JPH02295498A - サルモネラヒト病原の検出のための核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サルモネラ（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉ　ａ）ヒト！原
を検出することができる核酸プローブをここに記載する
。ブローブは、サルモネラの病原に含まれるタンパク質
因子、ことに房ｌ型タンパク質をエンコードする遺伝子
のヌクレオチド配列から発生される。

本発明は、要約すれば、次の通りである：サルモネラヒ
ト病原を検出することができる核酸プローブをここに記
載する。ブローブは、サルモネラの病原に含まれるタン
パク質因子、ことに房ｌ型タンパク質をエンコードする
遺伝子のヌクレオチド配列から発生される。プローブの
最も好ましい長さは、約２０〜約１００ヌクレオチド塩
基の長さの範囲である。ブローブは高度に特異的であり
、そしてヒトに対して病原性であるサルモネラ有機体の
検出に対して感受性である。こうして、それらは下痢の
試料中に感染の検出において臨床的に有用である。さら
に、それらは食物に含まれるサルモネラ、ヒトにおける
ほとんどのサルモ不ラ症の病原因子、の検出において使
用することができる。

サルモネラ属からの有機体は、ヒトにおいて起こるバク
テリアの下痢の場合の大部分の原因である。典型的には
、サル七不ラの感染のスクリーニングおよび同定は、微
生物の培養技術および引き続く生化学的試験により達成
される。これは１〜３日を要し、時には曖昧な結果をも
って終わる。

ＤＮＡプローブを使用するアッセイによるサルモネラ種
の同定は、臨床医にとって激しい労力が少なく、不明瞭
でない結果をもたらし、そしてサルモネラ症のより速い
診断を可能とするであろう。

核酸のハイブリダイゼーションの技術は、診断工業にお
いて新しいアプローチである。この方法は、有機体に対
して独特である配列がそのゲノムを構成する性質を利用
する。ハイブリダイゼーション試験において、検出可能
な標識で標的する核酸プローブとバクテリアまたはウイ
ルスの標的陽性のシグナルがハイブリダイゼーションす
るとき、陽性のシグナルが発生する。米国特許第４，６
８９．２９５号（Ｔａｂｅｒ　　ｅｔ　　ａｔ．）は、
既知のサルモ不ラ種の８０％以上と共通のサルモネラＤ
ＮＡ断片である、サルモネラＤＮＡプローブを記載して
いる。断片は、病原性に寄与することが知られているタ
ンパク質または他の物質の遺伝情報を指定しない。こう
して、ブローブは、遺伝機能に無関係に断片のライブラ
リーから構成され、そして食物試料中のサルモネラの存
在を検出するために主として使用される。

米国特許第４．３５８．５３５号（ＦａｌｋｏＷ）は、
微生物を含有する試料からの遺伝子物質を不活性支持体
へ取り付け、そして試料を処理して遺伝子物質を一本鎖
とすることによって、ＤＮＡプロープを使用する、微生
物を検出する方法を記載している。次いで、固定した物
質は、微生物により産生される毒素の遺伝情報を指定す
る構造遺伝子のヌクレオチド配列に対して実質的に相補
的である、標識したヌクレオチド配列と接触させる。Ｅ
．ｃｏｌｉはこの特許において例示された唯一の有機体
であるが、サルモネラは毒素産生微生物のラウンドリー
リスト（ｌａｕｎｄｒｙ　　１ｉｓｔ）に述べられてい
る。

米国特許第４．４８６，５３９号および米国特許第４．
５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ　　６ｔａｔ．）は、同
定すべき微生物のゲノムから分離されｔ；、明確な一本
鎮核酸断片を有する試薬を使用する、１工程のサンドイ
ッチハイブリダイゼーション技術を記載している。これ
らの断片は、広範囲にわたる配列の相同性を有するが、
ゲノム中に密に一緒に位置する。サルモネラ属からの微
生物による感染からのヒト病原性に含まれることができ
る、タンパク質のビルレンス因子の遺伝情報を指定する
特定の遺伝子は述べられていない。

ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ）およびヤノフスキ−（Ｙａ
ｎｏ　ｆ　ｓｋｙ）　、プロシーデインダス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔ　Ｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、Ｖｏｌ．７６、
Ｎｏ．ＩＯ、ｐｐ．５２７７−５２４８　（Ｏｃｔ．１
９７９）は、サルモ不ラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびＥｓｃ
ｈｅ　ｒ　ｉ　ｃｈ　ｉ　ａｃｏｌｉのｄのヌクレオチ
ド配列を記載しており、そして２つを進化的に比較して
いる。

ＤＮＡプロープとしてこれらの配列を使用することた述
べられている。

ストレル（Ｓｔｏｌｅｒｕ）　　　ｅｔ　　ａｌ．、ケ
ミカル・アブスッラクッ（ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒ
ａｃｔｓ）、８５：９００５３ｂ　（１９７６）は、サ
ルモネラのサブグループＩＶおよび他の密接に関係する
有機体の菌株の間のポリヌクレオチドの分岐を記載して
いる。ここで再び、ＤＮＡプローブのために配列を使用
することを述べている。

本発明の核酸プローブは、ヒト病原性引き起こすサルモ
ネラ属、ことにその属のサブグループ１、２、３ａ，お
よび３ｂ，および６に属する微生物からの核酸に対して
独特であると信じられる。前記分順は、ジョージア州ア
トランタにおいて病気の抑制のセンター（ｔｈｅ　　Ｃ
ｅｎｔｅｒ　　ｆｏｒ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ　　ｉｎ　　Ａｔ　ｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ
）（参照、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ　　　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，Ｖｏｌ．　　６、
ＮＯ．　９、　ｐｐ．６３−６６、サルモネラの分類の
論考について）。

重要なことには、プローブは、すべてのサルモネラヒト
病原に包含される、サブグループｌ，３ａ，および３ｂ
に属する微生物からの核酸に対して独特である。こうし
て、それらは、「標的配列」と呼ぶ、少なくともある程
度の相補性を含有するサルモネラからの核酸配列に属す
る、相補的塩基対によりハイブリダイゼーションするこ
とができる。

配列はＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。

標的配列への本発明のプローブのこの結合は完全に一致
する必要はないことを理解すべきである。

事実、内部のループ、バルジ（ｂｕｌｇｅ）ループ、ヘ
ヤビンループ、十字形結合または他の不一致の領域を生
ずる不対領域が存在することができる。重要な点は、ハ
イブリダイゼーションが標的配列の検出を可能とするた
めに必要な程度に起こらなくてはならないということで
ある。

