JPH0420299A - 腸炎ビブリオ検出用オリゴヌクレオチドおよび腸炎ビブリオの検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業１′、の利用分野） 腸炎ビブリオ（ビブリオ・バラへモリティカス；　Ｖｌ
ｂｒｉｏ　　ａｒａｈａｅｍｏｌ　ｔｉｃｕｓ）は、細
菌性食中ｉ；ｔの原因菌として高い頻度で検出される病
原細菌の種である。本閑は広（海洋中に分布し、海産物
を多）ｉ（に摂取するわか国では牛、冒こ重要な病原菌
のってあり、特に夏季に木菌が原因の食中ｄＩ′が多発
している。

従って腸炎ビブリオの４Ｇｊｉ　＋−１１、同定は金品
産業、公衆衛生、臨休検査分野に於て重要であり、１１
つ食中１１ｊという性格」・、迅速な測定が望まれてい
る。

本発明は腸炎ビブリオ検出用のオリゴヌクレオチド及び
これを用いた腸炎ビブリオ検出法に関する。史に詳しく
は食品または生体試料中の腸炎ビブリオ由来のＤＮＡま
たはＲＮＡの検出のためのオリゴヌクレオチド及びこれ
を用いた腸炎ビブリオ検出法に関する。

（従来の技術） 腸炎ビブリオは＋９５０（ｌに１１木で発見された病原
細菌である。木閑には溶面現象を示すものがあるこきが
知られている。我友（ワガッ７）寒天培地ｊ−て菌集落
周囲に形成される、このβ溶面現象は神奈１現象と呼ば
れている。患者ド痢便から分離される腸炎ビブリオ゛を
検査した場合、９Ｂ〜９９％が神奈川現象陽性を示す。

一方海水や−・般の魚介類なと環境から分離した腸炎ビ
ブリオの９９％までは神奈川現象陰性である。このこと
は神奈川現象が病原性腸炎ビブリオ検出の良い指標とな
ることを示している。

これまで本閑の検出および同定は、食品または／１体試
料なとより調製した試料をアルカリ性ペプトン水ての増
菌培羨、ＴＣＢＳ寒大培地等による分−１培養の後、我
妻寒天培地における神奈川現象による判定と名人な時間
と労力を冴していた。また使用する血液のロット差等に
より検１１１精度に安定性を欠くことか多かった。

近年の研究により、神奈川現象は腸炎ビブリオ（ビプリ
訃パラへモリティカス；Ｖｊｂｒｊｏ　　　ａｒａｈａ
ｅｍｏｌ　　Ｈｃｕｓ）が菌体外に放出する耐熱性溶血
、Ｂ素（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ　１ｅｄｉｒｅｃｔ　ｈ
ｅｍｏｌｙｓｉｎ、ＴＤＨと略ずことかある）により起
こる現象であるこきが判明し、腸炎ビブリオの最も重ｉ
友な病原因ｒとして２１［１されている。また史に近年
、神奈川現象陰↑１１てありながら病ｊ重性を小す菌株
の中からＴＤ）ｌに類似した溶白市素（ＴＤ）ｌｒｅｌ
ａｔｅｃｌ　Ｉ＋ｅｍｏｌｙｓｉｎ、ＴＲＨと略すこ七
がある）を産生する菌株も分離された。このＴＲ）ｌ産
生株の検出には特別な血液寒天培地か必要である。

従って病原性腸炎ビブリオの検出には我妻寒天培地１−
での神奈川現象測定だけでは不１・分であり、ＴＲＨ産
生株の検出のために特別な血液寒天培地での検査も同時
に実施する必・冴があり検査が煩卸化する。

食中ｄｔ１食品検査など迅速な原因究明、対処を姿求さ
れる分野に於て、このように名人な時間と労力を要する
測定法は問題であり、短時間で正確に測定出来る検査法
が望まれている。

一方、腸炎ビブリオが有するＴＤＨおよびＴＲＨの遺伝
子配列はジャーナル・オブ・バタテリオロジ−（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ；１６２巻
５５８頁１９８５年）及びインフェクション・アンド・
イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ；５７巻２６９Ｉ頁１９８９年）に開示されて
いる。これらのｔ１＃素は既にいずれもクローニングさ
れ、それぞれの溶曲山素活性を１．５つだ蛋白質が大腸
菌において発現されている。また−；ｊ素上白質の化学
的、遺伝ｒ−工学的修飾実験により、Ｎ末端より８９番
「１のＴｒｐ８１１および１１４１０００　ｌ　ｙ　ｌ
　１４が７ｂ素活性発現のために必須のアミノ酸残基で
あることも判明している。

