体をハーナーテトラチオン酸塩培地
等に接種し、18〜24時間、増菌培養を行った後、ＤＨＬ
寒天培地上で24時間、分離培養を行う。続いて、発生し
た黒色集落ついて、ＴＳＩ寒天およびＬＩＭ培地上で18
〜24時間培養して一次同定試験を行った後、血清学的検
査等を行ってサルモネラ菌の存在を確認する。
（ハ）発明が解決しようとする課題 このような培養法を中心とした従来のサルモネラ菌の検
出方法には、以下の問題点がある。第一の問題点は、抗
生物などを用いて治療を行った後では検査できないこと
である。第二の問題点は検査結果が得られるまでに数日
以上の長時間を要することである。
出方法には、以下の問題点がある。第一の問題点は、抗
生物などを用いて治療を行った後では検査できないこと
である。第二の問題点は検査結果が得られるまでに数日
以上の長時間を要することである。
本発明は培養期間を大幅に短縮することにより、検査に
要する時間を短縮することを目的とする。検査期間の短
縮は、サルモネラ感染症の患者に対する迅速かつ適切な
治療を施すうえで、またサルモネラ菌の蔓延を未然に防
止するうえでも重要である。
要する時間を短縮することを目的とする。検査期間の短
縮は、サルモネラ感染症の患者に対する迅速かつ適切な
治療を施すうえで、またサルモネラ菌の蔓延を未然に防
止するうえでも重要である。
（ニ）課題を解決するための手段 本発明は、SzekelyとSimonがＪ．Bacteriol．（1983）
に発表したサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）
の、ａｒａ Ｃ遺伝子の塩基配列のうち、特許請求範囲
第１項（Ｉ）式で示される塩基配列がサルモネラ属の細
菌に特異的であることを見いだしたことに基づくもので
あり、（Ｉ）式及びそれに相補的な（II）式で示される
塩基配列を持つＤＮＡを検出することにより、検体中の
サルモネラ菌の検出を行う方法である。
に発表したサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）
の、ａｒａ Ｃ遺伝子の塩基配列のうち、特許請求範囲
第１項（Ｉ）式で示される塩基配列がサルモネラ属の細
菌に特異的であることを見いだしたことに基づくもので
あり、（Ｉ）式及びそれに相補的な（II）式で示される
塩基配列を持つＤＮＡを検出することにより、検体中の
サルモネラ菌の検出を行う方法である。
検出に用いるプローブ（Ｉ）式または（II）式で示され
る塩基配列を認識してハイブリダイズする部分と、それ
に結合した標識物質とから成る。
る塩基配列を認識してハイブリダイズする部分と、それ
に結合した標識物質とから成る。
ハイブリダイズ部分としては、（Ｉ）式または（II）式
で示される塩基配列と相補的な塩基配列を持つＤＮＡあ
るいはＲＮＡを用いることができるが、試薬の安定性か
らＤＮＡが望ましい。プローブＤＮＡの鎖長は、（Ｉ）
式及び（II）式に示した１９塩基に相補的な配列に必ず
しも限定されないが、不必要に長いプローブＤＮＡはサ
ルモネラ菌以外の細菌ＤＮＡに対する結合性が高まる危
険があるので望ましくない。プローブＤＮＡの製造方法
としては、サルモネラ菌のＤＮＡを制限酵素等で切断し
ても良いし、ジエステル法、トリエステル法、フォスフ
ァイト法、フォスフォルアマダイド法等を用いて化学的
に合成しても良い。
で示される塩基配列と相補的な塩基配列を持つＤＮＡあ
るいはＲＮＡを用いることができるが、試薬の安定性か
らＤＮＡが望ましい。プローブＤＮＡの鎖長は、（Ｉ）
式及び（II）式に示した１９塩基に相補的な配列に必ず
しも限定されないが、不必要に長いプローブＤＮＡはサ
ルモネラ菌以外の細菌ＤＮＡに対する結合性が高まる危
険があるので望ましくない。プローブＤＮＡの製造方法
としては、サルモネラ菌のＤＮＡを制限酵素等で切断し
ても良いし、ジエステル法、トリエステル法、フォスフ
ァイト法、フォスフォルアマダイド法等を用いて化学的
に合成しても良い。
プローブＤＮＡに結合させる標識物質としては、放射性
同位元素、蛍光剤、酵素、化学発光剤などを用いるとが
できる。標識方法としては、これらの物質をプローブＤ
ＮＡに直接結合させても良いし、アビジンや抗体などを
介して間接的に結合させても良い。
同位元素、蛍光剤、酵素、化学発光剤などを用いるとが
できる。標識方法としては、これらの物質をプローブＤ
ＮＡに直接結合させても良いし、アビジンや抗体などを
介して間接的に結合させても良い。
本発明のプローブは、コロニーハイブリダイゼーション
法やその他のハイブリッドＤＮＡ形成を利用する検査方
法に用いることができる。一般的には、細菌を破壊して
得られたＤＮＡをニトロセルロースやナイロンなどの膜
に固定した後、過剰量のプローブを加えてハイブリッド
を形成させる。細菌の破壊方法としては、アルカリ溶
液、界面活性剤、溶菌酵素などを用いることができる。