本発明の核酸プローブは、また、タンパク質をエンコー
ドするある種の核酸配列に相当すると信じられ、前記タ
ンパク質は．ビルレンス因子と呼ぶことができ、サルモ
ネラ微生物、ことに房型（ｆ　ｉｍｂｒｉａｌ−ｔｙｐ
ｅ）タンパク質、そうでなければビリ（ｐ　ｉ　ｌ　ｉ
）として知られている、により引き起こされるヒト病気
の病原に含まれる。サルモネラの感染の病原に１つの方
法または他の方法で含まれ得るこれらのタンパク質のう
ちで、房ｌ型タンパク質、房ＩＩ型夕冫バク質、房ＩＩ
Ｉ型タンパク質などを述べることができ、房Ｉ型タンパ
ク質は最も顕著である。

房はバクテリア細胞から伸びる直線の硬質付属器官であ
る。腸の微生物の場合において、それらは有機体の生命
環に関係づけられた（Ｃｌｅｇｇ．Ｓ．およびＧ．Ｆ．
Ｇｅｒｂａｃｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１６９：９３
４−９３８（１９８７）。

ほとんどの微生物について、房の役割はまだ明瞭に説明
されていないが、Ｅ．ｃｏｌｉについて、房はヒトまた
は動物の宿主のバクテリアのＥ．ｃｏｌｉのコロニー化
、感染に必要な現象、を促進する。クレッグ（Ｃｌｅｇ
ｇ）および共同研究者（ｓｕｐｒａ，９３４）は、Ｅ．
ｃｏｌｉと同定されたバクテリアまたは赤痢菌（Ｓｈｉ
ｇｅｌＩａ）属に属するバクテリアのみが、房の発現に
含まれる遺伝子配列を実証することを報告している。し
かしながら、他の研究者は、房１型がサルモネラ・エン
テリチディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｅｎｔｅｒｉ
ｔｄｉｓ）の付着および＊［に含まれることができるこ
とを示唆した（Ｊａｂｅｒ　　Ａｎｓｌａｎｚｅｄａｈ
およびＬｅｏ　　Ｊ．Ｐａｕｌｉｓｓｅｎ１１Ｊｅｗｉ
ｃｈ　　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　　ｏｆ　　Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ％Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ａｂｓｔｒａｃｅｓ　　　　　
ｏｆ　　　　　ｔｈｅ　　　　ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉ
ｎｇｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　　Ｓｏｃｉｅｔｙ　
　ｆｏｒ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｂｓ．＃Ｂ
１１９、８７ｔｈ　　Ａｎｎｕａｌ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ
，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａｏ　Ｍａｒｃｈ，１９８７）。

本発明のプローブ中の核酸配列の長さは、染色体または
ブラスミドが有するかどうかにかかわらず、サルモネラ
からのＤＮＡ，好ましくは染色体のＤＮＡの少なくとも
一部分に対してハイブリダイゼーシａンを起こさせて、
前記ＤＮＡの検出を可能とするために十分である。しか
しながら、驚くべきことには、比較的これより短い長さ
は標的核酸の容易な検出を可能とする、特異的な、高い
親和性の結合を実証した。したがって、ここで使用する
ためには、約２０〜約４００ヌクレオチド塩基の長さの
核酸配列を有するプローブは好ましい。前記配列はより
好ましくは約２０〜２００塩基、最も好ましくは約２０
〜約１００塩基の長さを有する。

好ましい実施態様において、プロープは全体または一部
分が次の配列からなる、少なくとも約２０ヌクレオチド
塩基を有する核酸配列からなる：より好ましい実施態様
において、ヌクレオチドプローブは、次の配列のすべて
または一部分、あるいはそれに対して相補的な配列のす
べてまたは一部分からなり、前記配列は から本質的に成る群より選択される。

最も好ましい実施態様において、核酸プローブは、次の
配列のすべてまたは一部分、あるいはそれに対して相補
的な配列のすべてまたは一部分からなる： ５’　ＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＴＧ
ＴＣＣＧＣＡＧＡ　３’．および５’　ＧＴＡＴＴＧＧ
ＴＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣ　３
’　．少なくとも２０ヌクレオチド塩基を有し、そして
サルモ不ラの核酸、ことに染色体のＤＮＡにハイブリダ
イゼーションすることができる、前述の配列の一部分は
本発明の範囲内に入ることを理解すべきである。例えば
、前述の配列の１つの中央で開始し、その配列のされた
よりさらに伸び、そして他の種と感知し得る程度に交差
ハイブリダイゼーションしないでサルモネラを検出する
、核酸の配列は本発明における使用に好ましい。前述の
配列内に見いだされる、オーバーラッピングする配列、
より小さいサブ配列の組み合わせなどは、また、包含さ
れる。ブローブのハイブリダイゼーション能力を妨害し
ない追加の配列、例えば、ズライマー配列、クローニン
グ部位の配列、および他の型の７ランキング配列は、ま
た、包含される。

また、特別に上に示したものに対して相浦的なＤＮＡ配
列は、また、本発明における使用に適する。生体内で、
ＤＮＡは相補的鎖をもつ二重らせんとして存在する。本
発明のプローブを利用するＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン方法は、二本鎖を破壊して一本鎖の染色体ＤＮＡを形
成し、次いでこのＤＮＡを使用してプロープと結合する
ことができる。本発明のプローブは変性した二本鎖の標
的ＤＮＡの１つの鎖に結合するが、これに対してプロー
ブの相補的配列は他方の鎖に結合するであろう。

サルモネラを検出するヌクレオチド配列の能力を低下さ
せない、上に詳述したヌクレオチド配列のサブセット、
誘導体、サブクローンおよび突然変異体は、また、本発
明における使用に適する。

ここで使用するとき、用語「サブセット」は、明確なヌ
クレオチド配列中のヌクレオチドの全体の数より少ない
ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を意味する。こ
こで使用するとき、用語「誘導体」は、サルモネラから
誘導されない追加のオリゴヌクレオチドを有する、本発
明の明確なヌクレオチド配列を意味する。これらは意図
して取り付けることができ、例えば、テイルと呼ぶこと
ができるポリヌクレオチド配列、まｔ；はサルモネラか
らの核酸の特定の部分に対して完全に相補的でないが、
サルモネラの核酸にハイブリダイゼーションするプロー
ブの全体の能力を妨害しない、ここｌご教示する配列を
通じて介在する他の配列である。

ここで使用するとき、用語「サブクローン」は、ベクタ
ー中に挿入された、ここに教示するもとの核酸配列の断
片を意味する。ヌクレオチド配列のサブセット、誘導体
、サブクローンおよび突然変異体はもとのヌクレオチド
配列と同一の方法で機能することができることは、この
分野においてよく知られている。