病原性腸炎ビブリオを検出するには、その病因となる溶
血有索の遺伝子であるＴＩ））Ｉ遺伝子及び／またはＴ
ＲＨ逍伝遺伝検出すればよいことが考えられる。更にこ
れらの、ｔｔ素活性に必須な部位をコードしている遺伝
子配列を検出するこきでより確実に活性毒素産生性の腸
炎ビブリオを検出できる。

既に旧５ｈｌｂｕｃＩら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣＩ
Ｃｌ１ｎｉｃａｌｌｊｌｊｃｒｏｂｌｏｌｏ、２３．　
＋０９１，１９８ｆｉ、）により神奈川現象陽性腸炎ビ
ブリオを検出するオリゴヌクレオチドプローブについて
の報告はある。本報告は合成したオリゴヌクレオチド（
１９ヌクレオチド〜２１ヌクレオチド）を用いて神奈川
現象陽性腸炎ビブリオを検出している。

核酸プローブや核酸ブライマーは・般に、長鎖のポリヌ
クレオチドを用いた場合、遺伝子の存在を容易に知るこ
とかできる。このような長鎖ポリ一 ヌクレオチドでは、核酸プローブと検ｔＴｈされる核酸
との間の塩基配列の相同性が８θ％以ｌ−であれば陽性
として検出される。しかし、検査される菌株が対象とす
る遺伝ｒは自しているものの、その中に突然変異や小部
分の欠失か存在する場合、そのような小さなミスマツチ
を検出することはできない。・方、短鎖のオリゴヌクレ
オチドを用いた場合、小さなミスマツチをも検出できる
か、鎖長が短かすぎると他の生物にも同しヌクレオチド
配列を持つものが存在し、［−１的の病原菌に対する特
異性が失われてしまう。

従って短鎖のオリゴヌクレオチドを用いて目的の病原菌
のみを検出できる核酸プローブや核酸プライマーを調製
することは、配列が既知の遺伝子であっても必ずしも達
成できるものではない。

方、病原菌を検出しようとする場合、安価に・定の品質
の核酸プローブ及び核酸プライマーを得ようとすると短
鎖のオリゴヌクレオチドを化学合成法により調製するこ
とが容易であり好ましい。そこで我々は短鎖て１１つ病
原性腸炎ビブリオにのみ反応するオリゴヌクレオチドの
研究を鋭意行なった結果、本発明のオリゴヌクレオチド
が病原性腸炎ビブリオ及びＴＤＨ、ＴＲ）ｌ類似遺伝子
をもつ近縁のビブリオ属菌にのみ特異的に反応すること
を見いたした。

（問題点を解決する手段） 本発明は病原性腸炎ビブリオを特異的に検出するオリゴ
ヌクレオチドを提供する。

本発明はまた核酸交雑（ハイブリダイゼーシ珂ン）を利
用して病原性腸炎ビブリオの測定を迅速、簡便に実施す
ることを１１Ｊ能とする病原性腸炎ビブリオに特異的な
核酸プローブを提供する。

さらに本発明は、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素を用
いて病原性腸炎ビブリオの遺伝子増幅や核酸配列解析を
行なう際の核酸プライマーを提供する。

すなわち本発明は、 核酸配列が ５　’　−ＣＣＣＣＧＧＲＲＣＲＧＡＲＧＡＧＡＲＡＲ
ＲＧＲＲ−３’または ５’−ＣＧＧＲＣＡＲＲＣＲＧＣＲＧＲＧＲＲＧＧＩ？
ＡＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシルを表す。

）またはそれらの相補鎖である腸炎ビブリオ検出用オリ
ゴヌクレオチド、および 核酸配列が ５　’−ＲＣＣＡＧＧＲＲＣＧＧＡＲＧＡＧＣＲＡＣＲ
ＡＲＲ−３＋１５　’−ＣＡＧＧＣＲＣＡＡＡＡＲＧＧ
ＲＲＡＡＧＣＧＣＣＲ−３’または ５　’−ＲＧＧＣＣＲＲＲＣＡＡＣＧＧＲＣＲＲＣＡＣ
ＡＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシ
ン、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシルを表す。