ＤＮＡを膜に固定する方法としては、約80℃でベイキン
グする方法や紫外線で固定する方法などを用いることが
できる。ハイブリッドを形成したプローブは膜に固定さ
れるが、ハイブリダイズしなかったプローブは洗浄によ
って除去される。
法やその他のハイブリッドＤＮＡ形成を利用する検査方
法に用いることができる。一般的には、細菌を破壊して
得られたＤＮＡをニトロセルロースやナイロンなどの膜
に固定した後、過剰量のプローブを加えてハイブリッド
を形成させる。細菌の破壊方法としては、アルカリ溶
液、界面活性剤、溶菌酵素などを用いることができる。
ＤＮＡを膜に固定する方法としては、約80℃でベイキン
グする方法や紫外線で固定する方法などを用いることが
できる。ハイブリッドを形成したプローブは膜に固定さ
れるが、ハイブリダイズしなかったプローブは洗浄によ
って除去される。
洗浄後、ハイブリダイズしたプローブの標識物質を検出
する。検出方法は標識物質の種類により異なる。放射性
同位元素で標識したプローブの場合は、シンチレーショ
ンカウンターその他の放射線測定機を用いたり、フィル
ムを感光させるオートラジオグラフィーの手法を用いて
検出することができる。プローブが蛍光物質を含む場合
は蛍光測定機を用いて、酵素で標識されている場合は酵
素活性を測定することにより、ハイブリッドＤＮＡの量
を測定できる。
する。検出方法は標識物質の種類により異なる。放射性
同位元素で標識したプローブの場合は、シンチレーショ
ンカウンターその他の放射線測定機を用いたり、フィル
ムを感光させるオートラジオグラフィーの手法を用いて
検出することができる。プローブが蛍光物質を含む場合
は蛍光測定機を用いて、酵素で標識されている場合は酵
素活性を測定することにより、ハイブリッドＤＮＡの量
を測定できる。
（ホ）実施例１ ＤＮＡプローブの合成 Salmonella typhimuriumのフラジェリン遺伝子の塩基
配列（Szekely and Simon，1983，Ｊ．Bacteriol．）
から、５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′の配列を選
び、それと同じ配列をもつオリゴヌクレオチド（プロー
ブＩ）および相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド
（プローブII）を化学合成した。すなわち、プローブＩ
とプローブIIはそれぞれ下記式で示される塩基配列を持
っている。
配列（Szekely and Simon，1983，Ｊ．Bacteriol．）
から、５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′の配列を選
び、それと同じ配列をもつオリゴヌクレオチド（プロー
ブＩ）および相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド
（プローブII）を化学合成した。すなわち、プローブＩ
とプローブIIはそれぞれ下記式で示される塩基配列を持
っている。
プローブＩ：５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′プロー
ブII：３′−CGAGTCTGCATACCGCCAT-５′化学合成は島津
ＤＮＡ合成機ＮＳ−１を用い、トリエステル法により行
った。合成したＤＮＡ断片の精製はＣ１８逆相カラムを
用いて行った。こうして得られたＤＮＡ断片をポリヌク
レオチドキナーゼを用いて、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰで標
識した。
ブII：３′−CGAGTCTGCATACCGCCAT-５′化学合成は島津
ＤＮＡ合成機ＮＳ−１を用い、トリエステル法により行
った。合成したＤＮＡ断片の精製はＣ１８逆相カラムを
用いて行った。こうして得られたＤＮＡ断片をポリヌク
レオチドキナーゼを用いて、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰで標
識した。
コロニーハイブリダイゼーション サルモネラ属細菌４株、他属の細菌１７株を用いてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡプローブの
特異性を試験した。
ニーハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡプローブの
特異性を試験した。
寒天平板培地上にオートクレーブ滅菌したニトロセルロ
ース膜をのせ、この上に試験菌株を発育させた。Mosley
ら（1980．Ｊ．Infect．Dis．）の方法に従って、０．
５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶菌してから中和し、乾燥