本発明の核酸プローブは、サルモネラ属に属する微生物
からの標的核酸へのシグナルのハイブリダイゼーション
に対して標識される。探識付けは、多くの形態を取るこ
とができ、例えば、普通の放射性同位元素の標識付け、
化学的標識付け、免疫原の標識付け、または光散乱作用
をもつ標識などである。このような標識を検出するため
に適当な方法は、シンナレーションカウンター、オート
ラジオグラフィー、蛍光の測定、比色測定、または光放
射の測定である。

こうして、標識付けは、次のものからなる：放射線標識
（目ｃ，３！ｐ１３Ｈなど）、酵素（例えば、セイヨウ
ワサビペノレオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ
または酸性ホス７アターゼなど）、バクテリアの標識、
フルオレセインの標識、抗体（これは二重の抗体系で使
用することができる）、抗原（標識した抗体とともに使
用する）、小さい分子、例えば、ビオチン（アビジン、
ストレプトアビジン、または抗ビオチンの系）、ラテッ
クス粒子（浮力またはラテックスの凝集系で使用する）
、電子に密な化合物（例えば、７エリチン）（電子顕微
鏡とともに使用する）、または光散乱粒子、倒えば、コ
ロイド状金、またはこれらの組み合わせまたは順列。

例えば、プローブの標識部分が抗原である場合、シグナ
リングは前記抗原を抗体／酵素接合体と複合化し、次い
で酵素基質を添加する。この部分が抗体である場合、シ
グナルは抗抗体またはＦｃ結合タンパク質、例えば、プ
ロテインＡをそれと複合化する（このような第２抗体ま
たはプロテインＡが酵素に接合されているとき）。

プローブの取り扱いの容易さおよび安全の理由で、それ
は化学的に、ことに酵素的にまたは免疫学的に標識付け
することが好ましい。より好ましい実施態様において、
選択する化学的標識付けはハプテン、例えば、ビオチン
、イムノビオチン、フルオレセインなどである。

述べることができる好ましい標識付け合成は、ビオチン
／ストレプトアビジン系に基づくものである。この系は
種々の手段によりプローブ中に組み込むことができる。

例えば、プローブはビオチンにサイトクロームＣ架橘を
経て共有結合することがでさる（Ｍａｎｎｉｎｇ　　ｅ
ｔ　　ａｔ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｘ　　１６：
ｌ３６４　　　１３７０（１９７７）、Ｍａｎｎｉｎｇ
　　　ｅｔ　　　ａｌ．、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，　　
５３：ｌ０７　　　１１７（１９７５）、　Ｓｏｄｊａ
ｂ　　Ａ．％　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　　Ａｃｉｄｓ　　
　Ｒｅｓｅａｒｃｈｓ　　５：３８５−４０１　（１９
７８））か、あるいはビオチンは特定のヌクレオチド残
基中に組み込むすることができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｐ．
Ｒ．　、Ｐｒｏｃｅａｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　ｏｎｅ　
　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　Ｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ％ＵＳＡ，７８：６６３３−６６３７　（１
９８１））か、あるいはビオチンはポリヌクレオチドに
ジアミン（例えば、ペンタンジアミン）架橋により取り
付けることができる（Ｂｒｏｋｅ　ｒ，Ｔ．Ｒ．ｅ　ｔ
ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，５：３６３　　３８４（１９７８））。

ビオチン分子の相互作用は、ラテックス粒子のようなシ
グナリング成分（Ｓｏｄｊａ　　ｅｔ　　ａｌ．、ｓｕ
ｐｒａ，またはＭａｎｎｉｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ．、Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍａ，ｓｕｐｒａ）、７ｙ−リチン（Ｂ
ｒｏｋｅｒ，ｓｕｐｒａ）、フルオロゲン、例えば、フ
ルオレセイン、酵素、第２抗体、磁気粒子などに接合し
たアビジン、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体
を使用して達成される。

しかしながら、ある好ましい実施態様において、化学的
不安定なプロープの３′末端に取り付けられた「ティル
配列」に取り付ける。本発明の核酸プローブのテイル配
列は、好ましくはヌクレオチド塩基から構成される。本
発明のより好ましい実施態様において、ヌクレオチドは
アデノシンおよびウリジンである。本発明の最も好まし
い実施態様において、テイル配列はほぼ９０％のアデノ
シンおよび１０％のウリジンの組成を有する。テイルの
ヌクレオチド配列は好ましくはほぼ２００〜４００塩基
の長さである。ティル配列はブローブに酵素反応により
末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（Ｐｈ
　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）を使用するか、あるいは他
の普通の方法により付加することができる。

本発明の核酸ブローブにおいて有用な核酸配列は、普通
の方法、例えば、有機合成、組み換えＤＮＡ技術または
ゲノムＤＮＡ，ことに房のタンパク質の遺伝情報を指定
するｆｉｍ遺伝子を有するＤＮＡからの分離により容易
に調製される。しかしながら、ここに記載する配列は、
この分野において知られている技術、例えば、核酸合成
装置および商業的に入手可能な試薬を利用する技術を使
用する有機合成に適用することができる。

したがって、本発明のプローブは好ましくはゲノムのＤ
ＮＡまたはＲＮＡから誘導されるよりむしろ合成的につ
くられる。本発明のオリゴヌクレオチドブローブを化学
的に合成する方法は、この分野においてよく知られてい
る。１つのこのような方法は、米国特許第４，４５８，
０６６号（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　　ｅｔ　　ａｌ．）に
記載されているホスホルアミダイト方法である。他の方
法は、■．アマルナス（Ａｍａｒｎａｔｈ）ｅｔａｌ．
（１９７７）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７７：１８３−２１
７に記載されている。本発明の好ましいプローブは比較
的短いので、したがってそれらは自動化ＤＮＡ合成装置
によりつくることができる。プローブは、また、便利に
追加のヌクレオチド、例えば、ビオチン標識したヌクレ
オチド、好ましくは約１０００塩基より小さい、より好
ましくは約１５０〜約５００塩基、最も好ましくは約２
００〜４００塩基でテイリングすることができる。プロ
ーブの化学的合成は、天然源からの遺伝子の情報を分離
および精製する困難な組み換え手順に頼るよりはむしろ
、特異的ヌクレオチド配列を使用して多数の精製したプ
ローブを容易に産土することができる。

プローブは凍結乾燥した形態で炎供して、ハイブリダイ
ゼーション反応の実施のために適当な緩衝液中で構成す
ることができる。あるいは、ブローブはこのような緩衝
液または試薬溶液中の既に存在して、ヒト病原性サルモ
ネラの検出のための試薬を得ることができる。このよう
な試薬溶液は、一般に、標的核酸へ結合するプローブの
能力を増大する因子からなる。例えば、試薬溶液は適当
なハイブリダイゼーションエンハンサー、洗浄剤、担体
ＤＮＡ，および特異性を増加する化合物、例えば、ホル
ムアミドを含有することができる。このような試薬溶液
は、ここに記載する１または２以上の配列を、任意の組
み合わせで、試薬のプローブ部分として含むことができ
る。好ましい実施態様において、試薬溶液は、ホルムア
ミドを、ことに緩衝液体積の約４０〜約６０％、より好
ましくは約４７〜約５５％の量で含む。とくに好ましい
実施態様において、試薬溶液は、また、担体ＤＮＡを含
有する。

