JP4333961B2 - 閉花受粉性イネの作出法およびその選抜法 - Google Patents
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Description
「穂不抽出性イネ」では、穂が止葉の葉鞘に包まれているので、登熟後に病害に侵される危険性、および収穫作業の繁雑化が想定され、これもまた実用的ではない。
〔1−1〕ポリペプチド
本発明は、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは、植物におけるクラスB MADSボックスタンパク質の第45位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体であることを特徴としている。上記植物は、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物(例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、エンバク、キビ、アワ、モロコシなど)であり、最も好ましくは、イネ、オオムギまたはコムギである。
本発明はまた、植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、植物におけるクラスB MADSボックスタンパク質の第45位のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換されているポリペプチドまたはその変異体をコードすることを特徴としている。
〔2−1〕閉花受粉性が付与された植物体およびその作出方法
1つの局面において、本発明は、本発明に係るポリペプチドを発現している植物体を提供する。他の局面において、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを発現している植物体を提供する。
(I)クラスB MADSボックスタンパク質をコードする遺伝子に対して、該タンパク質の第45位のアミノ酸置換に対応する変異を誘導する工程;または
(II)クラスB MADSボックスタンパク質をコードする遺伝子において、該タンパク質の第45位のアミノ酸置換を誘導する変異を有する遺伝子を植物体に導入する工程
であり得る。すなわち、(I)は、本発明に係るポリヌクレオチドを植物体内において生成する工程であり、(II)は、本発明に係るポリヌクレオチドを植物体に導入する工程である。なお、(I)としては、(i)ジーンターゲティングによるspw1−cls型変異の導入、または(ii)突然変異源処理によるspw1−cls型変異の導入、が挙げられるが、これらに限定されない。(II)としては、(iii)spw1−cls型変異遺伝子の導入、または(iv)交配によるspw1−cls型変異の導入、が挙げられるが、これらに限定されない。
当該分野において周知の技術(例えば、ジーンターゲティング法(Terada et al., (2002),Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat Biotechnol. 20(10):1030−4))を用いて目的のアミノ酸位またはその付近に1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたクラスB MADSボックスタンパク質変異体を作製することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。
目的の植物を突然変異源物質で処理してクラスB MADSボックス遺伝子座に変異を生じさせることにより、閉花受粉性植物を作出することができる。本発明者は、日本型イネ品種「台中65号」を化学変異源物質N−methyl−N−nitrosourea(MNU)で処理して突然変異体集団を得、該集団から開花時期に雄蕊を穎の外に抽出しない突然変異体系統を選抜し、選抜された系統から正常に稔実する系統をさらに選抜することにより、閉花受粉性イネ突然変異体superwoman1−cleistogamy(spw1−cls)を得た。さらに、マップベースクローニング法により、SUPERWOMAN1(SPW1)遺伝子の変異を確認した。なお、当業者は、当該分野において周知の突然変異原物質を必要に応じて適宜選択し得る。
実施例にて後述するように、spw1−cls型変異を有するゲノムDNA断片を、クラスB MADSボックス遺伝子の機能欠失型変異体(例えば、spw1−1、spw1−2など)に導入することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。なお、当業者は、当該分野における技術常識に従って、遺伝子を首尾よく植物に導入して、その遺伝子を構成的または組織特異的に発現させることができる。
閉花受粉性を付与したい品種を、上述したように作製したspw1−cls型の変異体と交配させ、その後代のうちspw1−cls型変異をホモに有するものを選抜することにより、閉花受粉性植物を作出することができる。
本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントからなるオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド(二量体)、トリヌクレオチド(三量体)といわれ、長いものは30マーまたは100マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
本発明は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合し得るものであれば限定されず、該ポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
〔1−1.閉花受粉性を有する変異体の同定〕
閉花受粉性を有する変異体を見出すために、N−methyl−N−nitrosourea(MNU)で変異誘発したコメ(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Taichung 65)のM2集団をスクリーニングした。上記M2集団を通常の条件下で生育したところ、野生型のコメは開花期に開花し15分後に閉じたが、いくつかの葯が、穎が閉じた後もなお外側に残存した。そこで、先ず、開花期に穎の外に葯が観察されない植物を選んだ。続いて、閉花受粉性が単一の劣性形質として示される、受精能を有する系統を見出した。異なる遺伝的背景におけるこの変異体の閉花受粉性の安定性を確認するために、この変異体をcv.Kasalath(subsp.indica)と交配させ、F2集団における閉花受粉性の分離を試みた。
野生型およびspw1−clsの穎花を、FAA(ホルムアルデヒド:氷酢酸:エタノール=1:1:18)中にて4℃で24時間固定し、次いで、濃度勾配を有する一連のエタノール中にて脱水した。100%エタノール中にて脱水したサンプルをキシレンに置換し、Paraplast plus(Oxford Labware,St.Louis,MO)に包埋した。8μm厚でのミクロトーム切片をDelafield’s hematoxylineで染色し、光学顕微鏡で観察した。
