CN110531075B - 基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

基于抗菌肽‑磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用，涉及食源性致病菌检测领域。该生物传感器包括Fe3O4‑Magainins I磷酸铜纳米复合物和Cecropin P1‑转化酶磷酸钙纳米复合物。通过合成两种抗菌肽‑磷酸盐纳米复合物，以Fe3O4‑Magainins I磷酸铜纳米复合物为捕获元件进行细菌磁性分离，以Cecropin P1‑转化酶磷酸钙纳米复合物为信号转导元件；加入食源性致病菌目标物与两个纳米复合物形成夹心免疫结构传感器；磁性分离后信号转导元件中的蔗糖转化酶水解蔗糖为葡萄糖，血糖仪直接定量。本发明灵敏度高、特异性强、精确性高、操作简单、检测快速、成本低。

Description

基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感 器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食源性致病菌检测技术领域，具体涉及一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
致病性细菌感染对全球公共卫生构成严重威胁，其高发病率和高死亡率给社会带来了巨大的经济负担。为有效预防病原菌感染，开展护理点(POC)病原学检测对临床诊断、食品检验和环境监测具有重要意义，特别是在世界欠发达地区，意义更加巨大。传统的基于培养的方法一直是病原菌分析的金标准。但这些方法往往耗时费力，不符合病原菌POC检测的要求。聚合酶链反应(PCR)程序也被广泛用于定量和定性分析病原菌。然而，外源污染可能导致假阳性或阴性结果。同样，核酸需要提取，而且技术的可移植性也受到限制。
为了建立一种简单、快速、灵敏的病原菌检测方法，基于药物分子识别(如抗体和适体)的POC免疫测定生物传感器方法的发展，引起了社会各界越来越多的关注。基于抗体的夹心免疫分析由于其高度特异性的抗原识别能力而成为目前常用的平台。然而，抗体的制备过程很繁琐，而且生产成本也很高。目前适体也被提出作为替代分子识别元件。与抗体和适配体相比，肽具有更高的抗变性和稳定性。肽也具有短而清晰的结构，它们对许多分析物(如蛋白质、核酸和金属离子)具有特异性和强亲和力。就其性质而言，肽作为开发灵敏、方便的生物传感器的有效识别元件受到广泛关注。
抗菌肽(AMPs)作为生物体的一种抗菌防御系统，对高抗原性细菌细胞表面具有高度的亲和力和特异性。迄今为止，许多技术已被用于将肽与信号标记物(如荧光团、酶和纳米颗粒)结合或将肽固定在载体表面(如磁珠、载玻片、石墨烯和金电极)。然而，这些方法需要AMPs的化学基团衍生化以结合载体或化学修饰以标记信号标记物。这些方法消耗大量试剂，价格昂贵，并且制备过程过于复杂。如果采用不恰当的固定化方案，AMP活性可能会受到损害，例如，由于AMPs的N-末端衍生化而导致对细菌亲和力下降，或者由于AMPs过量标记的氨基特异性生物素引起其微生物结合活性的丧失。为了解决这一瓶颈，应设计一种简单有效的方法，以实现肽偶联生物大分子(如蛋白质、酶)，并结合到载体表面(如磁珠、载玻片等)，同时保持肽的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度、高特异性、高精确性、操作简单、检测快速、成本低的基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器，主要包括：
Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物。
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
步骤二、合成CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物。
作为优选的实施方式，步骤一中，Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的合成方法具体包括以下步骤：
(1)取10mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8mL、10mM、pH7.4的PBS中；
(2)加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
(3)12000转/分离心5min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的终浓度为5mg/ml。
作为优选的实施方式，所述抗菌肽Magainin I的氨基酸序列为GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS。
作为优选的实施方式，步骤二中，Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的合成方法具体包括以下步骤：
(1)取0.4mg抗菌肽CecropinP1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4mM、pH7.0的PBS中；
(2)加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
(3)12000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的终浓度为2.5mg/ml。
作为优选的实施方式，所述抗菌肽Cecropin P1的氨基酸序列为SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR。
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
步骤二、合成CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物；
步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品；
步骤四、利用Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物、Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测。
作为优选的实施方式，步骤一中，Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的合成方法具体包括以下步骤：