）またはそれらの相補鎖である腸炎ビブリオ検出用オリ
ゴヌクレオチドおよび ｌ１記腸炎ビブリオ検出用オリゴヌクレオチドを標識化
し、得られた標識核酸プローブを試料中のＤＮＡまたは
ＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体の標識を測定するこ
とを特徴とする試料中の腸炎ビブリオの検出法、および
１・、記腸炎ビブリオ検出用オリゴヌクレオチドをその
まま核酸プライマーとす一 るか、または標識化して青られた標識核酸プライマーを
試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸
長させ、得られた結合体の標識を測定することを１、〜
徴とする試料中の腸炎ビブリオの検出法である。

本発明は具体的に核酸配列がＴＤＨ遺伝子検出のために
、 ａ）　　５’−ＣＣＣＣＧＧＲＲＣＲＧＡＲＧＡＧＡＲ
ＡＲＲＧＲＲ−３’または ｂ）　　５’−ＣＧＩＧＲＣＡＲＲＣＲＧＣＲＧＲＧＲ
ＲＣＧＲＡＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシル
を表す。）の配列およびそれらの相補鎖の配列を有する
ことを特徴きするオリゴヌクレオチド、核酸プローブ及
び核酸プライマーとして示される。

本発明はまた核酸配列かＴＲＨ逍伝了検出のために、 ａ）　　５’−ＲＣＣＡＧＧＲＲＣＧＧＡＲＧＡＧＣＲ
ＡＣＲＡＲＲ−３’１ｂ）　　５’−ＣＡＧＧＣＲＣＡ
ＡＡＡＲＧＧＲＲＡＡＧＣＧＣＣＲ−３’または ｃ）　　５’−ＲＧＧＣＣＲＲＲＣＡＡＣＧＧＲＣＲＲ
ＣＡＣＡＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃは
シトシン、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシルを
表す。）の配列およびそれらの相補鎖の配列を有するこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド、核酸プローブ及び
核酸プライマーとして示される。

またこれらの核酸の−・部が修飾され、または抗原、ハ
プテン、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質などに
より標識され、または遺伝情報中に欠失変兇あるいは点
変異が存在するオリゴヌクレオチド、核酸プローブ及び
核酸プライマーであってもよい。

これらの核酸プローブ及び核酸プライマー用のオリゴヌ
クレオチドの調製は公知の方法により実施することが可
能である。化学的合成法は安価に１１つ短期間に　定の
品質をもった核酸が調製出来るために　般的に用いられ
ている。これらは例えばＡＢＩネｔ：　（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）のＤＮＡシンセ
サイザー３９１型を用いてホスホアミダイト法により合
成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネ
ート法、チオホスファイト法等か知られている。また生
物学的起源、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物から
ｉｊ　１ｊｌ）することも出来る。

オリゴヌクレオチドの標識は核酸プローブや核酸プライ
マーの標識化のための公知の方法によって実施すること
ができる。このような標識物質としては例えば′Ｐや’
Ｈによる放射性物質、蛍光物質や発光物質や酵素基質あ
るいはそれらの前駆体、酵素、抗体、抗原、ハプテン、
ビオチンなどの生理活性物質あるいはラテックス粒−ｒ
のような不溶性担体であってもよい。例えば特表昭ＧＯ
−５００７１７号公報に開示の方法によりリンカ−を有
するオリゴヌクレオチドのリンカ一部分にアルカリ性ホ
スファターゼを結合させた酵素標識プローブを用いるこ
とが出来る。

それらの検出はそれぞれに適した・般的な方法により実
施することができる。例えば蛍光測定、発光測定、吸光
度測定、包布の沈着、凝集反応、沈澱反応などがある。

これらの技術は、例えばアルカリ↑１１ボスフ、・ター
ゼならば、４−メ千ルウンベリフェリルリン酸を基質と
して生成する４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定
する、またブロムクロロインドリールホスフェートを基
質として生成したブロムクロロインドールにニトロブル
ーテトラゾリウム 測定するなどの方法がある。