後、80℃で細菌ＤＮＡをニトロセルロース膜に固定し
た。この膜を１cm2当り１０６cpmのＤＮＡプローブを含
むハイブリダイゼーション液（６×SSC，５×Denhardt
液、１mM EDTA，100μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中で35
℃、１時間反応させた後、50℃及び55℃の１×SSCで５
分間、３回洗浄した。この膜を乾燥させた後、オートラ
ジオグラフィーを行いハイブリッド形成の有無を調べ
た。その結果を表１に示す。
ース膜をのせ、この上に試験菌株を発育させた。Mosley
ら（1980．Ｊ．Infect．Dis．）の方法に従って、０．
５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶菌してから中和し、乾燥
後、80℃で細菌ＤＮＡをニトロセルロース膜に固定し
た。この膜を１cm2当り１０６cpmのＤＮＡプローブを含
むハイブリダイゼーション液（６×SSC，５×Denhardt
液、１mM EDTA，100μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中で35
℃、１時間反応させた後、50℃及び55℃の１×SSCで５
分間、３回洗浄した。この膜を乾燥させた後、オートラ
ジオグラフィーを行いハイブリッド形成の有無を調べ
た。その結果を表１に示す。
表１に示すように、プローブＩ及びそれに相補的な塩基
配列を持つプローブIIは55℃の洗浄温度において、サル
モネラ属の細菌にのみハイブリダイズし、その他の細菌
とは反応しないことがわかる。
配列を持つプローブIIは55℃の洗浄温度において、サル
モネラ属の細菌にのみハイブリダイズし、その他の細菌
とは反応しないことがわかる。
実施例２ ＤＮＡプローブの合成 Salmonella typhimuriumのａｒａ Ｃ遺伝子の塩基配
列（Clarke，Ｐ．et al．Gene18、157−163（1982））
から、５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′の配列を選
び、それと同じ配列をもつオリゴヌクレオチド（プロー
ブＩ）および相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド
（プローブII）を化学合成した。すなわち、プローブＩ
とプローブIIはそれぞれ下記式で示される塩基配列を持
っている。
列（Clarke，Ｐ．et al．Gene18、157−163（1982））
から、５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′の配列を選
び、それと同じ配列をもつオリゴヌクレオチド（プロー
ブＩ）および相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド
（プローブII）を化学合成した。すなわち、プローブＩ
とプローブIIはそれぞれ下記式で示される塩基配列を持
っている。
プローブＩ：５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′プロー
ブII：３′−CGAGTCTGCATACCGCCAT−５′化学合成は島
津ＤＮＡ合成機ＮＳ−１を用い、トリエステル法により
行った。合成したＤＮＡ断片の精製はＣ１８逆相カラム
を用いて行った。こうして得られたＤＮＡ断片をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰで
標識した。
ブII：３′−CGAGTCTGCATACCGCCAT−５′化学合成は島
津ＤＮＡ合成機ＮＳ−１を用い、トリエステル法により
行った。合成したＤＮＡ断片の精製はＣ１８逆相カラム
を用いて行った。こうして得られたＤＮＡ断片をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰで
標識した。
コロニーハイブリダイゼーション サルモネラ属細菌４株、他属の細菌１７株を用いてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡプローブの
特異性を試験した。
ニーハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡプローブの
特異性を試験した。
寒天平板培地上にオートクレーブ滅菌したニトロセルロ
ース膜をのせ、この上に試験菌株を発育させた。Mosley
ら（1980．Ｊ．Infect．Dis．）の方法に従って、０．
５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶菌してから中和し、乾燥
後、80℃で細菌ＤＮＡをニトロセルロース膜に固定し