新鮮なサンプルを走査型電子顕微鏡(VE−8000,Keyence,Osaka,Japan)で直接観察した。
パラフィン切片を、8μm厚のミクロトーム切片をAPSコートしたスライドガラス(Matsunami Glasses,Osaka,Japan)上にアプライした以外については上記したように調製した。SPW1、OsMADS2およびOsMADS4の全長cDNAまたは部分長cDNAより、ジゴキシゲニン標識したアンチセンスプローブおよびセンスプローブを調製した。インサイチュハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションシグナルの免疫学的検出を、Kouchi,H. and Hata,S. Mol.Gen.Genet.238,106−119(1993)に記載の方法に従って行った。
マップベースクローニングのために、ホモ接合の閉花受粉性植物とcv.Kasalath(subsp.indica)とのF2集団を使用した。CAPSマーカーを用いて、原因遺伝子を、第6染色体の長腕上にマッピングした。
ゲノムDNAフラグメントまたはcDNA(変異ありまたはなし)の全てを、PfuUltra DNA polymerase(Stratagene)を使用するPCR反応によって増幅し、その配列を確認した。DNAフラグメントを、pZH2B(M.Kuroda氏よりご供与戴いた)にクローニングした。RNAi実験のために、312bp(SPW1)、300bp(OsMADS2)および58bp(OsMADS4)の遺伝子特異的DNAフラグメントを、コメユビキチン遺伝子プロモータおよびイネアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の第3イントロンを有するpZH2Bi(M.Kuroda氏よりご供与戴いた)にhead−to−headの方向でクローニングした。Oikawaら、Plant Mol.Biol.55,687−700(2004)に記載の方法に従って、ベクターを、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、ハイグロマイシンによる選択条件下でイネ胚盤由来のカルスに導入した。アリル特異的dCAPSマーカー(配列番号22および23)を用いて、spw1−clsまたはspw1−1のホモ接合カルスを選択した。
SPW1、OsMADS2およびOsMADS4の野生型または変異型(I45TまたはV45T)のMドメイン、IドメインおよびKドメインに対応するコード配列を、PfuUltra DNA polymerase(Stratagene)を使用して増幅し、配列を確認し、two−hybridベクターpAS2−1およびpACT2にサブクローニングした。酵母形質転換およびβ−ガラクトシダーゼ液体アッセイの全てを、酵母細胞を20℃でインキュベートした以外は、Wang,K.L.ら、Nature 428,945−950(2004)に記載の方法に従って行った。
図1aに、野生型形質を示す分離系統(左)およびspw1−cls(右)の外観を示し、閉花性を比較した。図1bに、穎の一部を切除したspw1−clsの米粒の発育過程を示した。矢印は未成熟な種を示し、矢頭は雄蕊を示す。これより、spw1−clsにおいては、雄蕊が穎の中に残っていることがわかる。
SPW1遺伝子の変異により閉花受粉性がもたらされる作用機序を知るために、SPW1遺伝子に関する形質転換植物の花の形態を解析した(図3)。図3は、SPW1遺伝子の機能欠失型突然変異体spw1−1の花器官構造(図3a)、RNAi法によりSPW1遺伝子の発現を強く抑制した系統の花器官構造(図3c)、RNAi法によりSPW1遺伝子の発現を弱く抑制した系統の花器官構造(図3d)を示す。
上述したように、閉花受粉性の原因遺伝子であることが同定されたSPW1は、高等植物において広く花弁(鱗被)および雄蕊の形態形成を制御することが知られている「クラスB MADSボックス遺伝子」の1つである。これらの遺伝子の産物であるクラスB MADSボックスタンパク質は、AP3型およびPI型の2種類のサブクラスに分類されAP3型サブクラスのタンパク質とPI型サブクラスのタンパク質とが形成したヘテロ二量体がDNAに結合し、形態形成に必要な遺伝子群の転写を活性化させることが知られている。SPW1は、イネにおける唯一のAP3型タンパク質であり、PI型タンパク質であるOsMADS2およびOsMADS4とヘテロ二量体を形成すると考えられている。そこで、spw1−cls変異によって生じるI45T型のSPW1タンパク質(SPW1I45T)において、2つのPI型タンパク質とのヘテロ二量体形成に変化が生じているか否かを、酵母two−hybrid法を用いて解析した。
Claims (10)
- 植物体に閉花受粉性を付与するポリペプチドであって、
(A)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(B)上記(A)のアミノ酸配列の第45位以外の1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを発現していることを特徴とする植物体。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを発現していることを特徴とする植物体。
- 閉花受粉性が付与された植物体を作製する方法であって、
(I)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子に対して、該タンパク質の第45位のアミノ酸をトレオニンに置換させる変異を誘導する工程;または
(II)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を植物体に導入する工程
を包含することを特徴とする方法。 - 請求項2に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体を作製するためのキット。
- 配列番号23に示される塩基配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 配列番号22に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号23に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含んでいることを特徴とするオリゴヌクレオチドセット。
- 請求項7に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項8に記載のオリゴヌクレオチドセットを目的の植物体由来のcDNAとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングする方法。
- 請求項7に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項8に記載のオリゴヌクレオチドセットを備えていることを特徴とする閉花受粉性が付与された植物体をスクリーニングするためのキット。
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