次に本発明の核酸プローブを用いて病原性腸炎ビブリオ
を測定する方法について具体的に述べる。

病原性腸炎ビブリオの存在が疑われる一ド痢患者の糞便
や感染源と推定される食物などから直接またはその培養
物より核酸を分離する。続いて核酸を変性させ、本発明
の核酸プローブを添加する。この核酸プローブは、予め
・木箱に変性された標的核酸の相補的配列とのみ水素結
合を介して二重鎖を形成する。標的核酸の変性は煮沸に
よる変性、またはル基性媒体中でインキュベートするな
ど公知の方法を用いることができる。

反応した核酸プローブと未反応の核酸プローブは公知の
方法で分離することができる。例えばＴｒｉ）Ｉ瑣伝ｒ
を測定する場合、検出用核酸プローブとは異なる配列の
オリゴヌクレオチドを担体に固定した捕捉用核酸プロー
ブとして使用するサンドイッチ測定法をもちいれば容易
に分離することができる。これらの検出用核酸プローブ
と捕捉用核酸プローブとを用いるサンドインチ測定法の
技術は、例えば特開昭５　８　−　４　０　０　９　９
　弓公報に示されている。

この場合標的となる二本鎖核酸のうちの−・方の核酸鎖
に相補的１つ＋Ｊｌ他的な核酸配列を標識及び捕捉用プ
ローブとして用いる様に設計しておくことはｄうまでも
ない。核酸プローブと標的核酸が形成した二重鎖の検出
は核酸プローブに標識された標識物質をその標識物質に
適した種々の方法で実施することができる。

次に本発明の核酸プライマーを用いて病原性腸炎ビブリ
オを測定する方法について述べる。核酸増幅法（ＰＣＲ
）を行なうに際して、・方のプライマーとして本発明の
核酸プライマーを用いることにより病原性腸炎ビブリオ
のみを増幅することが可能となる。従って増幅された核
酸を種々の方法で確認すれば病原性腸炎ビブリオのイＮ
＋を検出することができる。例えば増幅反応後、電気泳
動により特定の長さの核酸のバンドを見ることが確認で
きるし、史に増幅反応の際放射性元素標識のデオギ／リ
ボヌクレオチド（ｄＡＴＰ　、ｄＣＴＰ　、ｄＧＴＰ　
、ｄＴＴＰなと）を適（，１−加えておけばより感度良
く測定できる。また増幅産物を他の核酸プローブで検出
することも可能である。核酸ブライマーに標識を導入す
ることも＋ｉｆ能である。すなわちＤＮＡポリメラーゼ
反応を阻害することのないような種々の標識を核酸ブラ
イマーに導入することができる。例えば放射性同位元素
、ビオチン、ハプテン、蛍光物質、発光物質、酵素基質
等低分子の標識を核酸ブライマーの５′末端側に標識し
てもＤＮＡポリメラーゼを阻害することなく　ＰＣＲを
実施できることか知られている。二つのプライマーを二
種の標識物質で標識しておき、一方を担体に結合したレ
セプターで捕捉すれば、ＰＣＲにより増幅が起こる、す
なわち病原性腸炎ビブリオがイｒイ１した時のみ他方の
標識物質が１１１体に捕捉されこれを測定することで容
易に病１ｓ：ｉ性腸炎ビブリオを検出することかできる
。捕捉される標識物質としてビオチン、担体に結合した
レセプターとしてアビジン、ストレプトアビジン知られ
ている。

また本発明の核酸ブライマーを用いて病原性腸炎ビブリ
オの核酸配列を決定することができる。

すなわち本核酸ブライマーを−・種用いてＤＮＡポリメ
ラーゼにより［−１的核酸を鋳型としてシーケンシング
を行えば病原性腸炎ビブリオが存在する時のみ反応が起
こる。サンガー法によるシーケンシングを実施し、電気
泳動をおこなえば容易に病原性腸炎ビブリオの核酸配列
を測定することができる。

前述のように核酸ブライマーを標識することもできるし
、放射性同位元素で標識したデオキシヌクレオチドを添
加して標識を導入することもできる。

こうして病原性腸炎ビブリオの核酸配列を比較すれば配
列中に突然変異、欠失なとが存在する場合容易に解析す
ることができる。このような核酸配列の変化が食中市゛
の患者と汚染源と考えられる食品の両者から検出された
ならばｌＩｔ染の因果関係をより明確に推定することも
＋＋Ｊ能となる。