た。この膜を１cm2当り１０６cpmのＤＮＡプローブを含
むハイブリダイゼーション液（６×SSC，５×Denhardt
液、１mM EDTA，100μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中で35
℃、１時間反応させた後、50℃及び55℃の１×SSCで５
分間、３回洗浄した。この膜を乾燥させた後、オートラ
ジオグラフィーを行いハイブリッド形成の有無を調べ
た。その結果を表１に示す。
ース膜をのせ、この上に試験菌株を発育させた。Mosley
ら（1980．Ｊ．Infect．Dis．）の方法に従って、０．
５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で溶菌してから中和し、乾燥
後、80℃で細菌ＤＮＡをニトロセルロース膜に固定し
た。この膜を１cm2当り１０６cpmのＤＮＡプローブを含
むハイブリダイゼーション液（６×SSC，５×Denhardt
液、１mM EDTA，100μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ）中で35
℃、１時間反応させた後、50℃及び55℃の１×SSCで５
分間、３回洗浄した。この膜を乾燥させた後、オートラ
ジオグラフィーを行いハイブリッド形成の有無を調べ
た。その結果を表１に示す。
表１に示すように、プローブＩ及びそれに相補的な塩基
配列を持つプローブIIは55℃の洗浄温度において、サル
モネラ属の細菌にのみハイブリダイズし、その他の細菌
とは反応しないことがわかる。
配列を持つプローブIIは55℃の洗浄温度において、サル
モネラ属の細菌にのみハイブリダイズし、その他の細菌
とは反応しないことがわかる。
（ヘ）発明の効果 本発明のＤＮＡプローブは、サルモネラ菌ＤＮＡと特異
的に反応する性質を有しているため、各種の細菌が混在
している検体の中からでも容易にサルモネラ菌を検出す
ることができる。従って、従来の検出法には必要であっ
た細菌分離のための培養を行わずにサルモネラ菌を同定
することができ、検査期間を短縮することができる。ま
た抗生物質等で細菌が死滅した後においても、疾病の原
因菌を同定できる利点を有する。
的に反応する性質を有しているため、各種の細菌が混在
している検体の中からでも容易にサルモネラ菌を検出す
ることができる。従って、従来の検出法には必要であっ
た細菌分離のための培養を行わずにサルモネラ菌を同定
することができ、検査期間を短縮することができる。ま
た抗生物質等で細菌が死滅した後においても、疾病の原
因菌を同定できる利点を有する。
さらに本発明のＤＮＡプローブは配列が明らかな19個の
ヌクレオチドから成ることを特徴としており、従来、多
く用いられている数千個のヌクレオチドから成るプロー
ブに比べて、次のような利オチドから成るプローブに比
べて、次のような利点を有する。第一に、容易に化学合
成できるため安定した品質のプローブを製造することが
でき、また大量生産に適しているため製造コストを低減
できる。第二に、より高濃度で使用できるため、反応時
間を短縮することができる。第三に、プローブの全塩基
配列が明らかなため、例えば細菌に対する特異性を変え
ずに最適洗浄温度を変えるなどの機能変更を、新たなヌ
クレオチドを追加したり塩基配列に若干の変更を加える
ことにより容易に行える利点を有する。
ヌクレオチドから成ることを特徴としており、従来、多
く用いられている数千個のヌクレオチドから成るプロー
ブに比べて、次のような利オチドから成るプローブに比
べて、次のような利点を有する。第一に、容易に化学合
成できるため安定した品質のプローブを製造することが
でき、また大量生産に適しているため製造コストを低減
できる。第二に、より高濃度で使用できるため、反応時
間を短縮することができる。第三に、プローブの全塩基
配列が明らかなため、例えば細菌に対する特異性を変え
ずに最適洗浄温度を変えるなどの機能変更を、新たなヌ
クレオチドを追加したり塩基配列に若干の変更を加える
ことにより容易に行える利点を有する。
Claims (2)
- 【請求項１】サルモネラ菌ＤＮＡのうちの下記式（Ｉ）
で示される塩基配列及び（Ｉ）に相補的な塩基配列（I
I）にハイブリダイズするＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片
に標識物質を結合してなるＤＮＡプローブ。 ５′−GCTCAGACGTATGGCGGTA−３′ （Ｉ） ３′−CGAGTCTGCATACCGCCAT−５′ （II） - 【請求項２】請求項第１項に記載したプローブをサルモ
ネラＤＮＡとハイブリダイズする条件下で試料と接触さ
せ，ハイブリッドＤＮＡ複合体の存在を検出することに
より試料中のサルモネラ菌を検出する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-191490 | 1988-07-29 | ||
