CN111499751B - 一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.2、4和6分别所示的CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区包含如SEQ ID NO.9、11和13分别所示的CDR1、CDR2和CDR3。采用本发明单克隆抗体可以特异性检测出白菜在感染根肿病初期过氧化氢酶的含量，可用于制备早期诊断十字花科农作物感染根肿病的制剂或试剂盒。

Description

一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属植物免疫学技术领域，具体涉及过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用。
背景技术
过氧化氢酶(catalase，CAT1)是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体造成损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质。而过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具。过氧化氢酶通常定位于一种被称为过氧化物酶体的细胞器中。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸(利用氧气并生成二氧化碳)和共生性氮固定(将氮气(N2)解离为活性氮原子)。但细胞被病原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。部分病原体，如结核杆菌、嗜肺军团菌和空肠弯曲菌，能够生产过氧化氢酶以降解过氧化氢，使得它们能在宿主体内存活。
作为一种物质，过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢(H2O2)的发现者泰纳尔(LouisJacques Thénard)首次发现。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的分子量。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。而后，1981年，其三维结构得以解析。
白菜根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)引起的对十字花科农作物(白菜、油菜、甜菜和芜菁等)造成广泛而致命危害的一种农业病害。引起白菜根肿病的病原物—芸薹根肿菌(P.brassicae)属于原生生物界[1]，为一种黏菌，侵染十字花科植物的根部，诱发宿主根部组织增生、肥大，形成肿瘤，并最终导致宿主植株由于缺乏营养而萎蔫死亡。对于人类来说,完全或者部分缺失过氧化物酶体都会引起严重的疾病[2-3],而过氧化物酶体与病原真菌的致病性密切相关。过氧化物酶体不仅与乙醛酸循环及脂肪酸β-氧化途径密切相关,而且对病原真菌的侵染能力也有重要的影响。根肿病菌侵染后，细胞内的活性氧迅速积累，同时保护酶类，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、过氧化氢酶(CAT)活性也随之升高。保护酶类相互协调可以大大增加酚氧化物的含量，引起过敏性反应，抵制病原菌的侵染；同时促进某些抑菌物质(如植保素、木质素等)的生产，毒杀病原菌，还能使细胞壁增厚，抵挡根肿病菌的侵染，增强抗逆性。过氧化氢酶是我们研究中鉴定到的一个与白菜根肿病发病相关的潜在标志物。芸薹根肿菌目前尚不能在人工合成的培养基上培养,因此，用传统研究方法很难对芸薹根肿菌进行鉴定并作出早期诊断。随着分子生物学技术的迅速发展，应用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术,进行植物病害的分子鉴定、生态监测等成为了一种重要的手段，但是该方法精确度不高，设计的引物有针对性，一个引物并不能针对所有的根肿病菌所包含的生理小种完成检测，存在一定的局限性。
目前市面上并没有专门针对白菜研究的过氧化氢酶的靶向抗体，因此，在蛋白组学层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具用于白菜蛋白组层面以及在抗白菜根肿病中的应用。
[1]Hwang S-F,Strelkov SE,Feng JIE,Gossen BD,Howard RJ.Plasmodiophorabrassicae.A review of an emerging pathogen of the Canadian canola(Brassicanapus)crop.Mol Plant Pathol.2012,13:105-113.
[2]王教瑜，吴小燕，杜新法，等.植物病原真菌过氧化物酶体的发生机制及功能[J].微生物学报，2008,48(12)：1681-1686.
[3]Boisnard S,Espagne E,Zickler D,et al.Peroxisomal ABC transportersandβ-oxidation during the life cycle of the filamentous fungus Podosporaanserine[J].Fungal Genet Biol,2009,46(1):55-66.