（実施例） 以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが
本発明はこれらに限定されるものではない。

尚、実施例中”ｎｘＳＳＣ”は０．３Ｍクエン酸３ナト
リウムおよび３．０Ｍ塩化ナトリウム混合液の（　２０
／ｎ）倍希釈液をあられす。

天．ｌＬ二」−〔リンカ−アームを有するＴＤＨ検出用
のオリゴヌクレオチドの合成〕 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプ
ライド　バイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダ
イト法により合成した。

塩基配列は５’−ＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＸＡＧＡＴ
ＡＴＴＧＴＴ−３’　テある。配列中Ｘは５位にリンカ
−アームを有するウリジンをしめす。この５位にリンカ
−アームを何するウリジンは、特表昭Ｈ−５００７１７
　”；ｊ公報に開示された合成法によりデオキシウリジ
ンから化学合成により調製しオリゴヌクレオチドに導入
した。

合成されたオリゴヌクレオチドは２７％アンモニア水で
５５℃、４時間脱保護処理を施した後、陰イオン交換高
速液体クロマトグラフィーＭ　ｏ　ｎ　ｏ　−　ＱＦＰ
ＬＣ（ファルマシア社）を用いて精製した。

０、２７ｚＪスケールの合成を行ない約１１．５Ａ２１
．。

（２［ｉｏｎｍにおける吸光度より求めた絶対量）のオ
リゴヌクレオチドをｔすた。

人ｊ１例仝−２−〔リンカ−オリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識〕実施例１で合
成したオリゴヌクレオチドと、そのリンカ−アームを介
してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文献（　
Ｎｕｃｌｅｌｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１４．
６１１５，１９８６）に従って行なった。

リンカ−オリゴヌクレオチド１．Ｏ　Ａ２０（１を０．
２ＭＮａＨＣＯ．、　ＧＯμＱに溶解し、ここヘスベリ
ン酸ジスクシニミシル（ＤＳＳ）　１．２５ｍｇを加え
て室温、２分間反応させた。反応液を１ｍＭ　ＣＩ：＋
ＣＯＯＮａ（ｐ）１５　、０）で平衡化したＳｅｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−２５（）７・ルマシアネ］）カラム（１ｃ
ｍφＸ３０ｃｍ）でゲル〜過して過剰のｌ′ＩＳＳを除
去した。

＝　１　８ 末端のアミン基が活性化されたリンカ−オリゴヌクレオ
チドを、史にモル比で２倍等ｈ１のアルカリ性ホスファ
ターゼ（ベーリンガーマンハイム社）（１００ｍＭ　Ｎ
ａ、ＨＣＯ，、、３Ｍ　ＮａＣＱに溶解したもの）と室
温、１６時間反応させることでアルカリ性ホスファター
ゼ標識核酸プローブを得た。

得られた標識プローブは、陰イオン交換高速液体クロマ
トグラフィーＭｏｎｏ−Ｑ　ＦＰＬＣ（ファルマシア社
）を用いて精製した。標識プローブを含む両分を集め、
セントリコン３０Ｋ（アミ７７社）を用いて限外濾過法
により濃縮した。

実ｍ工〔アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブの
感度の検討〕 実施例２で得られたアルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブの感度を検討した。

この検討には、既に培養法（神奈川現象等）、免疫沈降
法、ＥＬ　ＩＳＡ法によりｉ３ｊ素産牛性が同定されて
いる腸炎ビブリオ菌株３１株（ＴＤＨ産牛産生６株、Ｔ
ＲＩＩ産１１株１５株）を用いた。

各菌株を３％ＮａＣＱを含むプレインハートインフコ−
ジョン培地（Ｂｒａｉｎ　１（ｅａｒｔ　１ｎｆｕｓｊ
ｏｎ　Ａｇａｒ）に接種し３７℃で一晩培養した。牛ｆ
’ｆ　したコロニをそれぞれ１．５ｍ（＋のエッペンド
ルフチューブにかきとり、希釈緩衝液（０，ＩＭ　Ｎａ
Ｈ２ＰＯ，ｓ、ｐＨ７，０）３００μＱに懸濁した。さ
らにここへブロテイナーゼＫ（ナカライテスクネｌ）　
ｏ、ｅ　ｍｇ、溶菌液（８Ｍ尿素、０．２５％ドデンル
硫酸すｌ・リウム、０．２５％ラウリルサルコシンナＩ
・リウム、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６）Ｇｏｏ　
ＨｒＱを加えて撹拌し、６０°Ｃで３０分間インキュベ
ートした。