(1)取10mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8mL、10mM、pH7.4的PBS中；
(2)加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
(3)12000转/分离心5min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的终浓度为5mg/ml。
作为优选的实施方式，步骤二中，Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的合成方法具体包括以下步骤：
(1)取0.4mg抗菌肽CecropinP1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4mM、pH7.0的PBS中；
(2)加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
(3)12000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的终浓度为2.5mg/ml。
作为优选的实施方式，步骤三和步骤四具体包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌O157:H7菌株在Luria-Bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500rpm离心10min，PBS洗涤两次，并重悬于1mM、pH 7.4的PBS中，将细菌悬浮液在PBS中连续稀释10倍；
(2)将100μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液加入到离心管中，PBS缓冲液作阴性对照，加入6μL、5mg/mL的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物和10μL、2.5mg/ml的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物，混合均匀，在37℃下培养90min，以形成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物-大肠杆菌O157:H7-CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物共轭夹心免疫复合物；
(3)磁分离后，用1mM、pH 8.5的PBS洗涤两次以去除未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物；
(4)将10μL、500mM、pH 4.5的蔗糖溶液加入到三明治式免疫复合物中，在55℃下孵育20min，取出5μL上清液，使用血糖仪PGM进行葡萄糖测定，PGM信号与大肠杆菌O157:H7产生定量关系。
发明原理：本发明使用Fe3O4嵌入的Magainins I-Cu3(PO4)2花状纳米复合材料(Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物，简称MMP)作为捕获元件，用于大肠杆菌O157:H7的磁性分离；同时使用Cecropin P1-转化酶-Ca3(PO4)2花状纳米复合材料(Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物，简称PIP)作为传感器夹心免疫复合结构中的信号转导元件；在大肠杆菌O157:H7的存在下，在两个基于抗菌肽的磷酸盐纳米复合物之间形成了共轭夹心免疫复合物；共轭夹心免疫复合物中的转化酶将蔗糖水解为葡萄糖。因此，该葡萄糖浓度反映了大肠杆菌O157:H7的水平，可以在血糖仪PGM上进行可靠地定量。
本发明的有益效果是：本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器，主要利用两种抗菌肽-磷酸盐纳米复合物，其中以Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物为捕获元件进行细菌磁性分离，以CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物作为信号转导元件。抗菌肽Magainins I和抗菌肽CecropinP1均具有优异的大肠杆菌O157:H7结合能力，因此被选为三明治式免疫分析生物传感器的识别分子。
本发明在温和的一锅法中制备了AMPs-磷酸盐纳米复合材料对，并通过AMPs-磷酸盐纳米复合材料对夹心结构和个人血糖仪(PGM)实现信号读取。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)高灵敏度。本发明通过将阳离子AMPs自组装固定在磷酸盐晶体上，建立了基于纳米复合物对的三明治式免疫分析生物传感器，其检测限大约是现有方法的100倍以上。阳离子肽通过侧链氨基酸的正电荷优先吸附到带负电荷的细菌细胞膜上，阳离子AMPs的自组装过程不会减少侧链上的净正电荷，在该过程中，肽分子通过金属离子与肽链中酰胺基的配位与磷酸盐形成络合物。因此，作为细菌识别分子的纳米复合材料对中的阳离子AMPs仍与阴离子细菌膜保持出色的静电相互作用。由于纳米复合物以丰富的AMP的聚集体形式存在，因此使本发明成为一种用于免疫测定的更有效的分子识别生物传感器。此外，温和的载体(磷酸盐)提供了足够的生物相容性位点，以自由定向的方式满足AMP的固定化要求，从而有效地保持了AMP的识别活性。同样，纳米复合物对的高比表面积结构充分发挥了AMPs肽链对细菌细胞的靶向结合的可及性。这些因素确保了基于纳米复合物对的夹心免疫分析的生物传感器系统对目标检测敏感。
(2)高特异性。本发明中目标物以外的其他细菌对本检测体系无干扰，这是因为本发明的传感器的构建是建立在抗原-抗体特异性识别的基础上。两亲性阳离子抗菌肽Magainins I对革兰氏阴性致病性大肠杆菌O157:H7保持高特异性。
(3)高精确性。本发明检测结果准确、可靠，回收率为86.5％-117％，相对标准偏差为2.9％-6.9％。
(4)操作简单、检测快速。本发明合成双抗菌肽-磷酸盐纳米复合物之后，仅加入食源性致病菌样品实现“一步孵育法”、PGM快速读数检测两个步骤即可完成。本发明几乎不需要其他额外时间，检测快速完成，操作简单方便。
(5)成本低。由于本发明中不再添加其他昂贵试剂，大大节约了制备和检测成本。
附图说明
图1为实施例1制备的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)的SEM图和XRD峰图。