发明内容
为解决白菜根肿病的生化检测的技术问题，本发明提供一种检测过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用。
本发明所提供的一种用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体的重链可变区包含如SEQID NO.2所示的CDR1、如SEQ ID NO.4所示的CDR2和如SEQ ID NO.6所示的CDR3；和轻链可变区包含如SEQ ID NO.9所示的CDR1、如SEQ ID NO.11所示的CDR2和如SEQ ID NO.13所示的CDR3。
进一步，所述重链可变区的骨架区依次选自SEQ ID NO.1、3、5和7，和所述轻链可变区骨架区依次选自SEQ ID NO.8、10、12和14。
本发明还提供上述用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体在检测十字花科作物感染根肿病过程中过氧化氢酶含量的应用。
本发明还提供上述用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体在制备检测十字花科作物感染根肿病过程中过氧化氢酶含量制剂的应用。
本发明还提供一种检测十字花科作物感染根肿病过程中过氧化氢酶含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体。
上述十字花科作物包括但不限于白菜、油菜、甜菜或芜菁。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
实验表明，白菜在感染根肿病后，过氧化氢酶量是上调的，本发明用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体，对过氧化氢酶具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对过氧化氢酶检测上，特别可用于检测白菜根肿病感病的不同时期过氧化氢酶的含量变化；可早期诊断十字花科农作物感染根肿病的情况，利于对根肿病的早期防治。
此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同白菜品种以及白菜感染根肿病的不同感病时期的蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。
附图说明
图1：白菜感染根肿病和未感染根肿病的根全蛋白裂解液与克隆号为1L3抗体的蛋白印记WB验证结果示意图。图1中，1表示未感染根肿病的白菜28天的根，2表示感染根肿病的白菜28天的根。
图2为Anti-CAT1抗体对目标蛋白的富集效果芯片上的结果图；图2中，Anti-CAT1表示CAT1的抗体，对照抗体表示的是阴性对照免疫球蛋白G(IgG)抗体。
图3为Anti-CAT1抗体通过Dot Blot方法检测迷您黄1号、抗大3号两个白菜品种在不同感染根肿病时期的蛋白表达量结果。图3中，CK-28表示未感染根肿病时期，S-28表示感染根肿病的初期，S-35表示感染根肿病的高峰期。
图4为Anti-CAT1抗体通过Dot Blot方法检测迷您黄1号、抗大3号两个白菜品种在不同感染根肿病时期的CAT1蛋白表达量量化分析图。图4中，横坐标为白菜感染根肿病的时间坐标，纵坐标为dot blot检测值，CK-28表示未感染根肿病时期，S-28表示感染根肿病的初期，S-35表示感染根肿病的高峰期。
图5为Anti-CAT1抗体通过WB方法检测迷您黄1号、抗大3号两个白菜品种在不同感染根肿病时期的蛋白表达量结果；图5中，A:迷您黄1号；B:抗大3号；1：未感染时期CK-28，2：感染初期S-28，3：感染高峰期S-35；4：未感染时期CK-28，5：感染初期S-28，6：感染高峰期S-35。
图6为Anti-CAT1抗体通过WB方法检测迷您黄1号、抗大3号两个白菜品种在不同感染根肿病时期的蛋白表达量量化分析图。图6中，横坐标为白菜感染根肿病的时间坐标，纵坐标为WB检测值，CK-28表示未感染根肿病时期，S-28表示感染根肿病的初期，S-35表示感染根肿病的高峰期。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详细说明本发明，实施例中无特殊说明的为本领域的常规方法。实施例中所用的试剂以及白菜品种：迷您黄1号(易感根肿病品种)、抗大3号(抗根肿病品种)均为云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组育成的品种，可通过商业渠道购买到。
实施例1过氧化氢酶的单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗过氧化氢酶的单克隆抗体的制备和纯化
本发明合成三组过氧化氢酶多肽，即三组‘VRPSSAHDSP’‘DSDRQERFVK’和‘GERYRSWDSD’，分别以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够分泌高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱和抗体芯片检测等验证，确定最有效抗体。
1.1抗原的制备
合成三组过氧化氢酶多肽：‘VRPSSAHDSP’，‘DSDRQERFVK’和‘GERYRSWDSD’，并分别以其作为免疫原，上述各多肽也均偶联了VLP用于增强免疫原性的类病毒颗粒(Virus LikePartical，VLP)以及传统用于增加免疫原性的血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)系统的免疫原性增强因子。
1.2免疫小鼠
每组抗原用来免疫6只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(过氧化氢酶的重组蛋白作为抗抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续1-2次加强，至滴度最高后融合。
1.3血清检测和筛选
免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度(过氧化氢酶的重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10K，否则继续加强免疫。
1.4融合及筛选
取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。工艺为优化过的PEG融合。融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞102到104)，进行培养。收集所有孔的上清，用ELISA对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检测原的反应。阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序。每个多肽免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆。每个可溶片段免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆。
1.5亚克隆及筛选