得られた溶解液をフェ／−ルで２回、クロロホルムで１
回抽出後、エタノール沈澱し、核酸を得た。核酸は２Ｇ
ＯｎｍのＵＶ吸収により定ＩＬ１００μｇ／ｍＱの１度
でＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｙｓ−ＨＣＱ、　、Ｉｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０）に溶解した。この核酸液１０μＱ（核酸１
μｇ）に０．３Ｎ　ＮａＯＨＩ　００　ＩＪＱを加え室
ｌ晶で１５分間変性し、ドツトブロック−（ＢＲＬ社）
を用いて５ＸＳＳＣで湿潤シたＪ−イロン膜（ンーン・
スクリーン・プラス。

ＮＥＮ−デュポン＋１）にプロットした。

この膜を８０°Ｃ３０分間加熱処理して核酸を固定化し
た後、以ドに７１＜シた手順でハイブリダイゼーション
を行った。

乾燥した膜（９Ｘ　９　ａｍ　）を５ＸＳＳＣに５分間
浸した。次にハイブリダイゼーションバンク（ＢＲＬ社
）に膜を移し、ハイブリダイゼーションバッファー（５
Ｘ　ＳＳＣ，０，５％つ／＋ｆｎ清アルブミン、０．５
％ポリビニールピロリドン、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ノ、）５１ＴＩＱを加えてポリンーラーでシールし５０
℃■５分間プレハイブリダイゼーションを行なった。

次に２５０ｎｇのアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブ液を含むハイブリダイゼーションバンクｙ５Ｊで
５０℃１５分間ハイブリダイゼーシＨンを行なった。

膜をポリバッグから取り出し、洗浄液−１（ＩＸＳＳＣ
，１％ドデンル硫酸ナトリウム）で５０℃、５分間で２
回、振とう洗浄した。更に洗浄液−２（１，Ｘ　ＳＳＣ
，１％トリトンＸ　−１００）で５０℃、５分間で２回
、室２＾１（５分間で２回振とう洗浄した。最後に洗γ
争７１−３　（１，Ｘ５ＳＣ）で室温５分間で２回振と
う洗浄した。

膜を新しいハイブリダイゼーションバンクに移し、基質
液（０，ＩＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣ（！、、　０．ＩＭ　Ｎ
ａＣ（！、　、０．１ＭＭｇＣＱ、　２．０．３　ｍｇ
　／　ｍ０ニトロブルーテトラゾリウム、０．３　ｍｇ
　／　ｎ＋Ｑブロムソロロインドフェリールホスフェー
））７．５ｍｆ！を入れポリンーラーでノールし３７℃
で３時間インキュベートした。

アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫色色素のスポ
ットを１−１視により判定した。

結果は、ＴＤＨ産生産生株１申 産生株１申 疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法の結果とよく　一致した。

実］！ｉＪＬ二１２〔アルカリ性ホスファターゼ標識核
酸プローブの特異性の検討〕 実施例２で得られたアルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブの特異性を検討した。

腸炎ビブリオと同層のビブリオ属の菌１２種と、腸炎ビ
ブリオと同様にド痢起炎菌となりうる細菌１３種、ウィ
ルス１種、ヒト胎盤由来のＤＮＡ　、およびヒト健常便
＋ｌｔ来のＤＮＡを用いてクロスハイブリタイセーン・
「ンの１１厘を調へた。

細菌は全て臨床分−１株を用い、適当な培地で増殖させ
、実施例３と同様の方法で核酸を精製した。

ウィルスは、感染便よりウィルス拉ｒを精製し、同様の
方法で核酸を精製した。

得られた核酸ｌ１１ｇを実施例３と同様の手順で測定し
た。

結果はＴＤＨｐに生性腸炎ビブリオとＴＤＨ類似逍伝ｒ
を有する３種類のビブリオ属菌のみか陽性であった。こ
の結果は、″′Ｐ−標識逍伝了断片プローブ（クローニ
ングしたＴＤＨ構造遺伝子を、制限酵素ＴａｑＩ　−Ｎ
ｄｅＩで処理して得られたＤＮＡ断片。