ここに記載するプロープの使用は、標的配列の検出のた
めに、生物学的標本中の核酸へのハイブリダイゼーショ
ンを実施する特定の方法または技術に限定されない。い
くつかのハイブリダイゼーションアッセイ技術は、この
分野において知られており、そして、例えば、次のもの
を包含する二ドットブ口ットハイブリダイゼーション、
サザンブロッティング；サンドイツチハイブリダイゼー
シ這ンアッセイ、例えば、米国特許第４．５６３．４１
５号および米国特許第４，４８６，５３９号（Ｒａｎｋ
ｉ　　ｅｔ　　ａｌ．）に記載されているもの；ビーズ
上のサンドイッチハイブリダイゼーション、例えば、欧
州特許出願第８４３０６５１３・７号（Ｈａｎｓｅｎ　
　ｅｔ　　ａｔ．）に記載されているもの：置換ハイブ
リダイゼーション技術、例えば、ｗｏ８７／０３９１１
に記載されているもの；ここに記載する核酸プローブを
まず固体支持体上に固定化し、次いで試料と接触させる
捕捉技術；その場のハイブリダイゼーション、例えば、
Ｐｌｏｅｇ１Ｆｏｌｉａ　　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｒｎ＋ｃ
ａ　　ｅｔ　　Ｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ１Ｖｏ　ｌ
．２４　（１９８６）Ｎｏ．３、ｐｐ．１８９−１９４
に引用または記載されているもの：など。

サルモ不ラ属に属する微生物の標的分析物のポリヌクレ
オチドは、種々の媒質中に、最もしばしば生物学的、生
理学的、または環境の試料中に存在することができる。

ある場合において、標的ポリヌクレオチドを含有する試
料を種々の抽出、精製、および分離のプロトコルにかけ
た後、本発明の方法による分析を実施することが好まし
い。これらのような手段は、ハイブリダイゼーションブ
ローブへの分析物の結合を妨害しうる物質を試料から除
去するために望ましい。このようなプロトコルの例は、
核酸のハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａ
ｃｉｄ　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の９＄２章、
＋３．Ｈａｍｅｓ８よびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ
　　Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．（１９８５）、お
よび標準のテキストブックに見いだすことができる。

また、合成のホモーまたはへテローポリヌクレオチドは
、生物学的でない由来にかかわらず標的分析物としては
たらくように実験室において調製することができること
は本発明の範囲内に入る。

なぜなら、このような合成ポリヌクレオチドはサルモネ
ラの感染などの屑原の領域における研究において望まし
いこ七があるからである。

さらに、標的分析物のヌクレオチド配列を含有する試料
は、しばしば、処理して標的分析物を一本鎖の形態に転
化しなくてはならない。一本鎖の形態へのこの転化は、
この分野において普通の種々の方法により達成すること
ができる。例えば、二重らせんの核酸の変性は、熱的に
、化学的に、または他の普通の方法により達成すること
ができる。変性の方法はｐＨ，イオン強度、温度、およ
び周囲の媒質の他の性質（例えば、尿素、グリオキサル
、メチル水銀水酸化物または他の因子の存在）、ならび
に塩基の組成（すなわち、ＧＣ／ＡＴ比）、配列、およ
び二重らせん核酸の長さに依存する。変性の種々の方法
の概説は、次の刊行物に記載されている：標準のテキス
トブック、およびＪ．マーマー（Ｍａ　ｒｍｕ　ｒ）　
、Ｃ．チルドクラウト（Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ）およ
びＰ．ドチイ（Ｄ　ｏ　ｔ　ｙ）　、新形成の分子の基
準（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂａｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｎ
ｅｏｐｌａｓｉａ）、デキサス大学の発行所、テキサス
州オースチン、１９６２；およびＴ．マニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）、Ｅ．Ｆ．フリツシュ（Ｆ　ｒ　ｉｔｓ
ｈ）、およびＪ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏ　ｏ　ｋ
　）　ｓモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールドースプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー　１９８２。

ハイブリダイゼーション反応の例は、標的分析物のヌク
レオチドが液体媒質中に提供される場合である。この媒
質は多くの形態を取ることができ、その最も例示的なも
のは処理されない生物学的流体、あるいは水または他の
適合性の液状媒質中に分散した固体の生物学的試料であ
る。処理しない生物学的流体を「第２溶液」とある実施
態様において混合して、相補的一本鎖の核酸の再ハイブ
リダイゼーションを支持することが知られている媒質を
産生ずることができる。

ｗＩ２溶液は水性または非水性または両者の混合物であ
ることができる。相補的一本鎖の核酸の再ハイブリダイ
ゼーションを行うことが知られているある種の無機また
は有機添加剤を添加して、ハイブリダイゼーションの速
度を増大しおよび／または再ハイブリダイゼーシ１ンの
平衡の程度（すなわち、再ハイブリダイゼーションした
形態の安定性）を増加することができる。無機の添加剤
の例として、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム
を述べることができる；有機化合物の例として、ホルム
アミドのような化合物を述べることができる。

プロープは、分析物の標的ヌクレオチドが、存在する場
合、プローブのヌクレオチドの標的認識部分中に含有さ
れる相補的領域に全体でまたは部分的にハイブリダイゼ
ーションすることができる、条件下に液体試料と接触さ
せることができる。この接触工程は種々の方法で、そし
て変化する「厳格さ」の条件下に実施することができる
。再ハイブリダイゼーション［再アソシエーション（ｒ
ｅａｓｓｏｃｉａｔ　ｉｏｎ）］の方法を実施する因子
の概説は、核酸のハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　Ａｃｉｄ　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、
Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、ＩＲＬ　
　Ｐｒｅｓｓｓ　ワシントンＤ．Ｃ．（１９８５）に記
載されている。因子は、次のものを包含する：温度、ｐ
Ｈｔ塩濃度および溶媒の条件、ならびに長さ、複合化、
およびプローブの相補性および分析物の標的ポリヌクレ
オチドに反映する因子。接触期間は、所望の程度へのハ
イブリダイゼーションを実施するために必要な時間の長
さに依存して変化することができ、それは標的認識部分
中の結合領域の長さならびに反応条件に部分的に依存す
る。