图2为实施例2制备的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)的SEM图和XRD峰图。
图3为实施例2合成的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)的催化活性分析结果和保存时间活性分析结果。
图4为本发明应用抗菌肽-磷酸盐纳米复合物对的夹心免疫分析法快速检测食源性致病菌的原理图。
图5不同浓度大肠杆菌O157:H7的PGM信号值与大肠杆菌O157:H7的浓度对数的线性关系图。
图6浓度为105CFU/mL的不同菌株的PGM信号值的对比图。
具体实施方式
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器，主要包括：
Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)；
Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)。
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)
(1)取10mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8mL、10mM、pH7.4的PBS中；
(2)加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
(3)12000转/分离心5min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的终浓度为5mg/ml。
其中，抗菌肽Magainin I的氨基酸序列为GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS。
步骤二、合成CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)
(1)取0.4mg抗菌肽CecropinP1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4mM、pH7.0的PBS中；
(2)加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
(3)12000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的终浓度为2.5mg/ml。
其中，抗菌肽Cecropin P1的氨基酸序列为SWLSKTAKKLENSAKKRISEG IAIAIQGGPR。
本发明的一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)
(1)取10mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8mL、10mM、pH7.4的PBS中；
(2)加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
(3)12000转/分离心5min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的终浓度为5mg/ml。
步骤二、合成CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)
(1)取0.4mg抗菌肽CecropinP1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4mM、pH7.0的PBS中；
(2)加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
(3)12000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
(5)将冻干粉重新悬浮在1mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的终浓度为2.5mg/ml。
步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品
将大肠杆菌O157:H7菌株在Luria-Bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500rpm离心10min，PBS洗涤两次，并重悬于1mM、pH 7.4的PBS中，将细菌悬浮液在PBS中连续稀释10倍，备用。
步骤四、利用Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物、Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测：
(1)将100μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液加入到离心管中，PBS缓冲液作阴性对照，加入6μL、5mg/mL的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物和10μL、2.5mg/ml的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物，混合均匀，在37℃下培养90min，以形成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物-大肠杆菌O157:H7-CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物共轭夹心免疫复合物；
(2)磁分离后，用1mM、pH 8.5的PBS洗涤两次以去除未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物；
(3)将10μL、500mM、pH 4.5的蔗糖溶液加入到三明治式免疫复合物中，在55℃下孵育20min，取出5μL上清液，使用血糖仪PGM进行葡萄糖测定，PGM信号与大肠杆菌O157:H7产生定量关系。测定一系列不同浓度的食源性致病菌对应的葡萄糖浓度值的大小，建立葡萄糖浓度值与食源性致病菌浓度(CFU/mL)之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中食源性致病菌浓度。本发明的优点是检测过程实现一步法检测，达到精确检测食源性致病菌的目的，具有高灵敏度、高特异性、操作简单、检测快速、易于操作和实验成本低等优点。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的合成
