CN111303261A

CN111303261A - 一种用于检测葡萄败育相关转录因子的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN111303261A
Application number: CN202010179890.2A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 刘崇怀; 樊秀彩; 姜建福; 李民
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-03-16
Also published as: CN111303261B; WO2021184492A1

Abstract

本发明提供了一种MADS转录因子(MADS5)的单克隆抗体及其应用。本发明的MADS5的单克隆抗体，对MADS5蛋白具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对MADS5检测上，特别可用于检测市售各品种葡萄中MADS5蛋白的表达情况；此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同败育品种葡萄中MADS5蛋白的表达与最终葡萄有无核的形成之间的调控关系能够有效地研究。

Description

一种用于检测葡萄败育相关转录因子的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于检测葡萄败育相关转录因子的单克隆抗体及其应用。

背景技术

MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子，在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用，在动物、植物、真菌中都存在。MADS-box基因在动物中与心肌发育有关；在酵母中起信息素应答作用；在植物中参与花器官的发育，开花时间的调节，在果实、根、茎、叶的发育中都起着重要的作用。MADS-box基因的名称来自酿酒酵母转录因子MCMl、拟南芥花同源异型基因AGAMOUS、金鱼草花同源异型基因DEFICIENS和人血清应答因子SRF4种蛋白的首字母，这4种蛋白质都有一个由56-58个氨基酸组成的高度保守区域称为MADS-box结构域，具有这一结构域的基因都是MADS-box基因，属于MADS-box基因家族。

根据之前的研究发现，在葡萄种子发育过程中，MADS5基因的表达与最终是否形成可繁育的种子之间具有明确的调控关系，即MADS5基因的表达与否，决定了葡萄的败育现象。目前市场中，大量出售的葡萄品种中，一部分是自然选育出来的天然败育品种，一部分是经过人工诱导的无核品种。MADS5基因的高表达促进了种子的形成，而其低表达或不表达引起种子的败育形成天然无核果实。

目前市面上并没有专门针对葡萄MADS5基因的抗体，因此在蛋白检测层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具，用于葡萄败育的基础研究，以及市售品种中那些无核品种的葡萄在蛋白层面的检测。

发明内容

本发明提供一种MADS转录因子(MADS5)的单克隆抗体及其应用，以解决现有技术存在的上述缺陷，本发明通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对市售的不同品种葡萄中的MADS5蛋白的表达变化及蛋白网络图谱可以实现更深层次研究。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明通过合成表达MADS5的全长重组蛋白，氨基酸序列SEQ ID NO.1：MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRVYEYSNNNIKSTIDRYKKASSDSTNGGSTMEINAQYYQQESAKLRQQIQMLQNSNRHLMGDSLASLTVKELKQLENRLERGITRIRSKKHELLLAEIEYLQKREIELENESVYLRTKIAEVERLQQANMVSTHEFNAIQALVSRNFFQPNMIEGGSTGYPLPDKKVLHLG，以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和ELISA法，得到能够产出高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱和抗体芯片检测等验证，确定最有效抗体。

一种葡萄败育相关蛋白，所述蛋白由MADS5基因表达。

进一步地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种检测葡萄败育相关蛋白的单克隆抗体。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，重链可变区的CDR-H2包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，重链可变区的CDR-H3包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR-L1包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR-L2包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR-L3包含如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

本发明还公开了上述MADS5的单克隆抗体在检测MADS5蛋白表达上的应用，包括用于检测各种无核品种葡萄的MADS5的表达，以及葡萄发育不同时期的MADS5的表达与葡萄败育的关系。

一种检测MADS5蛋白的试剂盒，包括本发明所述的单克隆抗体，所述抗体的固定浓度为1mg/ml。

本发明的有益效果：本发明的MADS5的单克隆抗体，对MADS5蛋白具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对MADS5检测上，特别可用于检测市售各品种葡萄中MADS5蛋白的表达情况；此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同败育品种葡萄中MADS5蛋白的表达与最终葡萄有无核的形成之间的调控关系能够有效地研究。