結合した相補的標的分析物を有する、ヌクレオチドプロ
ーブは、所望のハイブリダイゼーションが起こった後、
生物学的試料から分離する。この分離は任意の適当な手
順により達成することができる。これらの手順は、次の
ものを包含するが、これらに限定されない：クロマトグ
ラフィー（カラム、ゲルなど）、濾過、電気泳動（電気
溶離を包含する）など。さらに、結合しない物質をプロ
ープに結合した再ハイブリダイゼーションした物質から
完全に分離する、すすぎ工程を組み込ことがのぞましい
ことがある。

いったんハイブリダイゼーションの事象が起こりそして
結合した物質を結合しない物質から分離したとき、プロ
ーブ上の標識の検出を結合した物質、結合しない物質、
または両者のアッセイにより実施する。標識が放射性標
識である場合、直接の検出を普通の放射性同位元素の定
量技術により達成することができる。標識が化学的標識
，例えば、ビオチンである場合、間接検出を行う。

した（表１）。ｆｉｍ遺伝子はサルモネラの新規なプロ
ーブとして作用することができるように思われだ。

二本鎖ＤＮＡのプローブを、キメラプラスミドｐｌｓｃ
ｌ３７から誘導した［Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｂ．、　ｅｔ　
　ａｌ．、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ．
Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．１６９、ｐｐ．５
８３１−５８３４　（１９８７）］。サルモネラ・チ７
イムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）からのｆｉｍ遺伝子を有する１．６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｐａｌ断片を、３″Ｐで標識し、そしてハ
イブリダイゼーション実験において使用して、ｆｉｍプ
ローブの特異性および感受性を試験した。ＡＴＣＣ菌株
および臨床的分離物を、ドットプロット実験においてプ
ロープとの反応性について検査表Ｉ ｆｉｍプローブのハイブリダイゼーションのパターン Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ Ｓ．ｔｙｐｈｉ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ Ｓ．ｔｙｐｈｉ＋ａｕｒｕｉｍ Ｓｈｉｇｅｌｌａ　　ｂｏｙｄｉａｅ Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｒａｅ Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　　ｊｅｊｕｎｉＣ．ｊｅ
ｊｕｎｉ Ｃ．ｆｅｃａｌｉｓ Ｃ．ｃｏｌｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＫｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＢａｃｉｌｌ
ｕｓ ＡＴＣＣ＃１３３１２ ＡＴＣＣ＃１３０７６ ＡＴＣＣ＃６５３９ ＡＴＣＣ＃１４０２８ ＡＴＣＣ＃ｌ９５８５ Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　ｉｓｏｌａｔｅ ＡＴＣＣ＃９２０７ ＡＴＣＣ＃２９０２６ ＡＴＣＣ＃１１０６０ ＡＴＣＣ＃１２０２２ ＡＴＣＣ＃９３３９ ＡＴＣＣ＃２５９２２ ＡＴＣＣ＃９５４６ ＡＴＣＣ１２９４２８ ＡＴＣＣ＃３３５６０ ＡＴＣＣ＃３３７０９ ＡＴＣＣ＃３３５５９ ＡＴＣＣ＃２７８５３ ＡＴＣＣ＃１３５８３ 陽性のハイブリダイゼーシコンシグナルは、３２ｐ標識
したプローブが標的ＤＮＡと反応した場合、オートラジ
オグラフィー後に見られた。

実施例２一合成オリゴヌクレオチドのプローブとしての
使用 全体のｒｉｍ遺伝子、５’　〜３’　、のＤＮＡ配列を
使用して出発する： Ｑり ○　　　へ， （プ Ｑ　　シ ０　襲 ２つのオリゴマーを化学的に合成した。それらは次の基
準に基づいて選択した：　（ａ）５’近接であるインパ
ーティブル（ｉｎｖｅｒｔｉｂｌｅ）反復より外側に位
置するおよび、（ｂ）ほぼ５０％のＧ＋Ｃ含量（これは
リジン含量に関係する、サルモネラ種は、クレプシエラ
（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）、Ｅ．ｃｏｌｉなどに対して高
い含量のこのアミノ酸を有する）。そうでなければ、合
成すべき配列を任意に選択し、そしてほぼ５０塩基の長
さであった。

下の明確なヌクレオチド配列を、試験のために合成した
： これらの合成オリゴマーはコロニーのハイブリダイゼー
ション実験において試験した。両者のプローブを３２ｐ
で標識し、そして組み合わせて、病気の抑制のセンター
（Ｃｅｎｔｅｒ　　ｆｏｒ　　Ｄｉｓｅａｓｅ　　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ）から入手しそしてすべての種のサブグルー
プ（ｌ０２。３ａ１３ｂ，４、５および６）を表した１
４２のサルモ不ラ菌株のパネルに対して試験した。プロ
ープとの反応性について試験した他の有機体を、表Ｉ１
ｃに示す。