通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞。细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部。ELISA检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆。重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％，此时得到单克隆细胞株。经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。
1.6抗体上清制备和纯化
最终获得8株单克隆细胞株，并通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产。产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测。
实施例2抗CAT1单克隆抗体的验证
对获得的8株单克隆抗体细胞株进行免疫酶联，蛋白印记，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。
2.1抗体与抗原多肽的Elisa(免疫酶联)配对验证
取待配对腹水抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，PBS洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，PBS洗涤，同时设置对照。HRP标记检测抗体，加入到孵育有前述的ELISA板中。TMB显色反应，酶标仪读数。筛选得到8个细胞株的效价如表1所示：
表1抗体ELISA检测数据
抗体名称 克隆号 3.125K 6.25K 12.5K 25K 50K 100K 200K 400K 800K 1600K PC NC 是否返工 效价
4015-1RE-2 1L3 3.608 2.966 3.013 2.966 2.872 2.295 1.883 1.013 0.581 0.341 4.000 0.112 合格 800K
2.2抗体的内源蛋白印记(WB)验证
使用白菜感染根肿病28天(将大白菜根肿病肿根搅碎，加水没过肿根组织，密封放置24h促使游动孢子从孢子囊里充分释放，8层纱布过滤，血球计数板计数并调整接种液浓度为1×108个/mL，在播种后的第9天用注射器对迷您黄1号白菜幼苗进行菌液的注射。)的材料和水处理28天对照材料的全蛋白裂解液，抗体稀释浓度1∶1000进行WB验证。实验结果显示，anti-CAT1(克隆1L3)在WB验证中，可以特异性的识别55KD条带，与预期大小相符，同时，该蛋白(过氧化氢酶)在白菜感染根肿病之后表达量明显上升，如图1所示。
2.3抗体芯片检测实验
使用芯片点样仪将anti-CAT1(克隆1L3)抗体及对照抗体IgG点制于以NC膜为基质的玻璃片，形成直径为100μm的抗体点。将白菜全蛋白进行生物素标记，按2μg/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时。PBS轻柔清洗三遍，再用CY3-SA荧光二抗进行孵育，PBS清洗三遍，使用GenePix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。
实验结果如图2所示，Anti-CAT1抗体对目标蛋白有明显富集结合效果，荧光强度较强，而对照抗体没有发生抗原抗体结合反应。
实施例3本发明的一种检测过氧化氢酶的单克隆抗体在白菜感染根肿病不同阶段检测的应用
由于本发明的抗体对过氧化氢酶具有独特的特异性，可作为专门检测白菜感染根肿病的不同感染阶段的检测抗体，或者本领域根据常规技术手段也可将其进一步开发为检测试剂盒。
首先，本发明抗体以固定浓度(1mg/ml)与2种品种的白菜(易感根肿病品种迷您黄1号，抗根肿病品种抗大3号)的不同感染阶段的白菜根进行Dot blot实验，得到相应的表达量值，并绘制出标准曲线，横坐标为白菜感染根肿病的时间坐标，纵坐标为dot blot检测值，如表2、图3、图4所示。
表2两个白菜品种不同感染时期的CAT1蛋白Dot blot结果
Figure BDA0002478806020000061
表2中CK-28表示未感染时期，S-28表示感染初期，S-35表示感染高峰期。
表2表明感染后CAT1的检测DotBlot值上调，图3表明感染后CAT1的Dot blot检测表达量上调，图4是图3的图像量化分析的数值展示。
同时，本发明抗体以另一种检测方式进行白菜根肿病的感病状态监测，将2种品种的白菜(易感根肿病品种迷您黄1号，抗根肿病品种抗大3号)的不同感染阶段的白菜根进行W B实验，得到相应的表达量值，并绘制出标准曲线，横坐标为白菜感染根肿病的时间坐标，纵坐标为WB检测值，如表3、图5、图6所示。
表3两个白菜品种不同感染时期的CAT1蛋白WB检测结果
Figure BDA0002478806020000071
表3中CK-28表示未感染时期，S-28表示感染初期，S-35表示感染高峰期。
表3表明感染后CAT1的WB检测值上调，图5表明感染后初期CAT1的WB检测值均上调，同时迷您黄1号在后期持续表现高表达值，而抗根肿病品种抗大3号在后期表达值出现下降，图6是图5的图像量化分析的数值展示。
实施例4
将1L3克隆号anti-CAT1抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总RNA，将mRNA反转录成第一链cDNA；通过PCR扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。
序列表
<110> 云南省农业科学院园艺作物研究所
<120> 一种用于检测白菜过氧化氢酶的单克隆抗体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (1)..(9)
<223> VLCDR3
<400> 13
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> BINDING
<222> (1)..(10)
<223> VLFR4
<400> 14
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
1 5 10

Claims (5)

1.一种用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的CDR1、如SEQ ID NO.4所示的CDR2和如SEQ ID NO.6所示的CDR3；和轻链可变区包含如SEQ ID NO.9所示的CDR1、如SEQ ID NO.11所示的CDR2和如SEQID NO.13所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的骨架区依次选自SEQ ID NO.1、3、5和7，和所述轻链可变区骨架区依次选自SEQ IDNO.8、10、12和14。
3.权利要求1所述的用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体在检测白菜感染根肿病过程中过氧化氢酶含量的应用。
4.权利要求1所述的用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体在制备检测白菜感染根肿病过程中过氧化氢酶含量制剂的应用。
5.一种检测白菜感染根肿病过程中过氧化氢酶含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测过氧化氢酶的单克隆抗体。
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