附图说明

图1为17个单克隆抗体的ELISA检测曲线图结果；

图2为Anti-MADS5抗体对目标蛋白的富集效果图，芯片上的结果图；

图3为Anti-MADS5抗体通过Western Blot方法检测重组蛋白的结果；

图4为Anti-MADS5抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(乍娜)中的MADS5的表达量结果；

图5为Anti-MADS5抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(阳光玫瑰)和无核品种(无核白)在果实发育的2个时期中的MADS5的表达量结果；

图6为Anti-MADS5抗体通过Western Blot方法检测有核品种葡萄(阳光玫瑰)和无核品种(无核白)在果实发育的2个时期中的MADS5的表达量结果量化分析图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1 MADS5转录因子的单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗MADS5蛋白的单克隆抗体的制备和纯化

1.1抗原的制备

通过克隆MADS5的全长基因，重组表达MADS5的全长蛋白，其氨基酸序列如下：

MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGLLKKAYELSVLCDAEVALIVFSSRGRVYEYSNNNIKSTIDRYKKASSDSTNGGSTMEINAQYYQQESAKLRQQIQMLQNSNRHLMGDSLASLTVKELKQLENRLERGITRIRSKKHELLLAEIEYLQKREIELENESVYLRTKIAEVERLQQANMVSTHEFNAIQALVSRNFFQPNMIEGGSTGYPLPDKKVLHLG，并以其作为免疫原来进行小鼠免疫制备单克隆抗体。

1.2免疫小鼠

将抗原免疫3只Balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原的高亲和力的抗体(IgG亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(MADS5的重组蛋白作为抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。

1.3血清检测和筛选

免疫小鼠眼眶取血，并用ELISA检测血清滴度(MADS5的重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10K，否则继续加强免疫。

1.4融合及筛选

取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合。工艺为优化过的PEG法融合。将融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞10²到10⁴)，进行培养。收集所有孔的上清，用ELISA对重组蛋白检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用ELISA检测与可溶片段检测原的反应。阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序。每个免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆。

1.5亚克隆及筛选

通过有限稀释法和ELISA筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞。将细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部。ELISA检测每个孔上清针对检测原的反应，取OD值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆。重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％。此时我们得到单克隆细胞株。经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。

1.6抗体上清制备和纯化

最终获得17株单克隆细胞株，并通过腹部注射到F1小鼠用于抗体生产。产生的腹水用Protein A/G纯化，并用于后续检测。

实施例2 抗MADS5单克隆抗体的验证

对获得的17株单克隆抗体细胞株进行免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。

2.1抗体与重组蛋白的ELISA(免疫酶联)验证

取待配对腹水抗体包被96孔ELISA板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，PBS洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，PBS洗涤，同时设置对照。HRP标记检测抗体，加入到孵育有前述的ELISA板中。TMB显色反应，酶标仪读数。抗体效价如表1所示，抗体效价的ELISA曲线如图1所示。由表1可以看出，克隆2H6的抗体效价最高。

表1：抗体ELISA检测数据

2.2抗体芯片检测实验

使用芯片点样仪将anti-MADS5(克隆2H6)抗体及对照抗体(小鼠阴性IgG抗体)点制于以NC膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点。将葡萄全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时。PBS轻柔清洗三遍，再用CY3-SA荧光二抗进行孵育，PBS清洗三遍，使用GenePix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。

实验结果如图2所示，Anti-MADS5抗体对目标蛋白有明显富集结合效果，荧光强度较强，而对照抗体没有发生抗原抗体结合反应。

2.3抗体的重组蛋白免疫印迹(WB)效价检测

使用重组蛋白裂解液，抗体稀释浓度1：1000，蛋白上样量分别为50ng、10ng、2ng、0.4ng进行WB验证。实验结果显示，anti-MADS5(克隆2H6)在WB验证中，可以特异性的识别26KD的重组蛋白条带，并且抗体检测灵敏度可达到0.4ng，如图3所示。

2.4抗体的内源蛋白免疫印记(WB)验证

使用葡萄有核品种(乍娜)核发育的2个时期(2期和4期)的全蛋白裂解液，抗体稀释浓度1：1000进行WB验证。实验结果显示，anti-MADS5(克隆2H6)在WB验证中，可以特异性的识别26KD条带，与预期大小相符，如图4所示。