表ＩＩ Ｓ．ａｄｅｌａｉｄｅ Ｓ．ａｇｏｎａ Ｓ．ａｌａｃｈｕａ Ｓ．ａｌｂａｎｙ Ｓ．ａｎａｔｕｍ Ｓ．ｂａｒｅｉｌｌｙ Ｓ．ｂｅｒｅ Ｓ．ｂｓｒｔａ Ｓ．ｂｌｏｃｋｌｅｙ Ｓ．ｂｏｖｉｓ−ｎ＋ｏｒｂｉｆｉｃａｎｓＳ．ｂｒａ
ｅｎｄａｒｕｐ Ｓ．ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ Ｓ．ｂｒｅｄｅｎｅｙ Ｓ．ｃｅｒｒｏ Ｓ．ｃｈｅｓＬｅｒ Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ Ｓ．ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｓ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｓ．ｍａｄｅｌｉａ Ｓ．ｍａｎｈａｔｔａｎ Ｓ．ｍｂａｎｄａｋａ Ｓ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ Ｓ．ｍｉａｍｉ Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｓ．ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ Ｓ．ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｓ．ｍｕｅｎｓｔｅｒ Ｓ．ｎｅｗ　　ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓ．ｎｅｖｉｎｇｔｏｎ Ｓ．ｎｅｔｒｐｏｒＬ Ｓ．ｎｏｒｖｉｃｈ Ｓ．ｏｈｉｏ Ｓ．ｏｒａｎｉｅｎｂｕｒｇ Ｓ．ｐａｎａｍａ Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ　　Ａ Ｓ．ｄｅｃａｔｕｒ Ｓ．ｄｅｒｂｙ Ｓ．ｄｒｙｐｏｏｌ Ｓ．ｄｕｂｌ　ｉｎ Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ．ｇｉｖｅ Ｓ．ｈａａｒｄｔ Ｓ．ｈａｄａｒ Ｓ．ｈａｒｔｆｏｒｄ Ｓ．ｈａｖａｎａ Ｓ．ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓ．ｉｎｄｉａｎａ Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｓ．ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ Ｓ．ｊａｖａ Ｓ．ｊａｖｉａｎａ Ｓ．ｊ０１１．１１ｎｅｓｂｕｒｇ Ｓ．ｋｅｎｔｕｃｋｙ Ｓ．ｋｏｔｔｂｕｓ Ｓ．ｋｒｅｆｅｌｄ Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ　　Ｂ Ｓ．ｐａｒａＬｙｐｈｉ　　Ｃ Ｓ．ｐｏｏｎａ Ｓ．ｒｅａｄｉｎｇ Ｓ．ｒｕｂｉｓｌａｕ Ｓ．ｓａｎ　　ｄｉｅｇｏ Ｓ．ｓａｐｈｒａ Ｓ．ｓｅｎｆｔｅｎｂｕｒｇ Ｓ．ｓｔ．ｐａｕｌ Ｓ．ｓｔａｎｌｓｙ Ｓ．ｓｕｎｄｓｖａｌｌ Ｓ．Ｌｅｎｎａｓｓｅｅ Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｓ．Ｌｙｐｈｉ Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ Ｓ．ｗｅｌＬｅｒｒｅｄｏｎ Ｓ．ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ サブグループ２ サルモネラ： ５８二ｄ：ｚ６ ３０：１．ｚｚ−：ｚ− Ｓ．ｓｅｔｕｂａｌ Ｓ．ｐｈｏｅｎ＋ｘ サブグループ３ａ サルモネラ： ６２：Ｚａ＋Ｚ２３：− ４３１＋３＋４：２４＋２２３’ １８：Ｚ４＋Ｚ３ｉ：− ６２：ｚｓ＝：− ４８Ｉ，４８−：：ｚ．，ｚ，，：− サブグループ３ｂ サルモ不ラ： ６５　：　（ｋ）　：　ｚ ６１：ｋ：１，５．（７） ４Ｌ＋３＋４：ｉ：ｚ ５０１＋２＋３二ｋ：ｚ ３８：（ｋ）：Ｌｓ ？ブグループ４ サルモネラ： ４３１＋３＋４’Ｚ２Ｓ： ４４：ｚｓａ：− Ｓ．ｙａｓｓｅｎａａｒ Ｓ．ｆｌｉｎｔ サブグループ５ サルモネラ： ４８．４ｇ■，４８．：２： Ｓ．ｂｒｏｏｋｆ　ｉｅｌｄ Ｓ．ｍａｒｏｇｒｏｓｓｏ Ｓ．ｍａｌａｗｉ サブグループ６ サルモネラ： １１：ｂ：１，７ ４１：ｂ：１．７ Ｓ．ｆｅｒｌａｃ Ｓ．ｖｒｉｎｄａｂａｎ 他の属 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｅｎｔｅｒｉｃ　Ｇｒｏｕｐ　９０　　　　　２Ｃｉｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ　　２　　　　　
　　＋および−Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｈａｆｎ
ｉａｅ　　１上の菌株は、ＣＤＣ１ジョージア州アトラ
ンタ、Ｊ．Ｊ．７７−７　　（Ｆａｒｍｅｒ）ＩＩＩお
よびアルマ（Ａ＋ｍａ）Ｃ−マクホーター（ＭｃＷｈｏ
ｒｔｅｒ）博士の補体から入手した。

いくつかの例外を除外して、２つのプローブＯＤＳＯＯ
９８およびＯＤＳＯｌ００（それぞれ、４８マーおよび
５０マー）はきわめてすぐれた特異性および感受性を示
した。プロープはヒト病原性に関係したすべてのサルモ
不ラのサブグループと特異的に反応した（サブグループ
５は爬虫類の病原である；ブローブはこのサブグループ
からの有機体と反応しない）。検査した生化学的にまた
は血清学的に関係する非サルモネラのうちで、２つのシ
トロバクター・７レウンジイイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅ
ｒ　　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の１つのみがプローブと交差
反応した。

よりすぐれた特異性を達成するために、ｌ系列のより短
いオリゴマー　１７〜１９塩基の長さを検査した。下の
明確なヌクレ才チド配列を試験のために合成した： ５’−ＡＴＴ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＴＴ
Ｔ　Ｇ−３’（この配列は００Ｓ０１　１　１と表示し
た）５’−ＴＧＣ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＴＧＣ　ＣＧＴ　
ＣＡＧ　Ｃ−３’（この配列はＯＤＳＯ　１１２と表示
した）５’−ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＡＣ　ＡＡＴ　ＡＧＣ
　ＡＣＴ　Ａ−３’（この配列はＯＤＳＯｌ１３と表示
した）５’−ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＧＣ　ＡＣＣ　ＡＡＴ
　ＡＣ−３’（この配列はＯＤＳＯ１１４と表示した）
５’−ＴＧＣ　ＣＧＴ　ＴＣＣ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＧＧ
Ａ〜３′（この配列はＯＤＳＯ　１１５と表示した）５
’−ＧＣＧ　ＴＧＣ　Ｃ；ＧＴ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＣＡ
Ｇ〜３′（この配列は００Ｓ０１１６と表示した）５’
−ＣＣＣ　ＧＡＣ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＴＧＣ　ＧＧ−３
’（この配列はＯＤＳＯ　１１７と表示した）５’−Ｇ
ＧＣ　ＣＧＣ　ＣＡＣ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　ＡＴ−３’（
この配列はＯＤＳＯｌｌ８と表示した）５’−ＧＴＴ　
ＴＧＡ　ＴＣＧ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＴＴ−３’（この配
列は００Ｓ０１１９と表示した）５’−ＧＣＴ　ＣＡＣ
　ＣＧＧ　ＡＧＴ　ＡＧＧ　ＡＴＣ−３’（この配列は
ＯＤＳＯ１２０と表示した）これらのプローブの各々を
３２ｐで標識し、モして３４のサルモネラ菌株、５つの
シトロバクター菌株、エンテロバクター・ハ７ニアエ（
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｈａｆｎｉａｅ）および
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株に対するコロニーハイブリダイゼーシ
３ン実験において試験した。ｌＯのプローブのうち５つ
は、非交差反応性のハイブリダイゼーシコンのパターン
を誘発した。しかしながら、短いプローブの使用の結果
、より短いブローブは特異性の同時の増加とともに感受
性を犠牲にする、すなわち、小さい数のサルモネラ（サ
ブグループ５以外）は非反応性であった。

約３０塩基の長さのプローブを、また、試験した。コレ
ラノプローブは、ＯＤＳＯ　１　１　１，ＯＤ５０１１
３、ＯＤＳＯ　１　１　６オ，Ｊ：びＯＤＳＯＩＩ９の
５′または３″の伸長として合成した。下の明確なヌク
レオチド配列を試験した。