３５９ｔ＋ｐテＴＤＨ構造逍伝Ｊ’　（７）　７２．５
％　ヲ占メル。）を用いた結果とよく　・致した。第１
表にその結果をｉ■く　ず　。

以ド余白 ’７　　−　　（ＴＲＨ測定用プローブの感度の検討〕
ＴＲＨ用核酸プローブを実施例１及び２と同様の方ｌ去
で調製した。

塩基配列は ５　’−ＴＣＣＡＧＧＴＴＣＧＧＡＸＧＡＧＣＴＡＣＴ
ＡＴＴ−３’である。

本核酸プローブを用いて実施例３で得た核酸試料の測定
を行なった。

結果は、ＴＤＨ産生株Ｉ６株中陽性０株、ＴＲＨ産牛産
生５株中陽性１５株で培養法（血液寒天培地における溶
血現象等）免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法の結果とよく　一
致した。

実Ｊｌ！ｉＪＬ二喝ユ［：　ＴＤＨ用核酸プライマーを
用いたＰＣＲの検討〕 ＴＤＩＩ用核酸ブライマーを実施例１と同様の方法で調
製した。

塩基配列は ５　’−ＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴＴ
ＧＴＴ−３＋、および５　’　−ＣＧＧＴＣＡＴＴＣＴ
ＧＣＴＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴ−：］　’である。

この二つの核酸プライマーを用いて耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーセ（Ｔａｑ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ベーリンガー
社）によりＴＤＨ遺伝子の増幅を行なった。

反応液組成を以ドに示す。

１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　（ｐＨ８，３）５０ｍＭ
　　ＫＣＱ １．５　ｍＭ　　ＭｇＣ０，２ ０，０１％　ゼラチン ２００　μＭ　ｄＡＴＰ ２００　μＭ　ｄＣＴＰ ２００　μＭ　ｄＧＴＰ ２００　μＭ　ｄＴＴＰ １０μＱ　試料 １μＭ２種のブライマー Ｉｎ１ＯＯμＱ ここで試料とは実施例３て調製したＴＤＨａｌＢ株を用
いた。ＤＮＡザーマルザイクラ−（パーキンエルマー・
シータス＋１）を用いて３０勺イクルのＰＣＲを行なっ
た。その後、８Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲルて
電気泳動し、合成されたＤＮＡを確　６一 認した。結果はどの試料も２　ｔｉ　３　ｍ　ｅ　ｒ　
（ｉｊ近に−・本のバンドが見られ増幅か行われたこと
を示していた。

光胤猾二Ｊ［ＴＲＨ用核酸プライマーを用いた核酸配列
測定の検討］ ＴＲＩ（用核酸プライマーを実施例１と同様の方法で調
製した。

塩基配列は ５　’　４ＧＧＣＣＴＴＴＣＡＡＣＧＧＴＣＴＴＣＡＣ
ＡＡＡＡＴ　−３’である。

このプライマー０．５ｐｍｏ　ｌｅｓを用いてＭ１３シ
ーケンシングキット（東洋紡績社）によりＴＲＨ株の核
酸配列を決定した。

キット添付のプライマーの代わりに本ブライマーを用い
、Ｍ　＋３ｉｐ１８５ｓＤＮＡの代わりに臨床検体から
分離したＴＲＨ株（培養法にてＴＲＨ産牛産生認してい
る）より抽出した核酸を用いてキットの取扱説明占に従
ってグイレクトシーケンンングを行ない、約１００塩基
の塩基配列を決定した。シーケンソングの結末を以Ｆに
示す。

ＧＣＣＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴ
ＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡ
ＧＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＣＧＴＡＴＴ
ＴＧＧＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＴＡＴ−３’ １−〔従来法との比較〕 Ｎ１５ｈｌｂｕｃＩら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌＭｉｃｒＣ１１ｎｉｃａ１，２３．１０旧、
１９８Ｇ、）により示された核酸プローブと本発明の核
酸プローブを比較した。