| JP19149088 | 1988-07-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02131598A JPH02131598A (ja) | 1990-05-21 |
| JPH0638759B2 true JPH0638759B2 (ja) | 1994-05-25 |
Family
ID=16275512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1156054A Expired - Lifetime JPH0638759B2 (ja) | 1988-07-29 | 1989-06-19 | サルモネラ菌検査に用いるｄｎａプローブ及びそれを用いたサルモネラ菌の検出法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5043264A (ja) |
| EP (1) | EP0355989B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0638759B2 (ja) |
| DE (1) | DE68919387T2 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2664614B1 (fr) * | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| AU2509592A (en) * | 1991-08-22 | 1993-03-16 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| EP0569578A1 (en) * | 1991-11-15 | 1993-11-18 | Amoco Corporation | Method of enhancing hybridization signals in growth media |
| US5340728A (en) * | 1992-12-09 | 1994-08-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction |
| WO1994025598A2 (en) * | 1993-04-26 | 1994-11-10 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Methods and compositions for salmonella-based vaccines |
| DE4337295A1 (de) * | 1993-11-02 | 1995-05-04 | Merck Patent Gmbh | Oligonukleotide für den Nachweis von Enterobacteriaceae |
| DE69433201T2 (de) | 1994-02-28 | 2004-07-29 | Shimadzu Corp. | Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien |
| US5853990A (en) * | 1996-07-26 | 1998-12-29 | Edward E. Winger | Real time homogeneous nucleotide assay |
| MXPA03012075A (es) * | 2001-06-22 | 2005-07-01 | Marshfield Clinic | Metodos y oligonucleotidos para la deteccion de salmonela sp., e. coli o157:h7 y listeria monocitogenes. |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ES2112824T5 (es) * | 1986-11-24 | 2008-03-01 | Gen-Probe Incorporated | Sondas de acidos nucleicos para deteccion y/o cuantificacion de organismos no virales. |
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1989
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Also Published As
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