５’ＡＴＴ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＴＴＴ
　ＧＴＣ　ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＧＣＡ−３’（この配列は
ＯＤＳＯｌ３７と表示した）５’ＧＣＧ　ＴＧＣ　ＧＧ
Ｔ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＡＴＴ　ＧＧＴ
　ＧＣＣＴＴＣ　ＡＣＣ−３’ （この配列はＯＤＳＯｌ３９と表示した）５’ＴＡＧ　
ＴＧＣ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　Ａ
ＧＡ　ＣＡＧ　ＣＣＡ−３’（この配列は００５０１４
３と表示した）５’ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＴＧＣ　ＧＧＴ　
ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＴＣ　ＣＧＣ　ＡＧＡ−３
’（この配列はＯＤＳＯｌ４４と表示した）５’ＡＣＣ
　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＣＡＣ　ＣＧＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　
ＧＧＣ　ＧＧＡ　ＴＴＴ−３’（この配列はＯＤＳＯｌ
４５と表示した）５’ＧＴＡ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＴ
　ＴＣＡ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＧＡＣ　ＴＧＣ　ＴＴＣ−
３’（この配列はＯＤＳＯ１４６と表示した）３８Ｐ標
識したプローブおよび種々の有機体からの純粋な染色体
ＤＮＡ調製物を使用するドットプロット実験の結果は、
きわめてすぐれた特異性／感受性がＯＤＳ０１４４お．
Ｊ：びＯＤＳＯ１４６（７）場合において得られたこと
を示した。８つのサルモネラＤＮＡ調製物（すべてのサ
ブグループを表す）のうちで、サブグループ５、爬虫類
の病原、のみが検出されなかった。他の有機体からのＤ
ＮＡを使用して交差反応性は見られなかった、すなわち
、８つのシトロバクタ一種、セラチア・マルセセンス（
Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、モルガ
ネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ　　ｍｏｒｇ
ａｎｉｉ）、Ｅ．ｃｏｌｉ，エンテロバクター・クロア
カエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｃｌｏａｃａｅ）
、プロテウス●ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　　ｍｉｒ
ａｂｉｌｉｓ）、エルシニア・エンテロコリチクス（Ｙ
ｅｒｓｉｎｉａ　　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃｕｓ）
、ビブリオ・バラへモリチクス（Ｖｉｂｒｉｏ　　ｐａ
ｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロバタタ−●ア
エロゲネス（Ｅｎ　ｔ　ｅ　ｒｏｂａｃ　ｔ　ｅ　ｒａ
ｅｒｏｇｅｎｅｓ）、ならびに４つの赤痢菌（Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ）種を試験し、そしてこれらはプローブと反応
性でなかった。

ここに記載するプローブのすべては、ヒトにおける病原
であるサルモネラ有機体の検出に高度に特異的である。

それらは下痢の試料においてサルモネラの検出に臨床的
に意味がある。さらに、それらは食物に含まれるサルモ
ネラ、ヒトにおけるサルモネラ症の病原体、の検出にお
いて有用であろう。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

ｌ１サルモネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）の感染
のヒト病原に含まれるビルレンス因子をエンコードする
ヌクレオチド配列の少なくとも一部分からなるヌクレオ
チドプローブであって、前記プローブはサルモネラ（Ｓ
ａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　ｌ　ａ）の相補的標的核酸にハイ
ブリダイゼーションし、そして検出可能な標識によりこ
のようなハイブリダイゼーションをシグナリングするこ
とができることを特徴とするヌクレオチドプロープ。

２、前記ビルレンズ因子はサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）属から微生物により産土されるタンパク質であ
り、前記微生物はサブグループｌ，サブグループ２、サ
ブグループ３ａ，サブグループ３ｂ，サブグループ４、
およびサブグループ６から本質的に成る群より選択され
るサブグループに属する、上記第ｌ項記載のプローブ。

３、前記ビルレンス因子はサルモネラ（Ｓａｔｍｏｎ．
ｅｌｌａ）属から微生物により産生されるタンパク質で
あり、前記微生物はサブグループ１、サブグループ３ａ
およびサブグループ３ｂから本質的に成る群より選択さ
れるサブグループに属する、上記第２項記載のプローブ
。

４、前記ビルレンス因子は房型（ｆｉｍｂｒｉａｌ−ｔ
ｙｐｅ）タンパク質である、上記第２項記載のプローブ
。

５、前記タンパク質は房ｌ型、房２型および房３型から
成る群より選択される、上記第４項記載のプローブ。

６、前記タンパク質は房１型タンパク質である、上記第
５項記載のプローブ。

７、サブグループｌ１サブグループ２、サブグループ３
ａ，サブグループ３ｂ，サブグループ４、およびサブグ
ループ６かも本質的に成る詳より選択される少なくとも
１つのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のサブグル
ープに属する微生物から誘導された相補的標的核酸にハ
イブリダイゼーションすることができる、上記第１項記
載のプローブ。

８、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）サブグループ
５（爬虫類の病原）、シトロバクター・フレウンジイイ
（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、セ
ラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃ
ｅｓｃｅｎｓ）、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａ
ｎｅｌｌａ　　ｍｏｒｇａｎ　ｉ　ｉ）　、大腸１１（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）、エンテロバク
タ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コレラ菌（Ｖｉ
ｂｒｉｏｃｈｏ　Ｉ　ｅ　ｒａｅ）　、プロテウス・ミ
ラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、
赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、およびカンピロガクタ
ー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属から成る群より選
択される有機体からのＤＮＡと交差ハイブリダイゼーシ
ョンする、上記第７項記載のプローブ。

９、少なくともｌ８のヌクレオチド塩基を有する、上記
第８項記載のプローブ。

１０、少なくとも２５のヌクレオチド塩基を有する、上
記第９項記載のプローブ。

１ｌ１約２５〜約１５０のヌクレオチド塩基を有する、
上記第８項記載のプローブ。

１２、約２５〜約５０のヌクレオチド塩基を有する、上
記第１１項記載のプローブ。

ｌ３、サルモネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉａ）の感
染のヒト病原に含まれるタンパク質をエンコードする核
酸配列に対して相補的である、上記第１２項記載のプロ
ーブ。

ｌ４、前記ヒト病原に含まれるタンパク質をエンコード
する核酸配列に対して相補的である、少なくとも３０ヌ
クレ才チド塩基の配列を有する、上記第１３項記載のプ
ローブ。