(1)取10mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8mL、10mM、pH7.4的PBS中；
(2)加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，立即震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
(3)12000转/分离心5min产生MMP黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后立即置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得MMP冻干粉置于-20℃保存；
(5)将MMP冻干粉重新悬浮在1mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的最终浓度为5mg/ml。
从图1A中可以看出，在低放大倍率下，大多数MMP纳米复合材料具有统一的结构。在图1B的高放大倍率下，MMP纳米复合材料具有50～60μm的粒径，呈现均匀的绣球状颗粒。从图1B中的插图显示，MMP纳米复合材料是一种多空隙结构，具有高的表面体积比，其中嵌入了磁性粒子Fe3O4(MNPs)。由此证明，实施例1制备的MMP纳米复合材料具有稳定的磁性，可用于目标分离。如图1C所示，验证了MMP纳米复合材料的晶体结构，MMP纳米复合材料的衍射图与标准卡片Fe3O4(JCPDS 01-077-1545)和Cu3(PO4)2·3H2O(JCPDS00-022-0548)非常吻合。
实施例2CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物的合成
(1)取0.4mg抗菌肽CecropinP1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4mM、pH7.0的PBS中；
(2)加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
(3)12000转/分离心5min产生PIP白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
(4)加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后立即置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得PIP冻干粉置于-20℃保存；
(5)将PIP冻干粉重新悬浮在1mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的最终浓度为2.5mg/ml。
如图2D的SEM图像所示，所制备的PIP纳米复合材料具有约2μm的花状纳米结构。如图2E的SEM图像显示，PIP纳米复合材料由数百个纳米板组装而成的分层结构。如图2F所示，PIP粉末XRD图谱与标准卡片Ca3(PO4)2·nH2O(JCPDS 00-018-0303)吻合。
实施例3CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)的催化活性分析和保存时间活性分析
将实施例2合成的CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物的催化活性与游离转化酶的催化活性进行比较，具体步骤如下：
(1)在PBS缓冲液(1mM，pH 4.5)中准备不同浓度(10-600mM)的蔗糖标准溶液。
(2)将体积为2μL的PIP纳米复合材料(0.25mg/mL)添加到10μL不同浓度的蔗糖标准溶液中，并在55℃下孵育2min；在PGM上测量葡萄糖浓度。
(3)对照组使用游离转化酶溶液(0.25mg/mL)代替固定化转化酶(PIPs)进行同步骤(2)中的操作。
由图3A显示，与游离转化酶相比，PIP纳米复合材料中固定化转化酶的催化活性显著提高。这主要归因于钙离子和转化酶之间的协同相互作用。由图3B显示，固定化酶在PBS(1mM，pH 7.0)中保存30天后，保持90％以上的催化活性。相反，游离酶几乎丧失了全部活性。因此，本发明合成的PIP纳米复合材料具有很高的催化活性和稳定性，可以满足生物传感器基于酶的信号放大策略。
实施例4食源性致病菌的检测
利用实施例1制备的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)和实施例2制备的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)实现基于夹心免疫法检测食源性致病菌的方法，原理如图4所示，具体包括以下步骤：
(1)将实施例1制备的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物(MMP)(5mg/mL)取6μL，加入到离心管中。
(2)将100μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液(PBS缓冲液代替大肠杆菌O157:H7悬浮液作为阴性对照)加入到上述离心管中。
(3)将实施例2制备的Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物(PIP)(2.5mg/ml)取10μL，加入到上述离心管中，混合均匀，在37℃恒温箱内孵育90min，以形成MMP-大肠杆菌O157:H7-PIP共轭夹心复合物。
(4)磁分离后，在PBS(1mM，pH 8.5)中洗涤两次以去除未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物。
(5)将10μL的500mM蔗糖溶液(pH 4.5)加入到上述离心管中，在55℃下孵育20min，最后取出5μL上清液，并使用PGM(商业血糖仪)进行葡萄糖测定。测定一系列不同浓度的食源性致病菌对应的葡萄糖浓度值的大小，建立葡萄糖浓度值与食源性致病菌浓度(CFU/mL)之间的定量关系；根据该定量关系即可测定未知样品中食源性致病菌浓度。
如图5所示，葡萄糖浓度信号值与大肠杆菌溶液浓度的对数之间呈现线性关系，线性范围为101～107CFU/mL，线性方程为y＝49.029x+53.743，相关系数为0.9839，检测限为10CFU/mL，线性良好，可以用于未知样品检测。
实施例5特异性试验
使用大肠杆菌O157:H7、非致病性大肠杆菌菌株和两种革兰氏阳性病原体(金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌)测试了本发明的特异性。具体步骤同上述实施例4，其区别在于将实施例4中(2)项所述的“不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液”分别换成：