旧５ｈｌｂｕｃｈｉらの核酸プローブとして一ド記の配
列の核酸プローブを実施例１と同様の方法で調製した。

神奈川現象陽性腸炎ビブリオを検出するオリゴヌクレオ
チドプローブについての丁Ｒ）Ｉ用核酸ブライマーを実
施例−１及び２と同様の方法で調製した。

５　’　−ＣＣＡＴＣＴＧＴＣＣＣＸＴＴＴＣＣＴＧＣ
Ｃ−３’（式中Ｘは実施例−１，２と同様にリンカ−ア
ームのついたウリジンをボす。） ハイブリダイゼーション、ｌ先順の７Ｍ度は種々検討の
結果、５０℃を選択した。

実施例−３の腸炎ビブリオ菌株３１株（ＴＤＩ（産生株
１６株、ＴＲＨ産生株１５株）を用いて実施例−３と同
様の方法で測定した。

ナイロン膜を乾燥し、牛じた色素のスボ、ソトを色彩色
差、４ＬＣＲ−２２１（ミノルタカメラ株式会社）を用
いて測定した。測定モードは△（Ｌ　”ａ”ｂ”）モー
ド（△Ｅ”ａｂ）を用いた。実施例−３の結果も同様に
比較した。結果を第２表に示すが、本発明のほうが反応
性が高いことがわかる。

第２表 （発明の効果） 本発明により特異ｆ／Ｉの高いプローブをｔｑることか
できた。ＴＲＩ（遺伝子を検出するオリゴヌクレオチド
については、未だ開発されておらず本発明によって初め
て１１能となった。

本発明のオリゴヌクレオチドに標識をつけた核酸プロー
ブを用いれば、病原性腸炎ビブリオ及びＴＤＨ、ＴＲＩ
類似逍伝遺伝もつ近縁のビブリオ属菌のみが容易に検出
てきる。

また本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、核酸増幅法（ＰＣＢと略すことがある）を実施すれ
ば、病原性腸炎ビブリオ及びＴＤＨ、ＴＲＨ類似遺伝遺
伝もつ近縁のビブリオ属菌のみが増幅される。従ってこ
の増幅した核酸を測定することで容易に病原性腸炎ビブ
リオ及びＴＤＨ、ＴＲＨ類似遺伝子をもつ近縁のビブリ
オ属菌のみが検出できる。

一般にＰＣＢを実施する場合、核酸プライマーは二種必
要であるが、本発明のプライマーを二種のうちとちらか
一方に使用することで特異的に測定出来る。もちろん二
種共に本発明のオリゴヌクレオチドのうちそれぞれ異な
るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてもかま
わない。

また本発明の核酸ブライマーを用い、ＤＮＡポリメラー
ゼや逆転写酵素を用いて病原性腸炎ビブリオ及びＴＤＨ
，ＴＩ？Ｉ＋類似逍伝ｒをもつ近縁のビブリオ属菌の核
酸配列解析を行なうことが容易に実施できる。

’Ｌ’Ｆ　＋ｉＱ出願人 東洋紡績株式全相 ■

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）核酸配列が ５’−ＣＣＣＣＧＧＲＲＣＲＧＡＲＧＡＧＡＲＡＲＲＧ
   ＲＲ−３’または ５’−ＣＧＧＲＣＡＲＲＣＲＧＣＲＧＲＧＲＲＣＧＲＡ
   ＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン
   、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシルを表す。）
   またはそれらの相補鎖である腸炎ビブリオ検出用オリゴ
   ヌクレオチド。
2. （２）核酸配列が ５’−ＲＣＣＡＧＧＲＲＣＧＧＡＲＧＡＧＣＲＡＣＲＡ
   ＲＲ−３’、５’−ＣＡＧＧＣＲＣＡＡＡＡＲＧＧＲＲ
   ＡＡＧＣＧＣＣＲ−３’または ５’−ＲＧＧＣＣＲＲＲＣＡＡＣＧＧＲＣＲＲＣＡＣＡ
   ＡＡＡＲ−３’（ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン
   、Ｇはグアニン、Ｒはチミンまたはウラシルを表す。）
   またはそれらの相補鎖である腸炎ビブリオ検出用オリゴ
   ヌクレオチド。
3. （３）第１項または第２項に記載される腸炎ビブリオ検
   出用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸
   プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交
   雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中
   の腸炎ビブリオの検出法。
4. （４）第１項または第２項に記載される腸炎ビブリオ検
   出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとす
   るか、または標識化して得られた標識核酸プライマーを
   試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸
   長させ、得られた結合体の標識を測定することを特徴と
   する試料中の腸炎ビブリオの検出法。