实施例3 MADS5的单克隆抗体在葡萄果实发育的不同阶段检测的应用

由于本发明的抗体对MADS5具有独特的特异性，可作为专门检测葡萄果实不同发育时期的检测抗体，或者本领域根据常规技术手段也可将其进一步开发为检测试剂盒。

首先，本发明抗体以固定浓度(1mg/ml)作为检测浓度，与市场上出售的2个品种的葡萄(有核品种：玫瑰香，无核品种：无核白)的不同核发育时期的果实进行WB实验，得到相应的MADS5表达量值，并绘制出标准曲线，横坐标为葡萄果实发育时期坐标，纵坐标为WB检测值，如表2、图5、图6所示。

表2：不同核发育时期MADS5表达量

检测时期	核发育2期	核发育4期
			有核品种：玫瑰香	23.78	34.10
无核品种：无核白	0.00	0.00

由表2可以看出，无核品种中MADS5没有表达，说明通过本发明的抗体能有效检测出有核与无核品种MADS5表达量。

实施例4

将克隆号为2H6的anti-MADS5抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总RNA，将mRNA反转录成第一链cDNA；通过PCR扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果(如下表)。

SEQ ID NO.2	CDR-H1	LLVDMKLW
			SEQ ID NO.3	CDR-H2	INPDSTTI
SEQ ID NO.4	CDR-H3	AAGSWFAY
			SEQ ID NO.5	CDR-L1	QDIRNA
SEQ ID NO.6	CDR-L2	YTS
			SEQ ID NO.7	CDR-L3	QQGYALPYT

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一种用于检测葡萄败育相关转录因子的单克隆抗体及其应用

<130> 1.19

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 合成

<400> 1

Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Arg Val Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Asn Ile Lys Ser

50 55 60

Thr Ile Asp Arg Tyr Lys Lys Ala Ser Ser Asp Ser Thr Asn Gly Gly

65 70 75 80

Ser Thr Met Glu Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ser Ala Lys

85 90 95

Leu Arg Gln Gln Ile Gln Met Leu Gln Asn Ser Asn Arg His Leu Met

100 105 110

Gly Asp Ser Leu Ala Ser Leu Thr Val Lys Glu Leu Lys Gln Leu Glu

115 120 125

Asn Arg Leu Glu Arg Gly Ile Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys His Glu

130 135 140

Leu Leu Leu Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Gln Lys Arg Glu Ile Glu Leu

145 150 155 160

Glu Asn Glu Ser Val Tyr Leu Arg Thr Lys Ile Ala Glu Val Glu Arg

165 170 175

Leu Gln Gln Ala Asn Met Val Ser Thr His Glu Phe Asn Ala Ile Gln

180 185 190

Ala Leu Val Ser Arg Asn Phe Phe Gln Pro Asn Met Ile Glu Gly Gly

195 200 205

Ser Thr Gly Tyr Pro Leu Pro Asp Lys Lys Val Leu His Leu Gly

210 215 220

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成

<400> 2

Leu Leu Val Asp Met Lys Leu Trp

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成

<400> 3

Ile Asn Pro Asp Ser Thr Thr Ile

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成

<400> 4

Ala Ala Gly Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 合成

<400> 5

Gln Asp Ile Arg Asn Ala

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 合成

<400> 6

Tyr Thr Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 合成

<400> 7

Gln Gln Gly Tyr Ala Leu Pro Tyr Thr

1 5

Claims

1.一种葡萄败育相关蛋白，其特征在于，所述蛋白由MADS5基因表达。

2.如权利要求1所述的葡萄败育相关蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

3.一种检测如权利要求2所述的葡萄败育相关蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR-H1包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，重链可变区的CDR-H2包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，重链可变区的CDR-H3包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR-L1包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR-L2包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR-L3包含如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

4.如权利要求3所述的单克隆抗体在检测无核品种葡萄的MADS5蛋白中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测无核品种葡萄的MADS5蛋白为检测MADS5的表达量。

6.一种检测MADS5蛋白的试剂盒，其特征在于，包括本发明所述的单克隆抗体，所述抗体的固定浓度为1mg/ml。