i.“105CFU/mL的大肠杆菌O157:H7悬浮液”；
ii.“105CFU/mL的非致病性大肠杆菌悬浮液”；
iii.“105CFU/mL的金黄色葡萄球菌悬浮液”；
iv.“105CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌悬浮液”。
从图6中可以看出，105CFU/mL的大肠杆菌O157:H7引发了强烈的PGM信号，而105CFU/mL的非致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌则没有显着的PGM信号，类似于空白对照(PBS)。从这些数据可以看出，本发明的传感器对检测革兰氏阴性致病性大肠杆菌O157:H7保持高特异性。
实施例6准确性试验
为了考察本发明的准确性与实际应用价值，采用加标回收法，即在脱脂牛奶中加入一定浓度的大肠杆菌O157:H7。使用本发明的传感器进行检测，检测结果如表1所示。由表1可知，回收率均在86.5％to 117％之间，相对标准偏差为2.9％-6.9％，这表明本发明对于水样中多种食源性致病菌的检测结果准确可靠。
表1牛奶中大肠杆菌O157:H7的检测结果
Figure BDA0002235207360000131
本发明公开了一种基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (5)

1.基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器，其特征在于，包括：
Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物；
该基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
（1）取10 mg Fe3O4和0.6mg抗菌肽Magainins I加入到8 mL、10 mM、pH7.4的PBS中；
（2）加入400μL、120mM的硫酸铜溶液，使用超纯水定容至10mL，震荡混匀，在25℃下孵育16小时；
（3）12000转/分离心5min产生黑色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
（4）加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
（5）将冻干粉重新悬浮在1 mM、pH7.4的PBS中，所得Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物的终浓度为5 mg/ml；
步骤二、合成Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物；
（1）取0.4mg抗菌肽Cecropin P1和3.6mg蔗糖转化酶加入到8mL、4 mM、pH7.0 的PBS中；
（2）加入160μL、200mM的CaCl2溶液，使用超纯水定容至10mL，混合均匀，将混合液在25℃下静置12小时；
（3）12000转/分离心5min产生白色沉淀物，纯水洗涤两次，离心去除上清；
（4）加入5mL纯水置于-20℃下冷冻，然后置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，所得冻干粉置于-20℃保存；
（5）将冻干粉重新悬浮在1 mM、pH 7.0的PBS中，所得Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物的终浓度为2.5 mg/ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽Magainin I的氨基酸序列为GIGKFLHSAGKFGKAFVGEIMKS。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽Cecropin P1的氨基酸序列为SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR。
4.如权利要求1所述的基于抗菌肽-磷酸盐纳米复合物的致病菌免疫分析生物传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、合成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物；
步骤二、合成Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物；
步骤三、制备大肠杆菌O157:H7样品；
步骤四、利用Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物、Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物对大肠杆菌O157:H7样品进行检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤三和步骤四具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌O157:H7菌株在Luria-Bertani肉汤培养液中于37℃孵育过夜，4500rpm离心10min，PBS洗涤两次，并重悬于1mM、pH 7.4的PBS中，将细菌悬浮液在PBS中连续稀释10倍；
（2）将100μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7悬浮液加入到离心管中，PBS缓冲液作阴性对照，加入6μL、5mg/mL的Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物和10μL、2.5 mg/ml的CecropinP1-转化酶磷酸钙纳米复合物，混合均匀，在37℃下培养90min，以形成Fe3O4-Magainins I磷酸铜纳米复合物-大肠杆菌O157:H7-Cecropin P1-转化酶磷酸钙纳米复合物共轭夹心免疫复合物；
（3）磁分离后，用1mM、pH 8.5的PBS洗涤两次以去除未结合的细菌细胞和非特异性结合部分，得到三明治式免疫复合物；
（4）将10μL、500 mM、pH 4.5的蔗糖溶液加入到三明治式免疫复合物中，在55℃下孵育20min，取出5μL上清液，使用血糖仪PGM进行葡萄糖测定，PGM信号与大肠杆菌O157:H7产生定量关系。
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