ｌ５、前記タンパク質は房型タンパク質である、上記第
１４項記載のプローブ・ １６、前記タンパク質は房ｌ型タンパク質である、上記
第１５項記載のプローブ。

ｌ７、次の配列： の一部分からなる、 上記第１ ６項記載のプローブ。

ｌ　８、 ５’．．．ＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＡＡＴＧＣＣＧＡＣ
ＧＣＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣ（；ＡＡ
ＴＡＡＴ．−．３’５’．．．ＣＣＴＡＣＴＣＣＧＧＴ
ＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＡＴＴＣＡＴ
ＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＡＣＴ．．３’５’ＧＣＧ　　
ＴＧＣ　　ＧＣ：Ｔ　　ＡＡＡ　　ＡＣＧ　　ＣＡＧ　
　ＣＧＴ　　ＡＴＴ　　ＧＧＴ　　ＧＣＣ　　ＴＴＣ　
　ＡＣＣ−３’５’ＴＡＧ　　ＴＧＣ　　ＴＡＴ　　Ｔ
ＧＴ　　ＣＣＧ　　ＣＡＧ　　ＡＧＧ　　ＡＧＡ　　Ｃ
ＡＧ　　ＣＣＡ−３’５’ＧＣＣ　　ＧＧＴ　　ＴＧＣ
　　ＧＧＴ　　ＡＧＴ　　ＧＣＴ　　ＡＴＴ　　ＧＴＣ
　ＣＧＣ　　ＡＧＡ−３’５’ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＣＧＴ
　　ＣＡＣ　　ＣＧＴ　　ＴＴＧ　　ＡＴＣ　　ＧＧＣ
　ＧＧＡ　　ＴＴＴ−３’５’ＧＴＡ　　ＴＴＧ　ＧＴ
Ｇ　　ＣＣＴ　　ＴＣＡ　　ＡＣＣ　　ＡＧＣ　ＧＡＣ
　ＴＧＣ　　ＴＴＣ−３’５’ＡＴＴ　　ＧＣＧ　　Ａ
ＧＴ　　ＣＴＧ　．ＡＴＧ　　ＴＴＴ　　Ｇ−３’５’
−ＴＧＣ　　ＡＧＣ　　ＣＴＧ　　ＴＧＣ　　ＣＧＴ　
　ＣＡＧ　　Ｃ−３’５’−ＴＣＴ　　ＧＣＧ　　ＧＡ
Ｃ　　ＡＡＴ　　ＡＧＣ　　ＡＣＴ　　Ａ−３’５’−
ＧＴＴ　　ＧＡＡ　　ＧＧＣ　　ＡＣＣ　　ＡＡＴ　　
ＡＣ−３’５’−ＴＧＣ　　ＣＧＴ　　ＴＣＣ：　　Ｃ
ＴＧ　　ＡＣＧ　　ＧＧＡ−３’５’−ＧＣＧ　　ＴＧ
Ｃ　　ＧＧＴ　　ＡＡＡ　　ＡＣＧ　　ＣＡＧ−３’５
’−ＣＣＣ　　ＧＡＣ　　ＧＣＣ　　ＧＧＴ　　ＴＧＣ
　　ＧＧ−３’５’−ＧＧＣ　　ＣＧＣ　　ＣＡＣ　　
ＴＴＴ　　ＣＧＧ　　ＡＴ−３’５’−ＧＴＴ　ＴＧＡ
　ＴＣ（；　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＴＴ−３’，および５’
−ＧＣＴ　　ＣＡＣ　　ＣＧＧ　　ＡＧＴ　　ＡＧＧ　
　ＡＴＣ−３’から本質的に成る群より選択される少な
くとも１つの配列のすべてまたは一部分からなる、上記
第１７項記載のプロープ。

ｌ９、 ５’　ＧＣＣ（１；ＧＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴ
ＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡ　３’　．５’　ＧＴＡＴＴＧＧ
ＴＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣ　３
’　；および一方または双方に対して相補的である少な
くとも１つのヌクレオチド配列からなる、上記第１８項
記載のプローブ。

２０、上記第１９項記載の少なくとも１つのヌクレオチ
ド配列のすべてまたは一部分のサブセット、誘導体、サ
ブクローンまたは突然変異体からなる核酸プローブであ
って、前記プローブはサルモネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　
ｌ　］　ａ）属に属する微生物からの標的分析物（ｔａ
ｒｇｅｔ　　ａｎａｌｙｔｅ）にハイブリダイゼーショ
ンすることができ、前記微生物はヒトｆＮＷＬ性を引き
起こすことを特徴とする核酸プローブ。

２１，検出可能な標識をその上に結合して有する３′テ
イルヌクレオチド配列からさらになる、上記第１９項記
載の核酸プローブ。

２２、前記検出可能な標識はビオチンである、上記第２
１項記載の核酸プローブ。

２３、サルモネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）属の
微生物からの前記相補的標的核酸は染色体のＤＮＡであ
る、上記第１項記載のプローブ。

２４、前記相補的標的核酸はＲＮＡである、上記第１項
記載のプローブ。

２５、前記検出可能な標識は３′テイルヌクレオチド配
列に結合している、上記第１項記載の核酸プローブ。

２６、前記検出可能な標識はハプテンである、上記第２
５記載のプローブ。

２７、前記ハプテンはビオチン、イムノビオチン、およ
びフルオレセインから成る群より選択される、上記第２
３項記載のプローブ。

２８、緩衝液中に分散した上記第１５項記載の少なくと
も１つの核酸プローブからなることを特徴とする、サル
モネラ（Ｓａ　ｌｍｏｎｅ　１　１ａ）属からのヒト病
原性微生物からの核酸の検出において使用する試薬。

２９、少なくとも１つの核酸プロープからなり、前記ブ
ローブは ５’　ＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＴＡＧＴＧＣＴＡＴＴＧ
ＴＣＣＧＣＡＧＡ　３’．および５’　ＧＴＡＴＴＧＧ
ＴＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＴＣ　３
’および一方または双方に対して相補的な配列から成る
群より選択される少なくともＩっのヌクレオチド配列を
有する、上記第２８項記載の試薬。

３０、ハイブリダイゼーションエンハンサー洗浄剤、お
よび担体ＤＮＡをさらに含む、上記第２９項記載の試薬
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ１ｌａ）の感染のヒト
   病原に含まれるビルレンス因子をエンコードするヌクレ
   オチド配列の少なくとも一部分からなるヌクレオチドプ
   ローブであって、前記プローブはサルモネラ（Ｓａｌｍ
   ｏｎｅｌｌａ）の相補的標的核酸にハイブリダイゼーシ
   ョンし、そして検出可能な標識によりこのようなハイブ
   リダイゼーションをシグナリングすることができること
   を特徴とするヌクレオチドプローブ。 ２、緩衝液中に分散した特許請求の範囲第１項記載の少
   なくとも１つの核酸プローブからなることを特徴とする
   、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属からのヒト病
   原性微生物からの核酸の検出において使用する試薬。